CN105861401B - 一株黄单胞菌nyw79及其用途 - Google Patents

一株黄单胞菌nyw79及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种黄单胞菌(Xanthomonas sp.)NYW79及其用途。使用NYW79菌株生产无色素黄原胶的步骤包括活化培养、液体种子培养、发酵培养与黄原胶沉淀等步骤。使用NYW79菌株生产黄原胶的产量比诱变出发NY07菌株提高14.9％以上；发酵液的OD值降低77.1％以上，由NYW79菌株生产黄原胶能够从根本上解决黄原胶产品的脱色问题，同时黄原胶多糖产量也非常显著提高。

Description

一株黄单胞菌NYW79及其用途
【技术领域】
本发明属于生物技术应用领域。更具体地，本发明涉及一株黄单胞菌(Xanthomonas sp.)NYW79，还涉及黄单胞菌NYW79的用途。
【背景技术】
黄原胶(xanthan gum)是野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)以碳水化合物为主要原料，经发酵产生的一种微生物胞外杂多糖，其分子由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸构成。黄原胶有许多独特的理化性能，主要表现在显著的假塑性、良好的增稠性、较好的乳化稳定性、低浓度时的高黏度、对固体悬浮能力强以及较宽的耐温性、耐冻融性、耐酸碱性等。它作为增稠剂、乳化剂、品质改良剂、悬浮剂广泛应用于食品工业，在食品添加剂中占据相当重要的位置。
黄单胞菌(Xanthomonas campestris)是革兰氏阴性菌，专性好氧，细胞直杆状，大小0.4～1.0μm×1.2～3.0μm，单端极生鞭毛，菌落圆形、光滑、全缘、乳脂状。在培养基上菌株分泌具有非类胡萝卜素性质的不溶于水的黄色素，其化学成分为溴芳基多烯，使菌落呈黄色，生长初期为淡黄色，后期为蜡黄色。它作为菌种生产荚膜多糖，即黄原胶。由于这种菌株分泌具有非类胡萝卜素性质的不溶于水的黄色素，因此在生产中需要使用足够量的溶剂脱去部分色素，但这种溶剂耗量大，操作费工费时，生产成本高，在生产中为了控制黄单胞菌色素形成，往往以缩短生长周期方式减少色素合成，这样又往往影响产品得率和产品质量。由于黄原胶发酵液粘度高，使后处理非常困难，其中去除菌体细胞色素是提取工艺中的一大障碍。因此，解决产品外观颜色的有效方法是降低黄单胞菌色素合成。
亚硝基胍作用方式主要是诱发GC-AT的转换，它能氧化脱去A、G和C的氨基，使A转变HX(次黄嘌呤)、C-转变U(尿嘧啶)、由于所形成的新碱基改变了原来碱基的性质，再复制时就会引起A:T→G:C的转换，G:C→A:T的转换而造成突变。亚硝基胍除了有较强的诱变作用外，还能诱发邻近位置基因的并发突变，而且特别容易诱发DNA复制叉附近的基因突变，随着复制叉的移动，它的作用位置也随着移动，某些诱变菌株可能会造成某些基因改变或者缺陷。
本发明针对黄原胶工业化生产的脱色技术问题，以传统的含有色素的黄单孢杆菌NY07为出发菌株，利用亚硝基胍诱变、筛出一株无色素的黄单孢杆菌菌株NYW79，并进一步研究了其在工业化发酵生产中的黄原胶生产能力，从根本上解决黄原胶产品的脱色问题。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一株黄单胞菌(Xanthomonas sp.)NYW79。
本发明的另一个目的是提供所述黄单胞菌(Xanthomonas sp.)NYW79的用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一株黄单胞菌(Xanthomonas sp.)NYW79，该菌株已于2016年06月16日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No 12620。
本发明还涉及所述的黄单胞菌NYW79在生产无色素黄原胶中的用途。
根据本发明的一种优选实施方式，生产无色素黄原胶的步骤如下：
A、活化培养
挑取一环斜面保藏黄单胞菌NYW79菌种接种到茄瓶斜面培养基中，在温度30℃下培养72h，斜面菌种奶白色，斜面菌苔颜色明显低于出发菌株颜色，得到活化黄单胞菌NYW79菌种；
B、液体种子培养
按照使用的种子培养基重量计1～3％，将步骤A得到的活化黄单胞菌NYW79菌种接种于种子培养基中，在摇床中在温度30℃下培养18小时，得到黄单胞菌NYW79菌种发酵液；
C、发酵培养
按照以使用的发酵培养基重量计4～10重量％，将步骤B)得到的黄单胞菌NYW79菌种发酵液接种于发酵培养基中，在温度32～33℃下发酵培养26小时，接着往所述的发酵培养基中添加淀粉作为碳源，在温度29～31℃下继续发酵培养27～48小时，然后在温度28℃下发酵培养直至发酵结束；
D、黄原胶沉淀
将步骤C得到的发酵液离心沉淀，往上清液中加入浓度为以体积计20％乙醇溶液按照体积比1：1.8～2.2混合均匀，再加入以发酵液体积计0.5％氯化钙溶液，在斩拌罐中处理20min，再离心分离，往得到的沉淀物中加入以其体积计30％乙醇，混合后加入无机碱液将其pH调节至7.50，接着用离心机进行固液分离，得到的沉淀物在温度85℃下烘干，得到所述的无色素黄原胶。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，所述的斜面培养基制备方法如下：将0.8～1.2重量份蔗糖、0.06～0.10重量份蛋白胨、0.08-0.12重量份酵母浸汁、0.4～0.6重量份牛肉膏、1～3重量份琼脂、0.1～0.3重量份K2HPO4·3H2O、0.08～0.12重量份NaCl与0.08～0.12重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的斜面培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述的种子培养基制备方法如下：0.8～1.2重量份葡萄糖、0.06～0.10重量份蛋白胨、0.08～0.12重量份酵母浸汁、0.4～0.6重量份牛肉膏、0.1～0.3重量份K2HPO4·3H2O、0.08～0.12重量份NaCl与0.08～0.12重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的种子培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的发酵培养基制备方法如下：0.6～1.0重量份葡萄糖、0.6～1.0重量份酵母粉、0.04～0.06重量份NH4NO3、0.01～0.03重量份K2HPO4·3H2O溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的发酵培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的无机酸是硝酸、硫酸或盐酸；所述的无机碱是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，淀粉添加量是所述发酵培养基重量的4～6％。
下面将更详细地描述本发明。
本发明通过改变传统菌株基因缺陷来改变菌种的生理特性，降低菌株合成色素能力，同时避免了基因工程改良菌种带来的外援DNA问题，在应用到医药、食品、日化等领域具有一定的安全性，从根本上解决了产品的脱色问题。
本发明涉及一株黄单胞菌(Xanthomonas sp.)NYW79，该菌株已于2016年06月16日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No 12620。
本发明具有色素缺陷型黄单胞菌NYW79菌株(Xanthomonas sp.NYW79)是利用亚硝基胍诱变由黄单胞菌NY07(Xanthomonas campestris NY07)出发菌株得到的，菌株分类命名为野油菜黄单胞菌NY07样本保藏于内蒙古自治区鄂尔多斯市达拉特旗三垧梁工业园区纬五路8号鄂尔多斯市中轩生化股份有限公司。
采用亚硝基胍诱变由NY07菌株诱变获得黄色素缺陷型黄单孢杆菌NYW79的步骤如下：
(1)菌种活化
按照以使用的种子培养基重量计1％的接种量，将在温度5℃下保存的NY07菌株接种在蛋白胨琼脂培养基上，在温度30℃下恒温培养72h，在斜面长出黄色菌体；
所述的蛋白胨琼脂培养基是采用下述方法制备得到的：
将10g蔗糖、5g蛋白胨、2g氯化钠、3g牛肉膏、0.5g酵母膏与20g琼脂溶于1000ml水中，再使用常见无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至7.0，然后在温度121℃下灭菌30min，得到所述的蛋白胨琼脂培养基。
(2)制备NY07菌株菌悬液
按照以使用的种子培养基重量计1％的接种量，把上述培养的NY07菌株接种在牛肉膏蛋白胨培养基中在温度30℃与摇床转速220rpm的条件下恒温培养18h，如此传代培养2次，澄清液体培养基变浑浊达到对数期(OD＝1.1-1.2)。
所述的牛肉膏蛋白胨培养基是采用下述方法制备得到的：
将10g葡萄糖、5g蛋白胨、2g氯化钠、3g牛肉膏与0.5g酵母膏溶于1000ml水中，再使用常见无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至7.0，然后在温度121℃下灭菌30min，得到所述的牛肉膏蛋白胨培养基。
(3)菌悬液制备
将步骤(2)得到的培养物进行离心分离，收集的菌体用浓度为以重量计0.85％的生理盐水洗涤两次，然后收集的菌体使用同样的生理盐水制成10-7cfu/ml菌悬液，菌落计数作为对照。
(4)亚硝基胍(NTG)诱变
亚硝基胍水溶液的配制：采用常规方法配制浓度为0.1g/ml的亚硝基胍水溶液，然后让其亚硝基胍水溶液经0.22μm膜过滤进行灭菌，接着置于温度5℃下保存。
往步骤(3)得到的菌悬液中加入灭菌的亚硝基胍水溶液，使其终浓度达到0.4mg/ml，接着在温度30℃与摇床转速200rpm的条件下分别处理50min、60min、70min、80min、90min、100min、110min，进行菌落平板计数测定菌数，并按照下式计算致死率：
亚硝基胍(NTG)诱变处理结果列于表1与附图3中：
表1：NTG诱变处理时间与致死率测定结果
往步骤(3)得到的菌悬液中分别加入0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml不同浓度NTG诱变处理，致死率结果参见附图3。
由附图1知道，经0.4mg/ml亚硝基胍诱变90min，该菌株的致死率达80％～90％，因此确定0.4mg/ml浓度为最佳诱变剂量。
本发明利用浓度为0.4-0.6mg/ml亚硝基胍诱变具有色素缺陷型黄单孢杆菌获得无色素的黄单孢杆菌菌株NYW79。亚硝基胍浓度对于控制色素缺陷型黄单胞菌起着非常重要的作用，当亚硝基胍浓度过低时，对控制平板上耐亚硝基胍菌落的数量不明显，当亚硝基胍浓度过高时，会抑制耐亚硝基胍菌落的生长。
经过诱变的菌株在温度30℃的条件下以1.0×10-7cfu/ml平板培养72h，目测挑取菌落白色、圆形、凸起、光滑湿润、黏连度高的菌落在蛋白胨琼脂固体培养基平板上反复划线纯化，挑取挑取109株突变株(NYW)。
(5)诱变菌株筛选
将挑选的109株诱变菌株在摇瓶发酵进行连续传代培养，每传一代都进行黄原胶合成测试与色度测试，观察其稳定性。
将诱变菌株在含有以重量计4％淀粉、0.50％大豆蛋白粉与0.2％CaCO3的发酵液在温度30℃与摇床转速220rpm的条件下培养72h，采用Brook field旋转粘度计，食品添加剂黄原胶GB13886-2007标准方法测定其粘度，采用100g发酵液沉淀物65℃干燥3小时标准方法测定得率，采用以蒸馏水为空白，扫描波长，波长调至最大透光率(500nm)，将发酵液在6000r/min离心15min去菌体，用分光光度计在此波长下测定上清液吸光度的方法测定色素指标，其测定结果列于下表2中。
表2：出发菌株与诱变菌株发酵液测定结果
表2的结果清楚地表明，在这些诱变菌株中，NYW79诱变菌株粘度、得率较高，而发酵液色素较低。
NYW79诱变菌株在同样条件下进行多次传代培养，其粘度、得率与色度测试结果列于表3中。
表3：NYW79诱变菌株遗传稳定性试验结果
由表3的结果可以清楚地知道，NYW79诱变菌株遗传稳定性良好，适宜于实际应用。筛选初始菌株为产胶能力强的菌株NY07，它的初始产胶能力为3.42(g)，折光度0.48(吸光度的标度是对数函数值越大被测物质颜色越深)。以0.4g/L亚硝基胍处理90min诱变三次，得到一株NYW79诱变菌株，它的产胶能力为3.94(g)，折光度0.11。色素合成能力减弱或者称为缺失，胶体合成能力提高14.9％，无色素黄原胶。
(6)NYW79菌株的低温冷冻真空保存
按照1％的接种量，将最终筛选出的NYW79菌株接种到蛋白胨培养基中，在温度30℃下培养18h，离心分离，收集菌体，这种菌体用PBS缓冲液洗涤两次，加入冻干燥保护剂在低温下冻干保存。
NYW79菌株的形态学特征：革兰氏阴性菌，专性好氧，细胞直杆状,大小0.4～1.0μm×1.2～3.0μm，单端极生鞭毛，菌株形成孢外荚膜多糖--黄原胶。菌落圆形、光滑、全缘、乳脂状，奶白色。
NYW79菌株的培养特性：在HE琼脂培养基30℃下培养72h，斜面菌种奶白色，在葡萄糖、蛋白胨、酵母浸汁、牛肉膏、K2HPO4·3H2O、NaClMgSO4的种子培养基中菌种生长18h达到对数生长期，该培养基利于菌体生长。在葡萄糖、酵母粉、NH4NO3、K2HPO4·3H2O、淀粉的发酵培养基中菌体生长荚膜。
NYW79菌株的代谢特性：该菌为有机化能异养菌，专性好氧最适温度28-32℃，在温度7℃以下无一能生长，在温度40℃以上也无一能生长，菌体生长后期有胶体产生，菌体在培养基中为奶白色，在培养基上菌株不合成非类胡萝卜素性质不溶于水的黄色素。
本发明还涉及所述的黄单胞菌NYW79在生产无色素黄原胶中的用途。
根据本发明，生产无色素黄原胶的步骤如下：
A、活化培养
挑取一环斜面保藏黄单胞菌NYW79菌种接种到茄瓶斜面培养基中，在温度30℃下培养72h，斜面菌种奶白色，斜面菌苔颜色明显低于出发菌株颜色，得到活化黄单胞菌NYW79菌种。
所述的斜面培养基是采用下述方法制备得到的：将0.8～1.2重量份蔗糖、0.06～0.10重量份蛋白胨、0.08-0.12重量份酵母浸汁、0.4～0.6重量份牛肉膏、1～3重量份琼脂、0.1～0.3重量份K2HPO4·3H2O、0.08～0.12重量份NaCl与0.08～0.12重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的斜面培养基。
所述的无机酸是硝酸、硫酸或盐酸；所述的无机碱是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾。
在本发明中，所述无机酸或无机碱水溶液的浓度并不十分关键，这个浓度通常是0.1～0.5mol/L。
在这个步骤中斜面培养使用的设备是微生物培养通常使用的设备，例如由山东潍坊精鹰医疗器戒有限公司以商品名电热恒温培养箱销售的恒温控制产品。
B、液体种子培养
按照以使用的种子培养基重量计1～3％，将步骤A得到的活化黄单胞菌NYW79菌种接种于种子培养基中，在摇床中在温度30℃下培养18小时，得到黄单胞菌NYW79菌种发酵液。
所述的种子培养基是采用下述方法制备得到的：0.8～1.2重量份葡萄糖、0.06～0.10重量份蛋白胨、0.08～0.12重量份酵母浸汁、0.4～0.6重量份牛肉膏、0.1～0.3重量份K2HPO4·3H2O、0.08～0.12重量份NaCl与0.08～0.12重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的种子培养基。
有关无机酸或无机碱水溶液的情况已在前面描述过，在此不再赘述。
在这个步骤中种子培养使用的设备是微生物培养通常使用的设备，例如由上海世平实验设备有限公司以商品名恒温摇床销售的恒温控制摇床产品。
C、发酵培养
按照以使用的发酵培养基重量计4～10重量％，将步骤B)得到的黄单胞菌NYW79菌种发酵液接种于发酵培养基中，在温度32～33℃下发酵培养26小时，接着往所述的发酵培养基中添加淀粉作为碳源，在温度29～31℃下继续发酵培养27～48小时，然后在温度28℃下发酵培养直至发酵结束；
所述的发酵培养基是采用下述方法制备得到的：0.6～1.0重量份葡萄糖、0.6～1.0重量份酵母粉、0.04～0.06重量份NH4NO3、0.01～0.03重量份K2HPO4·3H2O溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的发酵培养基。
在这个步骤中，淀粉添加量是所述发酵培养基重量的4～6％。
有关无机酸或无机碱水溶液的情况已在前面描述过，在此不再赘述。
在这个步骤中发酵培养使用的设备是微生物培养通常使用的设备，例如由江苏丰泽生物工程设备制造有限公司以商品名全自动发酵罐销售的全自动发酵控制产品。
D、黄原胶沉淀
将步骤C得到的发酵液使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器销售的离心机在转速6000r/min的条件下离心分离15min，往得到的上清液中与浓度为以体积计20％乙醇溶液按照体积比1：1.8～2.2混合均匀，再加入以发酵液体积计0.5％氯化钙溶液，在斩拌罐中处理20min，再使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器的离心机在转速6000r/min的条件下离心分离15min，往得到的沉淀中加入以其体积计30％乙醇，混合后加入0.1mol/L氢氧化钠水溶液将其pH调节至7.50，接着使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器销售的离心机进行固液分离，得到的沉淀物在温度85℃下烘干至恒重，得到的产物采用本说明书描述的方法分析确定，它是无色素黄原胶。
在这个步骤中，添加20％乙醇溶液的主要作用在于使黄原胶初步形成絮状沉淀。如果发酵液与20％乙醇溶液的体积比大于1：1.8，如果搅拌的速度慢易形成包水块状物，影响产品溶解；如果发酵液与20％乙醇溶液的体积比小于1：2.2，则不利于黄原胶形成絮状沉淀析出；因此，发酵液与20％乙醇溶液的体积比为1：1.8～2.2是合理的。
在这个步骤中，添加0.5％氯化钙溶液的主要作用在于黄原胶与氯化钙形成黄原胶钙凝胶状沉淀。本法与溶剂法相比，溶剂的耗用量较少，酒精用量减少一半，但在成品中带入了钙离子，成品颜色略灰，用酸调节可以减少钙离子带入产品，由于本产品不形成色素，用少量酒精提出产品颜色浅，同时提高了产品的提取收率在97％左右。
在这个步骤中，往得到的沉淀中添加30％乙醇的主要目的是使黄原胶脱水彻底，利于黄原胶沉淀进行烘干。
有关无机碱液的情况已在前面描述过，在此不再赘述。
将发酵液在转速6000r/min的条件下离心分离15min，往得到的沉淀中加以其体积计30％乙醇，剧烈振荡处理，离心分离，得到黄原胶多糖沉淀，让这种沉淀在温度85℃下烘干至恒重，得到无色素黄原胶多糖产物。
该多糖产物采用红外光谱与核磁共振谱分析技术确定它是无色素黄原胶。
根据GB 50093-2010食品安全国家标准食品中水分的测定，所述发酵液多糖含量达到39.40g/L，出发菌株NY07为34.28g/L，NYW79菌株的黄原胶多糖产量比出发菌株NY07提高14.9％。
发酵液颜色和吸光度测定。由NYW79菌株得到的发酵液在发酵时间0h至72h内均为乳白色，而由出发菌株NY07得到的发酵液在发酵时间0h至72h内颜色逐渐加深，直观对比，本发明得到的发酵液色素含量明显降低。
将发酵液在转速6000r/min的条件下离心分离15min，分离菌体，得到的上清液使用分光光度计以蒸馏水为空白测定在500nm波长处的吸光度。
使用分光光度计测定，NYW79菌株发酵液的OD值为0.11，而出发菌株NY07发酵液的OD值为0.48，因此本发明发酵液的OD值降低77.1％。
[有益效果]
本发明的有益效果是：本发明以传统的含有色素的黄单孢杆菌NY07为出发菌株，利用亚硝基胍诱变、筛出一株无色素的黄单孢杆菌菌株NYW79。使用NYW79菌株生产黄原胶的产量比诱变出发NY07菌株提高14.9％以上；发酵液的OD值降低77.1％以上，由此可见，由NYW79菌株生产黄原胶能够从根本上解决黄原胶产品的脱色问题，同时黄原胶多糖产量也非常显著提高。
黄色素缺陷型黄单胞菌(Xanthomonas sp.)NYW79菌株已于2016年06月16日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No12620。
【附图说明】
图1是实施例1-3与对比实施例1-3实施得率结果图。
图2是实施例1-3与对比实施例1-3实施OD值结果图。
图3是NTG诱变对致死率影响的示意图。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度的“％”均为重量百分比；“份”均为重量份。
实施例1：使用NYW79菌株生产无色素黄原胶
该实施例的实施步骤如下
A、活化培养
所述的斜面培养基制备方法如下：将0.8重量份蔗糖、0.06重量份蛋白胨、0.10重量份酵母浸汁、0.4重量份牛肉膏、1重量份琼脂、0.2重量份K2HPO4·3H2O、0.08重量份NaCl与0.08重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用0.1mol/L硝酸或氢氧化钠水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的斜面培养基。
挑取一环斜面保藏黄单胞菌NYW79菌种接种到茄瓶斜面培养基中，在山东潍坊精鹰医疗器戒有限公司以商品名电热恒温培养箱销售的设备中在温度30℃下培养72h，斜面菌种奶白色，斜面菌苔颜色明显低于出发菌株颜色，得到活化黄单胞菌NYW79菌种；
B、液体种子培养
所述的种子培养基制备方法如下：1.0重量份葡萄糖、0.06重量份蛋白胨、0.08重量份酵母浸汁、0.5重量份牛肉膏、0.1重量份K2HPO4·3H2O、0.08重量份NaCl与0.10重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用0.1mol/L硝酸或氢氧化钠水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的种子培养基。
按照以使用的种子培养基重量计1％，将步骤A得到的活化黄单胞菌NYW79菌种接种于种子培养基中，在上海世平实验设备有限公司以商品名恒温摇床销售的设备中在温度30℃下培养18小时，得到黄单胞菌NYW79菌种发酵液；
C、发酵培养
所述的发酵培养基制备方法如下：0.6重量份葡萄糖、0.6重量份酵母粉、0.05重量份NH4NO3、0.01重量份K2HPO4·3H2O溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用0.1mol/L硝酸或氢氧化钠水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的发酵培养基。
按照以使用的发酵培养基重量计7重量％，将步骤B)得到的黄单胞菌NYW79菌种发酵液接种于发酵培养基中，在江苏丰泽生物工程设备制造有限公司以商品名全自动发酵罐销售的设备中在温度32℃下发酵培养26小时，接着往所述的发酵培养基中添加所述发酵培养基重量的4％的淀粉作为碳源，在温度29℃下继续发酵培养34小时，然后在温度28℃下发酵培养直至发酵结束；
采用100g发酵液沉淀物在温度105℃下干燥3小时标准方法测定得率的标准方法测定，得到的发酵液多糖含量是39.40g/L；采用本说明书描述的方法测定所述发酵液的OD值为0.11。这些结果列于附图1-2中。
D、黄原胶沉淀
将步骤C得到的发酵液使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器销售的离心机在转速6000r/min的条件下离心分离15min，得到的上清液与浓度为以体积计20％乙醇溶液按照体积比1：1.8混合均匀，再加入以发酵液体积计0.5％氯化钙溶液，在斩拌罐中处理20min，再使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器的离心机在转速6000r/min的条件下离心分离15min，往得到的沉淀中加入以其体积计30％乙醇，混合后加入0.1N氢氧化钠水溶液将其pH调节至7.50，接着用使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器销售的离心机进行固液分离，得到的沉淀物在温度85℃下烘干至恒重，得到的产物采用本说明书描述的方法分析确定，它是无色素黄原胶。
实施例2：使用NYW79菌株生产无色素黄原胶
该实施例的实施步骤如下
A、活化培养
所述的斜面培养基制备方法如下：将1.0重量份蔗糖、0.10重量份蛋白胨、0.08重量份酵母浸汁、0.5重量份牛肉膏、3重量份琼脂、0.1重量份K2HPO4·3H2O、0.10重量份NaCl与0.12重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用0.5mol/L硫酸或氢氧化钾水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的斜面培养基。
挑取一环斜面保藏黄单胞菌NYW79菌种接种到茄瓶斜面培养基中，在山东潍坊精鹰医疗器戒有限公司以商品名电热恒温培养箱销售的设备中在温度30℃下培养72h，斜面菌种奶白色，斜面菌苔颜色明显低于出发菌株颜色，得到活化黄单胞菌NYW79菌种；
B、液体种子培养
所述的种子培养基制备方法如下：0.8重量份葡萄糖、0.8重量份蛋白胨、0.12重量份酵母浸汁、0.4重量份牛肉膏、0.2重量份K2HPO4·3H2O、0.12重量份NaCl与0.08重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用0.5mol/L硫酸或氢氧化钾水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的种子培养基。
按照以使用的种子培养基重量计3％，将步骤A得到的活化黄单胞菌NYW79菌种接种于种子培养基中，在上海世平实验设备有限公司以商品名恒温摇床销售的设备中在温度30℃下培养18小时，得到黄单胞菌NYW79菌种发酵液；
C、发酵培养
所述的发酵培养基制备方法如下：1.0重量份葡萄糖、1.0重量份酵母粉、0.04重量份NH4NO3、0.02重量份K2HPO4·3H2O溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用0.5mol/L硫酸或氢氧化钾水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的发酵培养基。
按照以使用的发酵培养基重量计4重量％，将步骤B)得到的黄单胞菌NYW79菌种发酵液接种于发酵培养基中，在江苏丰泽生物工程设备制造有限公司以商品名全自动发酵罐销售的设备中在温度33℃下发酵培养26小时，接着往所述的发酵培养基中添加所述发酵培养基重量的6％的淀粉作为碳源，在温度30℃下继续发酵培养27小时，然后在温度28℃下发酵培养直至发酵结束；
得到的发酵液参照采用国际标准ISO1026-1982标准方法测定多糖含量是41.6g/L；采用本说明书描述的方法测定所述发酵液的OD值0.11。这些结果列于附图1-2中。
D、黄原胶沉淀
将步骤C得到的发酵液使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器销售的离心机在转速6000r/min的条件下离心分离15min，得到的上清液与浓度为以体积计20％乙醇溶液按照体积比1：1.8混合均匀，再加入以发酵液体积计0.5％氯化钙溶液，在斩拌罐中处理20min，再使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器的离心机在转速6000r/min的条件下离心分离15min，往得到的沉淀中加入以其体积计30％乙醇，混合后加入0.1N氢氧化钠水溶液将其pH调节至7.50，接着用使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器销售的离心机进行固液分离，得到的沉淀物在温度85℃下烘干至恒重，得到的产物采用本说明书描述的方法分析确定，它是无色素黄原胶。
实施例3：使用NYW79菌株生产无色素黄原胶
该实施例的实施步骤如下
A、活化培养
所述的斜面培养基制备方法如下：将1.2重量份蔗糖、0.08重量份蛋白胨、0.12重量份酵母浸汁、0.6重量份牛肉膏、2重量份琼脂、0.3重量份K2HPO4·3H2O、0.12重量份NaCl与0.10重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用0.3mol/L盐酸或碳酸钠水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的斜面培养基。
挑取一环斜面保藏黄单胞菌NYW79菌种接种到茄瓶斜面培养基中，在山东潍坊精鹰医疗器戒有限公司以商品名电热恒温培养箱销售的设备中在温度30℃下培养72h，斜面菌种奶白色，斜面菌苔颜色明显低于出发菌株颜色，得到活化黄单胞菌NYW79菌种；
B、液体种子培养
所述的种子培养基制备方法如下：1.2重量份葡萄糖、0.10重量份蛋白胨、0.10重量份酵母浸汁、0.6重量份牛肉膏、0.3重量份K2HPO4·3H2O、0.10重量份NaCl与0.12重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用0.3mol/L盐酸碳酸钠溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的种子培养基。
按照以使用的种子培养基重量计2％，将步骤A得到的活化黄单胞菌NYW79菌种接种于种子培养基中，在上海世平实验设备有限公司以商品名恒温摇床销售的设备中在温度30℃下培养18小时，得到黄单胞菌NYW79菌种发酵液；
C、发酵培养
所述的发酵培养基制备方法如下：0.8重量份葡萄糖、0.8重量份酵母粉、0.06重量份NH4NO3、0.03重量份K2HPO4·3H2O溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用0.3mol/L盐酸或碳酸钠水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的发酵培养基。
按照以使用的发酵培养基重量计10重量％，将步骤B)得到的黄单胞菌NYW79菌种发酵液接种于发酵培养基中，在江苏丰泽生物工程设备制造有限公司以商品名全自动发酵罐销售的设备中在温度32℃下发酵培养26小时，接着往所述的发酵培养基中添加所述发酵培养基重量的5％的淀粉作为碳源，在温度31℃下继续发酵培养48小时，然后在温度28℃下发酵培养直至发酵结束；
得到的发酵液根据参照采用国际标准ISO1026-1982标准方法测定多糖含量是40.02g/L；采用本说明书描述的方法测定所述发酵液的OD值为0.10。这些结果列于附图1-2中。
D、黄原胶沉淀
将步骤C得到的发酵液使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器销售的离心机在转速6000r/min的条件下离心分离15min，得到的上清液与浓度为以体积计20％乙醇溶液按照体积比1：1.8混合均匀，再加入以发酵液体积计0.5％氯化钙溶液，在斩拌罐中处理20min，再使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器的离心机在转速6000r/min的条件下离心分离15min，往得到的沉淀中加入以其体积计30％乙醇，混合后加入0.1N氢氧化钠水溶液将其pH调节至7.50，接着用使用金坛市医疗仪器公司以商品名离心沉淀器销售的离心机进行固液分离，得到的沉淀物在温度85℃下烘干至恒重，得到的产物采用本说明书描述的方法分析确定，它是无色素黄原胶。
对比实施例1：使用出发NY07菌株生产黄原胶
按照与实施例1相同的实施方式进行，只是本对比实施例使用出发NY07菌株生产黄原胶，得到的发酵液根据参照采用国际标准ISO1026-1982标准方法测定多糖含量是34.28g/L；采用本说明书描述的方法测定所述发酵液的OD值为0.48。这些结果列于附图1-2中。
与本对比实施例1相比，实施例1的黄原胶多糖产量提高14.9％；实施例1发酵液的OD值降低77.1％。
对比实施例2：使用出发NY07菌株生产黄原胶
按照与实施例2相同的实施方式进行，只是本对比实施例使用出发NY07菌株生产黄原胶，得到的发酵液根据参照采用国际标准ISO1026-1982标准方法测定多糖含量是33.6g/L；采用本说明书描述的方法测定所述发酵液的OD值为0.51。这些结果列于附图1-2中。
与本对比实施例2相比，实施例1的黄原胶多糖产量提高17.2％；实施例2发酵液的OD值降低78.4％。
对比实施例3：使用出发NY07菌株生产黄原胶
按照与实施例3相同的实施方式进行，只是本对比实施例使用出发NY07菌株生产黄原胶，得到的发酵液根据参照采用国际标准ISO1026-1982标准方法测定多糖含量是32.6g/L；采用本说明书描述的方法测定所述发酵液的OD值为0.50。这些结果列于附图1-2中。
与本对比实施例3相比，实施例1的黄原胶多糖产量提高20.9％；实施例1发酵液的OD值降低78％。
上述实施例与对比实施例的实施结果表明，使用由本发明诱变方法得到的NYW79菌株生产黄原胶的产量比诱变出发NY07菌株提高14.9％以上；发酵液的OD值降低77.1％以上，由此可见，由NYW79菌株生产黄原胶能够从根本上解决黄原胶产品的脱色问题，同时黄原胶多糖产量也非常显著提高。

Claims (6)

1.由一株黄色素缺陷型黄单胞菌(Xanthomonas sp.)NYW79生产无色素黄原胶的方法，其特征在于该生产方法的步骤如下：该菌株已于2016年06月16日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 12620；
A、活化培养
挑取一环斜面保藏黄单胞菌NYW79菌种接种到茄瓶斜面培养基中，在温度30℃下培养72h，斜面菌种奶白色，斜面菌苔颜色明显低于出发菌株颜色，得到活化黄单胞菌NYW79菌种；
B、液体种子培养
按照以使用的种子培养基重量计1～3％，将步骤A得到的活化黄单胞菌NYW79菌种接种于种子培养基中，在摇床中以温度30℃下培养18小时，得到黄单胞菌NYW79菌种液；
C、发酵培养
按照以使用的发酵培养基重量计4～10重量％，将步骤B)得到的黄单胞菌NYW79菌种液接种于发酵培养基中，在温度32～33℃下发酵培养26小时，接着往所述的发酵培养基中添加淀粉作为碳源，在温度29～31℃下继续发酵培养27～48小时，然后在温度28℃下发酵培养直至发酵结束；
D、黄原胶沉淀
将步骤C得到的发酵液离心分离沉淀菌体，往上清液中加入浓度为以体积计20％乙醇溶液按照体积比1：1.8～2.2混合均匀，再加入以发酵液体积计0.5％氯化钙溶液，在斩拌罐中处理20min，再离心分离，往得到的沉淀物中加入以其体积计30％乙醇，混合后加入无机碱液将其pH调节至7.50，接着用离心机进行固液分离，得到的沉淀物在温度85℃下烘干，得到所述的无色素黄原胶。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于在步骤A中，所述的斜面培养基制备方法如下：将0.8～1.2重量份蔗糖、0.06～0.10重量份蛋白胨、0.08-0.12重量份酵母浸汁、0.4～0.6重量份牛肉膏、1～3重量份琼脂、0.1～0.3重量份K2HPO4·3H2O、0.08～0.12重量份NaCl与0.08～0.12重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30min，得到所述的斜面培养基。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于在步骤B中，所述的种子培养基制备方法如下：0.8～1.2重量份葡萄糖、0.06～0.10重量份蛋白胨、0.08～0.12重量份酵母浸汁、0.4～0.6重量份牛肉膏、0.1～0.3重量份K2HPO4·3H2O、0.08～0.12重量份NaCl与0.08～0.12重量份MgSO4溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的种子液体培养基。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于在步骤C中，所述的发酵培养基制备方法如下：0.6～1.0重量份葡萄糖、0.6～1.0重量份酵母粉、0.04～0.06重量份NH4NO3、0.01～0.03重量份K2HPO4·3H2O溶于100重量份水中，搅拌均匀，再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节到7.0，再在温度121℃下灭菌30分钟，得到所述的发酵培养基。
5.根据权利要求2～4中任一项权利要求所述的生产方法，其特征在于所述的无机酸是硝酸、硫酸或盐酸；所述的无机碱是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于在步骤C中，淀粉添加量是所述发酵培养基重量的4～6％。
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