CN117587083A - 一种黄原胶的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄原胶的发酵方法，涉及微生物发酵技术领域，该方法对野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris进行菌种活化，之后进行液体种子培养，再将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶。本发明所采用的菌种活化方法能有效节省菌种活化时间，并保持Xanthomonas campestris的菌种活性，有利于后续的发酵生产；本发明的液体种子培养方法，能使液体种子中Xanthomonas campestris菌种纯度较高，菌种密度较大，菌活力较高，总量和浓度能够最大程度上满足发酵要求，移种至发酵培养基后，菌种能够迅速生长；本发明方法能低成本且高效的发酵生产黄原胶。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体而言，涉及一种黄原胶的发酵方法。
背景技术
黄原胶(Xanthan gum)是一种由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)以碳水化合物为主要原料经好氧发酵产生的一种水溶性微生物胞外多糖，又称黄胶、汉生胶，是目前世界上生产规模最大的微生物多糖。黄原胶由糖类经黄单胞菌好氧发酵，切断1,6-糖苷键，打开支链后，按1,4-键合成直链组成的一种酸性胞外杂多糖。黄原胶由于其大分子特殊结构和胶体特性，具有优良的理化特性，例如悬浮性、乳化性、增稠性、假塑性、热稳定性等，可作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、凝胶剂、浸润剂、膜成型剂等广泛应用于各个领域，是性能最为优越的生物胶之一。黄原胶拥有许多特性，例如：1、水溶性：黄原胶在水中能够快速溶解，拥有极强的亲水性；2、稳定性：黄原胶溶液的黏度不会随着温度的变化而发生很大的变化，胶分子在20-80℃的水溶液环境中几乎不会发生任何构象变化，黏度稳定，即便在低浓度的水溶液下也能显示出稳定的高粘度；3、悬浮性：黄原胶对不溶性固体和油滴具有良好的悬浮作用，胶分子在溶液中能够形成超结合带状的螺旋共聚体，构成脆弱的类似胶的网状结构，所以能够支持固体颗粒、液滴和气泡的形态，显示出很强的乳化稳定作用和高悬浮能力；4、假塑性：黄原胶水溶液在静态或低的剪切作用下具有高粘度，在高剪切作用下表现为粘度急剧下降，但分子结构不变。而当剪切力消除时，则立即恢复原有的粘度，是一种高效的增稠剂。
在工业生产中，利用野油菜黄单胞菌进行有氧发酵，发酵结束后，先通过离心过滤去除细胞，再使用与水混溶的异丙酮、乙醇或丙酮进一步沉淀，并调节pH至中性，沉淀后进行脱水和干燥，最终获得黄原胶产物。黄原胶的生产受反应器类型、培养基成分、发酵条件和发酵菌种的影响。
在发酵生产中，碳源的选择以及C/N比对发酵速度、发酵周期有重要的影响，从对数生长期开始，采用较高的C/N比能够促进黄原胶的合成。在传统的培养基配方中通常选择葡萄糖作为碳源，牛肉膏或酵母提取粉作为氮源，生产成本较高，发酵产率也未见显著提高。
发明内容
为解决黄原胶发酵培养基成本较高和产胶率较低的问题，本发明提供了一种黄原胶的发酵方法。
本发明采取的技术方案如下：
一种黄原胶的发酵方法，对野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris进行菌种活化，之后进行液体种子培养，再将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶。
其中，菌种活化的方法包括：将装有野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的冻干管在超净台中用75％酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将冻干管的顶端在酒精灯外焰处均匀加热，滴入2滴无菌蒸馏水于加热部位使管壁破裂，用镊子敲下破裂处，用吸管吸取0.5ml液体种子培养基于冻干管中将冻干菌粉全部溶解，溶解后的菌悬液转移至装有4ml液体种子培养基的液体试管中混匀，将残余在吸管中1滴菌悬液转接至斜面试管中的固体培养基上，将液体试管和斜面试管置于培养箱静置培养，直至菌液浑浊或斜面上长出菌落；然后将液体试管中培养的菌液按1％接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养72h，进行传代2次，使其恢复活性。能有效节省菌种活化时间，并保持Xanthomonas campestris的菌种活性，有利于后续的发酵生产。
液体种子培养基按重量百分比包括玉米淀粉1％、工业硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.3％，且pH值为7.0；经过菌种活化的菌液按照1％接种量接种到装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养24h，即完成液体种子培养。在该条件下的液体种子中Xanthomonas campestris菌种纯度较高，菌种密度较大，菌活力较高，总量和浓度能够最大程度上满足发酵要求，移种至发酵培养基后，菌种能够迅速生长。
在本发明的一较佳实施方式中，将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法包括：将液体种子以5％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。在该稀释倍数下有利于黄原胶成品的收率，不会对无水乙醇使用量造成过量负担，同时有利于黄原胶产品的成色。
发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉4.0％、工业硫酸铵1.0％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％和磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0。利用玉米淀粉和工业硫酸铵进行发酵，既可以保持较高的生产率和产胶量，同时工业硫酸铵作为价格低廉的工业原料，远低于胰蛋白胨和玉米浆的价格，降低生产成本，有利于工业化的生产。
在本发明的一较佳实施方式中，将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法包括：将液体种子以5％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。在该稀释倍数下有利于黄原胶成品的收率，不会对无水乙醇使用量造成过量负担，同时有利于黄原胶产品的成色。
发酵培养基pH值为7.0，且包括玉米淀粉、工业硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾；其中，工业硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的重量百分比分别为1.0％、0.3％、0.1％和0.1％，玉米淀粉的重量百分比为4.0％，或5.0％，或6.0％，或7.0％，或8.0％。适当的碳源浓度能够刺激Xanthomonas campestris菌种生长，满足营养需求，有利于菌种生长和黄原胶合成。
在本发明的一较佳实施方式中，将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法包括：将液体种子以5％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。在该稀释倍数下有利于黄原胶成品的收率，不会对无水乙醇使用量造成过量负担，同时有利于黄原胶产品的成色。
发酵培养基pH值为7.0，且包括玉米淀粉、工业硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾；其中，玉米淀粉、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的重量百分比分别为5.0％、0.3％、0.1％和0.1％，工业硫酸铵的重量百分比为0.5％，或1.0％，或1.5％，或2.0％，或2.5％。氮源浓度对黄原胶合成速率、胶浓度、产胶得率都有重要影响，适当的氮源浓度能够刺激细胞壁向外分泌黄原胶，有利于提高黄原胶的产量。
在本发明的一较佳实施方式中，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0；
将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法包括：将液体种子以5％，或10％，或15％，或20％，或25％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。适当的接种量有利于提高黄原胶的产胶率，高浓度菌液随着发酵的进行，发酵液的黏度不断增大，体积传质系数降低，造成供氧能力逐渐下降，合成速率变慢，产率降低。
在本发明的一较佳实施方式中，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0；
将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法包括：将液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养48h，或72h，或96h，或120h，或144h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。过长的发酵时间使黄原胶产率下降，发酵培养基中的碳源被利用完全，Xanthomonascampestris为了生存便将黄原胶作为新的碳源加以利用，产胶率会呈现下降趋势，选择最适发酵时间有利于产胶率的提高。
在本发明的一较佳实施方式中，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0；
将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法包括：将液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，在25℃，或30℃，或35℃，或40℃，或50的温度条件下，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。较高的温度可提高黄原胶的产量，对黄原胶产品的丙酮酸含量也有一定影响；发酵前期和中期温度过高会导致细胞快速衰老，进入发酵后期，细胞活力降低，碳源消耗量变慢，黄原胶生成速率减慢。但发酵温度过低会使菌种生长速度变慢，发酵周期延长，细胞代谢缓慢，产胶率降低。因此合适的发酵温度有利于提高黄原胶产量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明所采用的菌种活化方法能有效节省菌种活化时间，并保持Xanthomonascampestris的菌种活性，有利于后续的发酵生产；
本发明的液体种子培养方法，能使液体种子中Xanthomonas campestris菌种纯度较高，菌种密度较大，菌活力较高，总量和浓度能够最大程度上满足发酵要求，移种至发酵培养基后，菌种能够迅速生长；
本发明能低成本且高效的发酵生产黄原胶。
为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举本发明实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是实施例1中野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的不同传代次数对应的产胶率条形图；
图2是实施例2中不同玉米淀粉含量的发酵培养基对应的产胶率条形图；
图3是实施例3中不同工业硫酸铵含量的发酵培养基对应的产胶率条形图；
图4是实施例4中不同接种量对应的产胶率条形图；
图5是实施例5中不同发酵时间对应的产胶率条形图；
图6是实施例6中不同发酵温度对应的产胶率条形图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明提供了一种黄原胶的发酵方法，包括对野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris进行菌种活化，之后进行液体种子培养，再将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶。
实验菌种以野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris作为出发菌株，该菌株在平板培养基上呈圆润光滑的浅白色菌落，细胞为细杆状，革兰氏阴性菌，为植物致病菌。
下面提供六个实施例和六个对比例，以说明本发明方法能降低黄原胶生产成本并提高产胶率。
实施例1
1)菌种活化
将装有野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的冻干管在超净台中用75％酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将冻干管的顶端在酒精灯外焰处均匀加热，滴入2滴无菌蒸馏水于加热部位使管壁破裂，用镊子敲下破裂处，用吸管吸取0.5ml液体种子培养基于冻干管中将冻干菌粉全部溶解，溶解后的菌悬液转移至装有4ml液体种子培养基的液体试管中混匀，将残余在吸管中1滴菌悬液转接至斜面试管中的固体培养基上，将液体试管和斜面试管置于培养箱静置培养，直至菌液浑浊或斜面上长出菌落；然后将液体试管中培养的菌液按1％接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养72h，进行传代，使其恢复活性。
其中，共得到六组菌种活化后的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的菌液，各组的传代次数分别为2代、4代、6代、8代、10代和12代。
2)液体种子培养
所采用的液体种子培养基按重量百分比包括玉米淀粉1％、工业硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.3％，且pH值为7.0。
按1％接种量将菌种活化后的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的菌液接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养24h，完成液体种子培养，需要说明的是，需确保液体种子的OD600值为0.8，即生长至对数期，在本实施例中，经过24h培养后即达到该条件。
基于六组菌种活化后的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的菌液，对应完成六组液体种子的培养。
3)黄原胶的提取
获取发酵培养基，其中，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉4.0％、工业硫酸铵1.0％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％和磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0。
将液体种子以5％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。
基于六组液体种子，对应得到六组发酵产物黄原胶。
4)计算产胶率
将黄原胶的质量除以发酵液的质量，即为黄原胶的产胶率。
野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的不同传代次数对应的产胶率条形图如图1所示。
实施例2
1)菌种活化
将装有野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的冻干管在超净台中用75％酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将冻干管的顶端在酒精灯外焰处均匀加热，滴入2滴无菌蒸馏水于加热部位使管壁破裂，用镊子敲下破裂处，用吸管吸取0.5ml液体种子培养基于冻干管中将冻干菌粉全部溶解，溶解后的菌悬液转移至装有4ml液体种子培养基的液体试管中混匀，将残余在吸管中1滴菌悬液转接至斜面试管中的固体培养基上，将液体试管和斜面试管置于培养箱静置培养，直至菌液浑浊或斜面上长出菌落；然后将液体试管中培养的菌液按1％接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养72h，进行传代2次，使其恢复活性。
2)液体种子培养
所采用的液体种子培养基按重量百分比包括玉米淀粉1％、工业硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.3％，且pH值为7.0。
按1％接种量将菌种活化后的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的菌液接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养24h，完成液体种子培养，需要说明的是，需确保液体种子的OD600值为0.8，即生长至对数期，在本实施例中，经过24h培养后即达到该条件。
3)玉米淀粉含量优化及黄原胶的提取
获取五组发酵培养基，其中，发酵培养基pH值为7.0，且包括玉米淀粉、工业硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。其中，工业硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的重量百分比分别为1.0％、0.3％、0.1％和0.1％。五组发酵培养基中的玉米淀粉重量百分比分别为4.0％、5.0％、6.0％、7.0％和8.0％。
基于各组发酵培养基进行黄原胶的提取，每组提取黄原胶的过程均包括：将液体种子以5％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎。
共对应得到五组发酵产物黄原胶，对各组黄原胶进行称重。
4)计算产胶率
将黄原胶的质量除以发酵液的质量，即为黄原胶的产胶率。
不同玉米淀粉含量的发酵培养基对应的产胶率条形图，如图2所示。
实施例3
1)菌种活化
将装有野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的冻干管在超净台中用75％酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将冻干管的顶端在酒精灯外焰处均匀加热，滴入2滴无菌蒸馏水于加热部位使管壁破裂，用镊子敲下破裂处，用吸管吸取0.5ml液体种子培养基于冻干管中将冻干菌粉全部溶解，溶解后的菌悬液转移至装有4ml液体种子培养基的液体试管中混匀，将残余在吸管中1滴菌悬液转接至斜面试管中的固体培养基上，将液体试管和斜面试管置于培养箱静置培养，直至菌液浑浊或斜面上长出菌落；然后将液体试管中培养的菌液按1％接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养72h，进行传代2次，使其恢复活性。
2)液体种子培养
所采用的液体种子培养基按重量百分比包括玉米淀粉1％、工业硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.3％，且pH值为7.0。
按1％接种量将菌种活化后的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的菌液接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养24h，完成液体种子培养，需要说明的是，需确保液体种子的OD600值为0.8，即生长至对数期，在本实施例中，经过24h培养后即达到该条件。
3)工业硫酸铵含量优化
获取五组发酵培养基，其中，发酵培养基pH值为7.0，且包括玉米淀粉、工业硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。其中，玉米淀粉、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的重量百分比分别为5.0％、0.3％、0.1％和0.1％。五组发酵培养基中工业硫酸铵的重量百分比分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和2.5％。
基于各组发酵培养基进行黄原胶的提取，每组提取黄原胶的过程均包括：将液体种子以5％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎。
共对应得到五组发酵产物黄原胶，对各组黄原胶进行称重。
4)计算产胶率
将黄原胶的质量除以发酵液的质量，即为黄原胶的产胶率。
不同工业硫酸铵含量的发酵培养基对应的产胶率条形图，如图3所示。
实施例4
1)菌种活化
将装有野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的冻干管在超净台中用75％酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将冻干管的顶端在酒精灯外焰处均匀加热，滴入2滴无菌蒸馏水于加热部位使管壁破裂，用镊子敲下破裂处，用吸管吸取0.5ml液体种子培养基于冻干管中将冻干菌粉全部溶解，溶解后的菌悬液转移至装有4ml液体种子培养基的液体试管中混匀，将残余在吸管中1滴菌悬液转接至斜面试管中的固体培养基上，将液体试管和斜面试管置于培养箱静置培养，直至菌液浑浊或斜面上长出菌落；然后将液体试管中培养的菌液按1％接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养72h，进行传代2次，使其恢复活性。
2)液体种子培养
所采用的液体种子培养基按重量百分比包括玉米淀粉1％、工业硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.3％，且pH值为7.0。
按1％接种量将菌种活化后的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的菌液接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养24h，完成液体种子培养，需要说明的是，需确保液体种子的OD600值为0.8，即生长至对数期，在本实施例中，经过24h培养后即达到该条件。
3)发酵条件接种量优化及黄原胶的提取
所采用的发酵培养基有五组，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0。
将第一组液体种子以5％接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第一组发酵产物黄原胶，并称重。
将第二组液体种子以10％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第二组发酵产物黄原胶，并称重。
将第三组液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第三组发酵产物黄原胶，并称重。
将第四组液体种子以20％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第四组发酵产物黄原胶，并称重。
将第五组液体种子以25％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第五组发酵产物黄原胶，并称重。
4)计算产胶率
将黄原胶的质量除以发酵液的质量，即为黄原胶的产胶率。
不同接种量对应的产胶率条形图如图4所示。
实施例5
1)菌种活化
将装有野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的冻干管在超净台中用75％酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将冻干管的顶端在酒精灯外焰处均匀加热，滴入2滴无菌蒸馏水于加热部位使管壁破裂，用镊子敲下破裂处，用吸管吸取0.5ml液体种子培养基于冻干管中将冻干菌粉全部溶解，溶解后的菌悬液转移至装有4ml液体种子培养基的液体试管中混匀，将残余在吸管中1滴菌悬液转接至斜面试管中的固体培养基上，将液体试管和斜面试管置于培养箱静置培养，直至菌液浑浊或斜面上长出菌落；然后将液体试管中培养的菌液按1％接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养72h，进行传代2次，使其恢复活性。
2)液体种子培养
所采用的液体种子培养基按重量百分比包括玉米淀粉1％、工业硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.3％，且pH值为7.0。
按1％接种量将菌种活化后的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的菌液接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养24h，完成液体种子培养，需要说明的是，需确保液体种子的OD600值为0.8，即生长至对数期，在本实施例中，经过24h培养后即达到该条件。
3)发酵条件发酵时间优化及黄原胶的提取
所采用的发酵培养基有五组，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0。
将第一组液体种子以15％接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养48h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第一组发酵产物黄原胶，并称重。
将第二组液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第二组发酵产物黄原胶，并称重。
将第三组液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养96h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第三组发酵产物黄原胶，并称重。
将第四组液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第四组发酵产物黄原胶，并称重。
将第五组液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养144h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第五组发酵产物黄原胶，并称重。
4)计算产胶率
将黄原胶的质量除以发酵液的质量，即为黄原胶的产胶率。
不同发酵时间对应的产胶率条形图如图5所示。
实施例6
1)菌种活化
将装有野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的冻干管在超净台中用75％酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将冻干管的顶端在酒精灯外焰处均匀加热，滴入2滴无菌蒸馏水于加热部位使管壁破裂，用镊子敲下破裂处，用吸管吸取0.5ml液体种子培养基于冻干管中将冻干菌粉全部溶解，溶解后的菌悬液转移至装有4ml液体种子培养基的液体试管中混匀，将残余在吸管中1滴菌悬液转接至斜面试管中的固体培养基上，将液体试管和斜面试管置于培养箱静置培养，直至菌液浑浊或斜面上长出菌落；然后将液体试管中培养的菌液按1％接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养72h，进行传代2次，使其恢复活性。
2)液体种子培养
所采用的液体种子培养基按重量百分比包括玉米淀粉1％、工业硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.3％，且pH值为7.0。
按1％接种量将菌种活化后的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的菌液接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养24h，完成液体种子培养，需要说明的是，需确保液体种子的OD600值为0.8，即生长至对数期，在本实施例中，经过24h培养后即达到该条件。
3)发酵条件发酵温度优化及黄原胶的提取
所采用的发酵培养基有六组，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0。
将第一组液体种子以15％接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，25℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第一组发酵产物黄原胶，并称重。
将第二组液体种子以15％接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第二组发酵产物黄原胶，并称重。
将第三组液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，35℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第三组发酵产物黄原胶，并称重。
将第四组液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，40℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第四组发酵产物黄原胶，并称重。
将第五组液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，45℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第五组发酵产物黄原胶，并称重。
将第六组液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，50℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到第六组发酵产物黄原胶，并称重。
4)计算产胶率
将黄原胶的质量除以发酵液的质量，即为黄原胶的产胶率。
不同发酵温度对应的产胶率条形图如图6所示。
对比例1
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶发酵培养基的方法，具体如下：
1)培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括淀粉4％、大豆蛋白0.8％、CaCO3 0.2％，pH为7.4。
液体发酵培养基按重量百分比包括淀粉4％、大豆蛋白0.8％、CaCO3 0.2％，pH为7.4。
2)黄原胶的发酵制备
野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris接种至液体种子培养基中经活化后的种子液按5％的接种量接种至装有75mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养96h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶，并称重。
对比例2
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶发酵培养基的方法，具体如下：
1)培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括淀粉4％、玉米黄粉0.8％、CaCO3 0.2％，pH为7.4。
液体发酵培养基按重量百分比包括淀粉4％、玉米黄粉0.8％、CaCO3 0.2％，碱性蛋白酶解液含量为10％，pH为8。
2)玉米黄粉的酶解
按照玉米黄粉4.00g、液固比10mL/g、酶添加量2.5kU/g、酶解温度50℃和适宜酶解pH进行酶解反应。实验过程中添加HCl和NaOH稀溶液维持反应体系pH恒定，酶解4h，调节酶解液pH为7.0，沸水浴灭酶15min，5000r/min离心15min去除固形物，水解物定容至50mL，获得80g/L的玉米黄粉酶解液。
3)黄原胶的发酵制备
玉米黄粉酶解液按10％的添加量添加到黄原胶发酵培养基中(玉米黄粉的质量浓度为8g/L)，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris种子液按5％的接种量接种至装有75mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养96h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶，并称重。
对比例3
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶发酵培养基的方法，具体如下：
1)培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括淀粉5％、玉米黄粉1.0％、CaCO3 0.2％，且pH为7.4。
液体发酵培养基按重量百分比包括淀粉5％、玉米黄粉1.0％、CaCO3 0.2％，中性蛋白酶解液含量为10％，且pH为7。
2)玉米黄粉的酶解
按照玉米黄粉5.00g、液固比10mL/g、酶添加量2.5kU/g、酶解温度50℃和适宜酶解pH进行酶解反应。实验过程中添加HCl和NaOH稀溶液维持反应体系pH恒定，酶解4h，调节酶解液pH为7.0，沸水浴灭酶15min，5000r/min离心15min去除固形物，水解物定容至50mL，获得100g/L的玉米黄粉酶解液。
3)黄原胶的发酵制备
玉米黄粉酶解液按10％的添加量添加到黄原胶发酵培养基中(玉米黄粉的质量浓度为10g/L)，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris种子液按10％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，40℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶，并称重。
对比例4
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶发酵培养基的方法，具体如下：
1)培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括淀粉6％、玉米黄粉1.2％、CaCO3 0.2％，且pH为7.4。
液体发酵培养基按重量百分比包括淀粉6％、玉米黄粉1.2％、CaCO3 0.2％，酸性蛋白酶解液含量为10％，且pH为3。
2)玉米黄粉的酶解
按照玉米黄粉6.00g、液固比10mL/g、酶添加量2.5kU/g、酶解温度50℃和适宜酶解pH进行酶解反应。实验过程中添加HCl和NaOH稀溶液维持反应体系pH恒定，酶解4h，调节酶解液pH为7.0，沸水浴灭酶15min，5000r/min离心15min去除固形物，水解物定容至50mL，获得120g/L的玉米黄粉酶解液。
3)黄原胶的发酵制备
玉米黄粉酶解液按10％的添加量添加到黄原胶发酵培养基中(玉米黄粉的质量浓度为12g/L)，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris种子液按10％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，40℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶，并称重。
对比例5
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶发酵培养基的方法，具体如下：
1)培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括淀粉7％、玉米黄粉1.4％、CaCO3 0.2％，且pH为7.4。
液体发酵培养基按重量百分比包括淀粉7％、玉米黄粉1.4％、CaCO3 0.2％，酸性蛋白酶解液含量为10％，且pH为3。
2)玉米黄粉的酶解
按照玉米黄粉7.00g、液固比10mL/g、酶添加量2.5kU/g、酶解温度50℃和适宜酶解pH进行酶解反应。实验过程中添加HCl和NaOH稀溶液维持反应体系pH恒定，酶解4h，调节酶解液pH为7.0，沸水浴灭酶15min，5000r/min离心15min去除固形物，水解物定容至50mL，获得140g/L的玉米黄粉酶解液。
3)黄原胶的发酵制备
玉米黄粉酶解液按10％的添加量添加到黄原胶发酵培养基中(玉米黄粉的质量浓度为14g/L)，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris种子液按10％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，40℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶，并称重。
对比例6
本对比例提供了现有技术的一种制备黄原胶发酵培养基的方法，具体如下：
1)培养基制备
液体种子培养基按重量百分比包括淀粉8％、玉米黄粉1.6％、CaCO3 0.2％，且pH为7.4。
液体发酵培养基按重量百分比包括淀粉8％、玉米黄粉1.6％、CaCO3 0.2％，酸性蛋白酶解液含量为10％，且pH为3。
2)玉米黄粉的酶解
按照玉米黄粉8.00g、液固比10mL/g、酶添加量2.5kU/g、酶解温度50℃和适宜酶解pH进行酶解反应。实验过程中添加HCl和NaOH稀溶液维持反应体系pH恒定，酶解4h，调节酶解液pH为7.0，沸水浴灭酶15min，5000r/min离心15min去除固形物，水解物定容至50mL，获得160g/L的玉米黄粉酶解液。
3)黄原胶的发酵制备
玉米黄粉酶解液按10％的添加量添加到黄原胶发酵培养基中(玉米黄粉的质量浓度为16g/L)，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris种子液按10％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，40℃，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶，并称重。
实施例1-6的产胶率见表1所示。将采用了本发明方法的实施例1-6和对比例1-6进行对比，对比参数为产胶率。见表2所示。
实施例1为野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris在经过12次传代在发酵培养基下的黄原胶产胶率，由表1可知，Xanthomonas campestris在发酵培养基玉米淀粉4.0％、工业硫酸铵1.0％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％和磷酸二氢钾0.1％，pH值为7.0下的产胶率分别为3.854％、3.797％、3.811％、3.901％、3.827％和3.790％，平均值为3.830％，由表1和表2可知，对比例1中相同的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris在不同的液体发酵培养基和发酵条件下进行黄原胶制备，产胶率为3.291％，实施例1产胶率的平均值(3.830％)相比于对比例1产胶率提高了16.38％，说明野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris能利用实施例1中的发酵培养基组分和发酵条件达到较高的产胶率，并能稳定遗传下去。
通过实施例2对发酵培养基中的玉米淀粉进行优化发现，在发酵培养基为玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.0％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％和磷酸二氢钾0.1％，pH值为7.0时，Xanthomonas campestris的产胶率可以从原始的3.830％提升至4.062％，产胶率提高了6.01％；由表1和表2可知，对比例2中相同的野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris在不同的液体发酵培养基和发酵条件下进行黄原胶制备，产胶率为1.614％，实施例2中产胶率的最高值(4.062％)相比于对比例2产胶率提高了151.67％，说明该菌株能利用实施例2中的发酵培养基组分和发酵条件达到较高的产胶率。
通过实施例3对发酵培养基中的工业硫酸铵进行优化发现，在发酵培养基为玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％和磷酸二氢钾0.1％，pH值为7.0时，Xanthomonas campestris的产胶率可以从原始的3.830％提升至4.172％，提高了8.88％；由表1和表2可知，对比例3中相同的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris在不同的液体发酵培养基和发酵条件下进行黄原胶制备，产胶率为2.366％，实施例3中产胶率的最高值(4.172％)相比于对比例3产胶率提高了76.33％，说明该菌株能利用实施例3中的发酵培养基组分和发酵条件达到较高的产胶率。
通过实施例4对接种至发酵培养基的液体种子接种量的优化发现，当液体种子接种量为15％时，Xanthomonas campestris的产胶率可以从原始的3.830％提升至4.171％，提高了8.88％；由表1和表2可知，对比例4中相同的野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris在不同的液体发酵培养基和发酵条件下进行黄原胶制备，产胶率为2.501％，实施例4中产胶率的最高值(4.171％)相比于对比例4产胶率提高了66.77％，说明该菌株能利用实施例4中的发酵培养基组分和发酵条件达到较高的产胶率。
通过实施例5对发酵时间的优化发现，当发酵时间为120h时，Xanthomonascampestris的产胶率可以从原始的3.830％提升至4.203％，提高了9.66％，由表1和表2可知，对比例5中相同的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris在不同的液体发酵培养基和发酵条件下进行黄原胶制备，产胶率为2.437％，实施例5中产胶率的最高值(4.203％)相比于对比例5产胶率提高了72.47％，说明该菌株能利用实施例5中的发酵培养基组分和发酵条件达到较高的产胶率。
通过实施例6对发酵温度的优化发现，当发酵温度为40℃时，Xanthomonascampestris的产胶率可以从原始的3.830％提升至4.342％，提高了13.32％，产胶率提升幅度最大，由表1和表2可知，对比例6中相同的野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris在不同的液体发酵培养基和发酵条件下进行黄原胶制备，产胶率为1.944％，实施例6中产胶率的最高值(4.342％)相比于对比例6产胶率提高了123.35％，说明该菌株能利用实施例6中的发酵培养基组分和发酵条件达到较高的产胶率。综上所述，实施例1-6的产胶率均高于对比例1-6的产胶率，而实施例6在最大程度上提高了Xanthomonas campestris的原始产胶率，提升效果最为显著，与对比例1-6相比更具有优势，更适合进行发酵放大生产。
表1实施例1-6的产胶率
表2实施例1-6和对比例1-6的产胶率对比情况
由实施例1得到的技术效果如图1可知，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris经过12次传代在发酵培养基下的黄原胶产胶率稳定在3.830％左右，具有良好的遗传稳定性，可用于工业化放大生产。
通过实施例2得到的结果图2和实施例3得到的结果图3可知，本发明方法使用了廉价的生产原料玉米淀粉和工业硫酸铵作为发酵底物，野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris在未经优化的培养基底物含量下的黄原胶产胶率在3.830％左右，在实施例2中，经过优化玉米淀粉含量后，随着玉米淀粉含量的增加，产胶率不断提高，在玉米淀粉添加量为5.0％时，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的产胶率达到最高，为4.062％；随着玉米淀粉浓度增大，菌体浓度不断增加，当超过某一值时导致溶氧不足，菌体活力降低，导致产胶率开始不断降低。因此本发明方法确定玉米淀粉的最佳添加量为5.0％。在实施例3中，经过优化工业硫酸铵含量后，随着工业硫酸铵含量的增加，产胶率不断提高，在工业硫酸铵含量达到1.5％时，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的产胶率达到最高，达到4.172％；当工业硫酸铵的浓度过高时，也会使菌株的生长受到抑制，当工业硫酸铵含量达到2.5％时，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的产胶率达到最低，为2.346％。因此本发明方法确定工业硫酸铵的最佳添加量为1.5％。
通过实施例4得到的结果图4、实施例5得到的结果图5以及实施例6得到的结果图6可知，在实施例4中，对发酵条件接种量进行优化，随着Xanthomonas campestris菌液接种量的不断增加，菌种的黄原胶产胶率呈现了先增高后降低的趋势，在接种量为15％是产胶率达到峰值为4.171％，较小的接种量会使发酵缓慢，发酵时间延长，在指定发酵时间内合成的黄原胶产量较低；而过大的接种量固然可以缩短生长周期，但却会使发酵培养基中的底物被提早利用，致使后期菌种因营养不良而凋亡，使黄原胶合成减少。因此本发明方法确定最佳接种量为15％。
在实施例5中，对发酵条件发酵时间进行优化，当发酵时间小于120h时，Xanthomonas campestris的产胶率随着发酵时间的增加也逐渐提高，在120h时达到峰值为4.203％，当发酵时间大于144h时黄原胶产胶率出现下降趋势。因此本发明方法确定最佳发酵时间为120h。
在实施例6中，对发酵温度进行优化，当温度逐渐升高时，Xanthomonascampestris的产胶率随着发酵温度的增加也逐渐提高，在40℃时产胶率达到峰值，为4.342％。随着发酵温度的不断增加，产胶率出现下降趋势，这可能是由于发酵温度过高，发酵培养基内部的温度过高使Xanthomonas campestris正常的生长代谢过程受到影响，进而使得黄原胶产量降低。因此本发明方法确定最佳发酵温度为40℃。
实施例6通过能低成本且高效的发酵生产黄原胶。在采用实施例6所述的生产培养基配方和发酵条件下，黄原胶产胶率可显著提高，提供了一种高产的黄原胶生产培养基，可以用作放大化生产培养基；降低发酵培养基配方成本，使用更廉价易得的玉米淀粉作为碳源，取代一部分葡萄糖的用量；相比于胰蛋白胨采用了更廉价易得的工业硫酸铵作为氮源，减少成本。通过优化该低成本发酵生产培养基的底物浓度、接种量、发酵时间和发酵温度，最终黄原胶产胶率可显著提高，提供了一种高产的黄原胶生产培养基和发酵条件，可以用于放大化生产。
本发明中，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris利用玉米淀粉和氮源进行菌种生长和富集，待菌株生长至对数期后，利用玉米淀粉作为碳源，工业硫酸铵作为氮源进行黄原胶合成，且该培养基配方成本显著降低，产胶率仍显著扩大，说明该菌株和培养基配方有作为工业生产菌株和发酵培养基的价值；野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris进行传代培养，每隔2代测一次黄原胶产胶率依然保持稳定性状，远远高于其他专利菌种；通过优化发酵培养基中玉米淀粉和工业硫酸铵的含量，野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris在最佳发酵生产培养基按重量百分比包括玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，pH值为7.0下的产胶率最高可达到4.172％；通过优化发酵条件(接种量、发酵时间、发酵温度)后确定最佳发酵条件为接种量为15％，摇床转速为180r/min，发酵时间为120h，发酵温度为40℃，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris在最佳发酵条件下发酵产胶率可达到4.342％。与原始发酵条件和培养基浓度相比，野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的黄原胶产胶率提高了13.37％。
综上所述，本发明方法使用了廉价的生产原料和较为简单的生产设备，能够大幅度降低成本，并提升经济效益；本发明方法的生产周期低于传统的黄原胶发酵方法，降低了生产时间成本，提升了生产效率；本发明方法相比于传统的生产方法，其工艺更加简单易行，仅需要一定的发酵技术操作经验即可生产出高产量的黄原胶，为中小企业的生产提供了更便捷的途径；本发明方法使用的发酵原料均来自可再生资源，且生产过程中不产生太多的废水废气，具有较好的环保特性，符合现代社会对于环境友好型产品的需求。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种黄原胶的发酵方法，其特征在于，对野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris进行菌种活化，之后进行液体种子培养，再将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶；
其中，菌种活化的方法包括：将装有野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris的冻干管在超净台中用75％酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将冻干管的顶端在酒精灯外焰处均匀加热，滴入2滴无菌蒸馏水于加热部位使管壁破裂，用镊子敲下破裂处，用吸管吸取0.5ml液体种子培养基于冻干管中将冻干菌粉全部溶解，溶解后的菌悬液转移至装有4ml液体种子培养基的液体试管中混匀，将残余在吸管中1滴菌悬液转接至斜面试管中的固体培养基上，将液体试管和斜面试管置于培养箱静置培养，直至菌液浑浊或斜面上长出菌落；然后将液体试管中培养的菌液按1％接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养72h，进行传代2次，使其恢复活性；
液体种子培养基按重量百分比包括玉米淀粉1％、工业硫酸铵0.5％、磷酸二氢钾0.3％，且pH值为7.0；经过菌种活化的菌液按照1％接种量接种到装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min恒温摇床培养24h，即完成液体种子培养。
2.根据权利要求1所述黄原胶的发酵方法，其特征在于，将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法包括：将液体种子以5％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。
3.根据权利要求2所述黄原胶的发酵方法，其特征在于，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉4.0％、工业硫酸铵1.0％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％和磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0。
4.根据权利要求2所述黄原胶的发酵方法，其特征在于，发酵培养基pH值为7.0，且包括玉米淀粉、工业硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾；其中，工业硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的重量百分比分别为1.0％、0.3％、0.1％和0.1％，玉米淀粉的重量百分比为4.0％，或5.0％，或6.0％，或7.0％，或8.0％。
5.根据权利要求2所述黄原胶的发酵方法，其特征在于，发酵培养基pH值为7.0，且包括玉米淀粉、工业硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾；其中，玉米淀粉、七水硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的重量百分比分别为5.0％、0.3％、0.1％和0.1％，工业硫酸铵的重量百分比为0.5％，或1.0％，或1.5％，或2.0％，或2.5％。
6.根据权利要求1所述黄原胶的发酵方法，其特征在于，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0；
将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法包括：将液体种子以5％，或10％，或15％，或20％，或25％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养72h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。
7.根据权利要求1所述黄原胶的发酵方法，其特征在于，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0；
将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法包括：将液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180r/min摇床恒温培养48h，或72h，或96h，或120h，或144h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。
8.根据权利要求1所述黄原胶的发酵方法，其特征在于，发酵培养基按重量百分比包括玉米淀粉5.0％、工业硫酸铵1.5％、七水硫酸镁0.3％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％，且pH值为7.0；
将液体种子接种至发酵培养基制备黄原胶的方法包括：将液体种子以15％的接种量接种至装有100mL液体发酵培养基的250mL锥形瓶中，在25℃，或30℃，或35℃，或40℃，或50的温度条件下，180r/min摇床恒温培养120h；发酵结束后，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干磨碎称重，得到发酵产物黄原胶。
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