CN110229763A

CN110229763A - 一株絮凝剂生产菌及其在对虾生物絮团养殖和染料脱色中应用

Info

Publication number: CN110229763A
Application number: CN201910360200.0A
Authority: CN
Inventors: 郭海朋; 张德民; 赵月季; 朱悦悦; 黄雷
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110229763B

Abstract

本发明公开了一株絮凝剂生产菌及其在对虾生物絮团养殖和染料脱色中应用，特点是该菌为野油菜黄单胞杆菌NBU10，于2018年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16936，其制备生物絮凝剂的方法步骤如下：将该菌株接种到种子培养液中进行种子液培养，然后将种子液接种到含0.5 wt%水稻秸秆的发酵培养液中发酵培养；将发酵液于4℃静止放置过夜，小心移除沉淀，上清液即为有絮凝作用的液体絮凝剂，优点是具有生物质降解并同时生产生物絮凝剂，通过在养殖塘中添加该发明菌株可以有利于较好较快的形成生物絮团，改善对虾的养殖水质和增加对虾产量。

Description

一株絮凝剂生产菌及其在对虾生物絮团养殖和染料脱色中应用

技术领域

本发明属于微生物制剂领域，尤其涉及一种从生物絮团养殖水中分离得到一株絮凝剂生产菌及其在对虾生物絮团养殖和染料脱色中应用的方法。

背景技术

对虾养殖是我国水产养殖业中最具代表性的产业之一。近几年，随着对虾养殖面积的增加以及集约化程度的提高，再加上对虾养殖密度加大后需要投入大量的饲料，导致养殖水体中氮素的大量积累并引起水质恶化。同时大量换水致使营养物质流失，并对周边环境造成污染，引起自然生态系统环境的严重失衡，虾发病率日趋增高。养殖水体微生物在改善水质、降低病原菌入侵和增加对虾免疫力等方面发挥着重要作用。因此，通过调控水体微生物多样性及其水体菌群结构组成，有效促进有毒氮素的微生物转化和抑菌物质的释放，从而改善水质和增加对虾抵抗力，已成为对虾集约化高密度健康养殖的研究热点。

基于改变微生物群落结构及其生态功能发展起来的生物絮团技术在改善养殖水体水质和提高对虾产量等方面表现出显著优势，近几年在对虾高密度、零排水养殖模式中得到了广泛的应用。生物絮团技术就是通过添加碳源提高碳氮比（C/N）对其养殖水体中的异养菌的调控和应用的技术，研究表明，生物絮团可以显著改变养殖水体异养微生物的多样性及其群落结构，而异养菌能够吸收氨氮并转化为微生物蛋白，达到调节水质的作用。其中，生物絮凝剂产生菌在对虾养殖水体生物絮团形成过程中发挥着重要作用。因此，筛选或者培养能够高效生产微生物絮凝剂的菌株并将其应用于对虾养殖中，可以为对虾健康生态养殖模式提供重要的指导作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有生物质降解并同时生产生物絮凝剂的絮凝剂生产菌及其在对虾生物絮团养殖和染料脱色中应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一株絮凝剂生产菌，该菌为野油菜黄单胞杆菌NBU10（Xanthomonas campestris），于2018年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16936。

该菌株为革兰氏阳性菌，在2216E琼脂培养基上30℃培养24 h，菌落表面光滑，边缘整齐，为透明的淡黄色；该菌株有较强的盐耐性，在0~30 g/L的NaCl培养下均可生长，可分泌纤维素酶，在CMC，Xylan和水稻秸秆为唯一碳源的平板上培养48 h，经革兰氏碘液染色可以形成透明圈。

所述的CMC，Xylan和水稻秸秆为唯一碳源的平板的培养基配方如下：0.5 wt% CMC或者Xylan或者水稻秸秆，0.1 g/L柠檬酸铁，5.9 g/L氯化镁，3.24 g/L硫酸镁，1.8 g/L氯化钙，0.55 g/L氯化钾，0.16 g/L碳酸氢钠，0.08g/L溴化钾，0.05 wt% 酵母提取物和0.3wt%胰蛋白胨，其余为双蒸水，pH为5.0~10.0。

利用上述絮凝剂生产菌制备生物絮凝剂的方法，步骤如下：将保藏号为CGMCCNo.16936的菌株接种到种子培养液中进行种子培养，然后将种子液接种到含5.0 wt%水稻秸秆的发酵培养液中发酵培养；将发酵液于4℃静止放置过夜，小心移除沉淀，上清液即为有絮凝作用的液体絮凝剂。

所述的种子培养基为2216E培养基，配方为蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，柠檬酸铁0.1 g/L，琼脂 15~20 g/L，陈海水 1000毫升，pH 7.6；所述的0.5 wt%水稻秸秆的发酵培养液的配方如下：0.5 wt%水稻秸秆，0.1 g/L柠檬酸铁，5.9 g/L氯化镁，3.24 g/L硫酸镁，1.8g/L氯化钙，0.55 g/L氯化钾，0.16 g/L碳酸氢钠，0.08g/L溴化钾，0.05 wt% 酵母提取物，0.3 wt%胰蛋白胨，其余为双蒸水，pH为5.0~10.0。

上述絮凝剂生产菌在制备水质改良剂方面的应用。

上述絮凝剂生产菌在制备水中亚硝酸盐去除剂方面的应用。

上述絮凝剂生产菌在对虾生物絮团养殖中的应用。

上述絮凝剂生产菌在制备染料脱色剂方面的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明涉及一种高产絮凝剂的菌株及其应用，该菌株从对虾生物絮团养殖模式中的生物絮团中分离得到，此菌有较好的耐盐性，对高岭土最高的絮凝活力为96.8%；

2、该发明菌株可应用于对虾的生物絮团养殖模式，通过在养殖塘中添加该发明菌株有利于较好较快的形成生物絮团，改善对虾的养殖水质和增加对虾产量，可以作为对虾新型绿色饲料添加剂和益生菌剂；

3、该发明菌株具有较高的纤维素酶和木聚糖酶活性，可以利用生物质为唯一碳源发酵生产微生物絮凝剂，生产的絮凝剂安全性高，生产期间不污染环境，且大大降低了生物絮凝剂的生产成本，可以大规模的应用于环境治理中。

综上所述，本发明首次报道了一株从生物絮团分离的具有生物质降解并同时生产生物絮凝剂的双功能菌株，其不仅可用于对虾生物絮团养殖模式的益生菌添加剂，其通过发酵生物质生产的低成本生物絮凝剂还可以用于环境治理，具有广阔的应用前景。

上述絮凝剂生产菌，该菌株分类命名为野油菜黄单胞杆菌NBU10（Xanthomonas campestris），于2018年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16936，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为本发明菌株以CMC，Xylan和水稻秸秆为唯一碳源培养后形成的透明圈；

图2为本发明菌株以水稻秸秆为唯一碳源培养后发酵液纤维素酶和半纤维素酶活力；

图3 为本发明菌株应用于对虾养殖实验后对生物絮团形成（A）和亚硝酸盐含量的影响（B）；

图4为本发明菌株应用于对虾养殖实验后对对虾成活率和单位产量的影响；

图5为不同剂量液体絮凝剂对考马斯亮蓝的移除效率比较图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

1、絮凝剂产生菌的筛选

取宁海对虾生物絮团养殖池的生物絮团5.0 g，重悬于50 ml 无菌PBS缓冲液中，煮沸2min 后，置于30±2℃恒温摇床，180~220 rpm 培养30 min，然后采用标准稀释平板涂布法涂布于1/2的2216E固体培养基上，在30±2℃恒温培养箱倒置培养2-4天，根据菌落的形状和颜色挑取单菌落并编号。挑取的单菌落经再次划板纯化后，置于1/2的2216E液体培养基中在30±2℃恒温摇床，180~220 rpm 培养2~4天，收集发酵液于12000g 离心3 min后，采用高岭土悬浮液测定其上清液的絮凝效率，选取具有较高絮凝效率的菌株NBU10用于后续实验。

所用的2216E培养基的配方为蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，柠檬酸铁0.1 g/L，琼脂15~20 g/L，陈海水1000毫升（天然海水在黑暗条件下放置数周），pH 7.6。其中絮凝效率的测定步骤为200 μL上清液加入到40 mL质量浓度为0.5 wt%的高岭土悬浮液中，然后再加入1 mL质量浓度为1.0 wt%的CaCl₂溶液，于100 rpm搅拌2 min，静置1 min后，测定液面以下2cm处悬浮液在550 nm处的吸光度B。以去离子水代替上清液作为对照，测定的吸光度为A。其絮凝效率的计算公式为：絮凝效率=（A-B）/A*100%。经测定共发现3种菌株有絮凝活力，其絮凝活力见表1。

表1. 生物质降解菌株的絮凝能力

。

2、生物质降解能力测定

将获得的高絮凝剂产生菌NBU10接种到种子培养基中，置于30±2℃的恒温摇床，180~220 rpm培养24 h。然后用移液器取5 μL种子液接种于唯一碳源培养基平板的中心，于30±2℃恒温培养箱倒置培养2天后用革兰氏碘液进行染色3~5 min。经测定该发明菌株具有CMC，Xylan和水稻秸秆的降解能力（图1）。以水稻秸秆为唯一碳源培养6 h后发酵液中最高的CMCase酶活为0.083 IU/mL，木聚糖酶活为1.71 IU/mL（图2）。

所述的种子培养基为2216E培养基，配方为蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，柠檬酸铁0.1 g/L，琼脂15~20 g/L，陈海水1000毫升（天然海水在黑暗条件下放置数周），pH 7.6。

所述的唯一碳源培养基的配方如下：0.5 wt% CMC，Xylan或者水稻秸秆，0.1 g/L柠檬酸铁，5.9 g/L氯化镁，3.24 g/L硫酸镁，1.8 g/L氯化钙，0.55 g/L氯化钾，0.16 g/L碳酸氢钠，0.08g/L溴化钾，0.05 wt% 酵母提取物，0.3 wt %胰蛋白胨，1.5 wt%琼脂，其余为双蒸水，pH为5.0-10.0。

所用的革兰氏碘液染色液包括2.0 g 碘化钾、1.0 g碘和300 mL双蒸水。

3、利用上述生物质降解菌株制备有絮凝活力的发酵液

将保藏号为CGMCC No.16936的菌株接种到种子培养液中进行种子培养，然后将种子液接种到含0.5 wt%水稻秸秆的发酵培养液中发酵培养；将发酵液于4℃静止放置过夜，小心移除沉淀，上清液即为有絮凝作用的液体絮凝剂。

所述的0.5 wt% 水稻秸秆的发酵培养液的配方如下：0.5 wt%水稻秸秆，0.1 g/L柠檬酸铁，5.9 g/L氯化镁，3.24 g/L硫酸镁，1.8 g/L氯化钙，0.55 g/L氯化钾，0.16 g/L碳酸氢钠，0.08 g/L溴化钾，0.05 wt% 酵母提取物，0.3 wt%胰蛋白胨，其余为双蒸水，pH为5.0~10.0。

4、本发明菌株的鉴定

16S rDNA 基因的PCR扩增：将NBU10菌株的发酵液用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用引物为：27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'。

PCR反应体系为(20 μL)：模板2 μL，kodaq 2×PCR MasterMix (Cat. No. G497，Abm，Canada)10 μL，引物1 0.5 μL，引物2 0.5 μL，ddH₂O 7 μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，其条带为1500 bp 左右，然后割胶回收纯化后送上海生工公司测序，测得16S rDNA序列为1469 bp，其基因为SEQIDNO.1所示的cDNA序列。将该序列提交到EZBioCloud比对后发现，模式菌株Xanthomonas campestris ATCC 33913(T)的相似度为100%。因此，将该NBU10菌株命名为野油菜黄单胞杆菌NBU10（Xanthomonas campestris），于2018年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16936。

实施例2

利用上述实施例1获得的菌株应用于对虾生物絮团养殖模式

本实验是在浙江省宁波市咸祥养殖基地完成，共设置10个600 L（直径1 m，高度0.8 m）凡纳滨对虾养殖生态实验桶，其中5个桶用作对照，5个用作野油菜黄单胞杆菌NBU10添加组。统一投放虾苗，每个实验桶放苗200尾左右，放苗2天后正式开始实验。菌株添加方法为：野油菜黄单胞杆菌NBU10用2216E培养基培养至菌液OD₆₀₀的吸光值约为1.0时，取1 L菌液和500 g 水稻秸秆粉末加入到添加组，对照组用无菌培养基代替。日投喂3次（7:00、12:00、17:00），初始日投喂量占对虾重10%。研究发现，添加NBU10组的生物絮团形成明显快于对照组，在实验第15天，实验组和对照组的絮团量分别为4.5和14.8 ml/L，对应的第30天的絮团量分别为7.2和27.3 ml/L（图3A）。此外，加入NBU10菌株还可以显著改善水质，在第15和30天，实验组亚硝酸盐含量分别1.3和1.7 mg/L，而对照组分别为2.6和20 mg/L（图3B）。在第30天，实验组对虾成活率和单位产量分别为对照组的1.6和1.9倍，说明添加絮凝菌株NBU10可以显著改善对虾的生长和产量（图4）。

实施例3

具有絮凝活力的发酵液制备及其在染料移除中的应用

将保藏号为CGMCC No.16936的菌株接种到种子培养液中进行种子培养，然后将种子液接种到含0.25~1.0 wt%水稻秸秆的发酵培养液中发酵培养；将发酵液于4℃静止放置过夜，小心移除沉淀，上清液即为有絮凝作用的液体絮凝剂。

取50 mL 50 mg/L的考马斯亮蓝染料，分别加入0.5，1.0，2.0和3.0 mL上述的液体絮凝剂，再分别加入1 mL 10 g/L 的氯化钙溶液，快速搅拌1 min后，缓慢搅拌30 s后，室温静置30 min，取上清液测定其在563 nm处的吸光值B。分别以加入0.5，1.0，2.0和3 mL蒸馏水作为对照，测定在563 nm处的吸光值A，计算染料的移除效率。移除效率=(A-B)/A*100%。结果如图5所示，加入1~3 ml该液体絮凝剂，对染料的移除效率均可达到80%以上。

其中种子液接种于发酵液中其接种量为1.0~2.0%（v/v），起始pH为5.0-10.0，发酵温度为30±2℃，转速为180~220 rpm，发酵时间为2~4天。种子培养基为2216E培养基，配方为蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，柠檬酸铁 0.1 g/L，琼脂 15~20 g/L，陈海水1000毫升（天然海水在黑暗条件下放置数周），pH 7.6。0.25~1.0 wt%水稻秸秆的发酵培养液的配方如下：0.25~1.0 wt%水稻秸秆，0.1 g/L柠檬酸铁，5.9 g/L氯化镁，3.24 g/L硫酸镁，1.8 g/L氯化钙，0.55 g/L氯化钾，0.16 g/L碳酸氢钠，0.08 g/L溴化钾，0.05 wt% 酵母提取物，0.3 wt%胰蛋白胨，其余为双蒸水，pH为5.0~10.0。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波大学

<120>一株絮凝剂生产菌及其在对虾生物絮团养殖和染料脱色中应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1469

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Xanthomonas campestris NBU10基因

<400> 1

AAGTGAACATTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACAGAAGAGCTTGCTCTTATGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTCTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCGGAGGACCTTCGGGCTTCGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAAAGCAGTCGGTTAATACCCGATTGTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTGGTTTAAGTCTGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAATTGCAGTGGATACTGGGTCACTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGACCAACATTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAACCCGCGAGGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTGCCACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTG 1469

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 27F

<400> 2

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 1492R

<400> 3

GGTTACCTTGTTACGACTT 19

Claims

1.一株絮凝剂生产菌，其特征在于：该菌为野油菜黄单胞杆菌NBU10（Xanthomonas campestris），于2018年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16936。

2.根据权利要求1所述的一株絮凝剂生产菌，其特征在于：该菌株为革兰氏阳性菌，在2216E琼脂培养基上30℃培养24 h，菌落表面光滑，边缘整齐，为透明的淡黄色；该菌株有较强的盐耐性，在0~30 g/L的NaCl培养下均可生长，可分泌纤维素酶，在CMC，Xylan和水稻秸秆为唯一碳源的平板上培养48 h，经革兰氏碘液染色可以形成透明圈。

3.根据权利要求2所述的一种絮凝剂生产菌，其特征在于：所述的CMC，Xylan和水稻秸秆为唯一碳源的平板的培养基配方如下：0.5 wt% CMC或者Xylan或者水稻秸秆，0.1 g/L柠檬酸铁，5.9 g/L氯化镁，3.24 g/L硫酸镁，1.8 g/L氯化钙，0.55 g/L氯化钾，0.16 g/L碳酸氢钠，0.08 g/L溴化钾，0.05 wt % 酵母提取物和0.3 wt %胰蛋白胨，其余为双蒸水，pH为5.0~10.0。

4.一种利用权利要求1-3所述的絮凝剂生产菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于步骤如下：将保藏号为CGMCC No.16936的菌株接种到种子培养液中进行种子培养，然后将种子液接种到含0.5 wt%水稻秸秆的发酵培养液中发酵培养；将发酵液于4℃静止放置过夜，小心移除沉淀，上清液即为有絮凝作用的液体絮凝剂。

5.根据权利要求4所述的一种絮凝剂生产菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于：所述的种子培养基为2216E培养基，配方为蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，柠檬酸铁 0.1 g/L，琼脂15~20 g/L，陈海水 1000毫升，pH 7.6；所述的0.5 wt%水稻秸秆的发酵培养液的配方如下：0.5 wt%水稻秸秆，0.1 g/L柠檬酸铁，5.9 g/L氯化镁，3.24 g/L硫酸镁，1.8 g/L氯化钙，0.55 g/L氯化钾，0.16 g/L碳酸氢钠，0.08g/L溴化钾，0.05 wt% 酵母提取物，0.3 wt%胰蛋白胨，其余为双蒸水，pH为5.0~10.0。

6.一种权利要求1-3所述的絮凝剂生产菌在制备水质改良剂方面的应用。

7.一种权利要求1-3所述的絮凝剂生产菌在制备水中亚硝酸盐去除剂方面的应用。

8.一种权利要求1-3所述的絮凝剂生产菌在对虾生物絮团养殖中的应用。