CN105821098A

CN105821098A - 自絮凝发酵生产α-熊果苷

Info

Publication number: CN105821098A
Application number: CN201510002687.7A
Authority: CN
Inventors: 陈礼明; 王璐
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-01-06
Filing date: 2015-01-06
Publication date: 2016-08-03

Abstract

本发明属于微生物工程技术领域，涉及一种制备α-熊果苷的新型发酵法——自絮凝法。本发明采用野油菜黄单胞菌发酵生产α-熊果苷，当菌株接种到摇瓶培养时能在4~8小时内自絮凝形成毫米级颗粒，并在之后的放大培养中保持颗粒形态生长，实现了该菌株在发酵液中的固定化，从而减少后期处理过程，无需离心分离菌体，能够降低α-熊果苷的生产成本。采用本发明生产的α-熊果苷产量高，产品能够抑制黑色素的产生和沉积，去除色斑，在浓度较低时有效抑制酪氨酸酶活性。

Description

自絮凝发酵生产α-熊果苷

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，涉及一种制备α-熊果苷的新型发酵法：自絮凝法。

背景技术

熊果苷（Arbutin）最早来源于天然绿色植物，取自越橘科植物熊果（Bearberry）的叶子，在梨、小麦等植物中也有发现。它能够迅速渗入肌肤，能有效地抑制皮肤中酪氨酸酶的活性，阻断多巴及多巴醌的合成，从而遏制黑色素的生长，在减少皮肤色素沉积、祛除色斑和雀斑的同时，对黑色素细胞不产生毒性、刺激性、致敏性等副作用，因而被用于化妆及保养品中。另外，熊果苷也有利尿、润肤与杀菌的功能，也被用于尿路消毒药、烧烫伤药及肠道消炎药中。

熊果苷根据其结构可分为α型和β型，两者均能抑制酪氨酸酶以达到美白的效果，但α-熊果苷的效果比β-熊果苷高出十倍，安全性也比β-熊果苷高。α-熊果苷的化学名为4-羟苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，一般通过不同的微生物的酶进行糖转移反应将葡萄糖和氢醌结合形成α-熊果苷，但随着对α-熊果苷研究的深入发现，采用酶法合成更具优势。

目前，国内对于生物法合成α-熊果苷多采用悬浮发酵，生产后期需要对发酵液进行离心分离，因此生产过程耗时较长，生产成本也较高。采用自絮凝法可实现菌株在发酵液中的固定化，免去了后期的离心分离，缩短生产时间，降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于通过采用自絮凝发酵实现菌株发酵固定化，从而降低生产时间和成本。它采用α-熊果苷产率高的野油菜黄单胞菌，选用合适的培养基和培养条件，使菌株自絮凝在发酵液中生产α-熊果苷，发酵液通过打孔吸附树脂柱的分离纯化，即可得到高纯度的α-熊果苷。本工艺具有操作简单，无需离心分离，生产成本低等优点。

本发明整体技术构思：

自絮凝发酵生产α-熊果苷的工艺步骤：

（1）将野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；

（2）将斜面菌种扩大培养作为种子液；

（3）种子液接入200ml发酵培养基中培养；

（4）加入反应物对苯二酚和蔗糖；

（5）α-熊果苷的分离纯化。

工艺条件：步骤（1）中斜面培养基成分：蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、酵母粉2.0-3.5份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾2.0份、氯化钠2.0份、琼脂15-20份和水1000份。工艺条件：pH值为7.0-8.0、温度25-35℃、培养时间为24-48小时。野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）CCTCCNO:M2012464。

步骤（2）、（3）中种子液和发酵液成分：蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、牛肉膏3份、酵母膏1份、硫酸镁0.5-1.0份、碳酸钙2份和水1000份。工艺条件：种子液接种量为5-10%，pH值为7.0-7.8，培养温度为30-35℃，通风量为0.4-0.6vvm，搅拌转速为150-200转/分钟，培养时间为24-36小时。

步骤（4）中的流程为冷冻步骤（3）中的培养液，在6000-8000转/分钟下离心20-25分钟，收集菌体；用磷酸盐缓冲液洗涤菌体2-3次，低温超声破碎，于6000-8000转/分钟下离心20-25分钟，取上清液即为粗酶液。

步骤（4）中的工艺条件：反应物对苯二酚物质量浓度为40mmol/L，蔗糖物质量浓度为150-180mmol/L，两者加入的摩尔比为30:1，反应温度为35-40℃，反应时间为36-48小时，搅拌转速为160-180转/分钟。

步骤（5）中分离纯化过程：

.自絮凝酶沉淀分离；

b.将经过a步骤后的反应产物通过弱极性大孔吸附树脂柱（AB-8柱）进行脱色（静置吸附1.5~2小时），产物变成无色透明液体；

c.把经过b步骤的反应产物通过极性大孔吸附树脂柱（S-8柱）进行分离纯化；

d.把经过c步骤的反应产物真空干燥，即可得到纯度为98%以上的α-熊果苷，真空干燥真空度为0.1MPa，温度为65度。

本发明所用的生物材料野油菜黄单胞菌CCTCCNO:M2012464已经在中国典型培养物保藏中心保藏，具有如下特征：保藏分类名：野油菜黄单胞菌Xcc1635Rif^r/XanthomonascampestrisXcc1635Rif^r；保藏编号：CCTCCNO:M2012464；保藏日期：2012年11月20号；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、武汉大学、菌种保藏中心。

本发明所取得的技术进步在于：采用了自絮凝法制备α-熊果苷，而非悬浮发酵，分离纯化是无需离心，缩短了生产时间，降低了生产成本。

具体实施方式：下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但这里要指明，本发明并不局限于实施例的范围。

实施例：

一种自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，包含以下步骤：

（一）α-熊果苷的制备：

①斜面种子培养：配置斜面培养基（蔗糖5%、蛋白胨1%、酵母粉0.2%、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.2%、氯化钠0.2%、琼脂2%，pH7.0，高压灭菌），将野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）接种到斜面培养基上，在35℃下培养36小时。

②种子液培养：用接种环挑取菌种，接种于50ml基本发酵液的250ml三角摇瓶中，在35℃摇床上，以160转/分钟振荡30小时。基本发酵液：蔗糖5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、酵母膏0.1%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.2%。

③将接种量为8%的种子培养液加入装有200ml基本发酵液的500ml三角摇瓶中，在35℃摇床上，以180转/分钟振荡30小时。

④向自絮凝的酶液中加入摩尔比为1:30的蔗糖和对苯二酚，蔗糖的浓度为150mmol/L，对苯二酚的浓度为40mmol/L，将混合物置于40℃的摇床上振荡48小时，转速为170转/分钟，得反应产物。

（二）α-熊果苷的分离纯化：

①菌体自行沉淀分离，过滤得清液。

②反应产物加载于弱极性大孔吸附树脂AB-8柱，静置2小时后洗脱，产物变成无色透明液体。

③上述步骤中的反应产物加载于极性大孔吸附树脂S-8柱。

④上述步骤中的反应产物经真空干燥形成白色粉状物，真空干燥的条件：0.1MPa，65℃。

附图说明：

图1：野油菜黄单胞菌发酵液自絮凝效果图。

图A：发酵刚结束时，菌体在发酵液中的形态，形成悬浮液体。

图B：15分钟后，菌体发生自絮凝，95%以上菌体沉降在液体底部。

Claims

1.自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，其特征在于：

（1）将野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）接种到摇瓶培养时，可在4~8小时内自絮凝形成毫米级的颗粒，并在之后的放大培养中保持颗粒状态生长；

（2）该菌株在发酵液中实现了固定化；

（3）后期处理时，自絮凝的菌株可以迅速沉降，无需离心分离。

2.自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步骤组成：

（2）将斜面菌种扩大培养作为种子液；

（3）种子液接入200ml发酵培养基中培养；

（4）加入反应物对苯二酚和蔗糖；

（5）α-熊果苷的分离纯化。

3.根据权利要求2所述的自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步骤组成：所述的（1）步骤中的斜面培养基由下列重量份组分组成，并附上工艺条件：

蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、酵母粉2.0-3.5份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾2.0份、氯化钠2.0份、琼脂15-20份和水1000份；工艺条件：pH值为7.0-8.0、温度25-35℃、培养时间为24-48小时。

4.根据权利要求2所述的自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步骤组成：所述的（2）、（3）步骤中的种子液、发酵液由下列重量份组分组成，并附上工艺条件：

蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、牛肉膏3份、酵母膏1份、硫酸镁0.5-1.0份、碳酸钙2份和水1000份，工艺条件：种子液接种量为5-10%，pH值为7.0-7.8，培养温度为30-35℃，通风量为0.4-0.6vvm，搅拌转速为150-200转/分钟，培养时间为24-36小时。

5.根据权利要求2所述的自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步骤组成：所述的（4）步骤中的反应条件为：

冷冻步骤（3）中的培养液，在6000-8000转/分钟下离心20-25分钟，收集菌体；用磷酸盐缓冲液洗涤菌体2-3次，低温超声破碎，于6000-8000转/分钟下离心20-25分钟，取上清液即为粗酶液。

6.根据权利要求2所述的自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步骤组成：所述的（4）步骤中的反应条件为：

反应物对苯二酚物质量浓度为40mmol/L，蔗糖物质量浓度为150-180mmol/L，两者加入的摩尔比为30:1，反应温度为35-40℃，反应时间为36-48小时，搅拌转速为160-180转/分钟。

7.根据权利要求2所述的自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步骤组成：所述的（5）步骤中的分离纯化包括以下几个步骤：

.自絮凝酶沉淀分离；

b.将经过a步骤后的反应产物通过弱极性大孔吸附树脂柱进行脱色；

c.把经过b步骤的反应产物通过极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化；

d.把经过c步骤的反应产物真空干燥，即可得到α-熊果苷。

8.根据权利要求7所述的自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步骤组成：所述的b步骤中的弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱，反应产物需静置1.5-2小时；c步骤中的极性大孔吸附树脂柱为S-8柱；d步骤中的真空干燥真空度为0.1MPa，温度为65度，干燥后的成品纯度大98%以上。

9.本发明所用菌种的生物材料来源于中国典型培养物保藏中心，具有如下特征：保藏分类名：野油菜黄单胞菌Xcc1635Rif^r/XanthomonascampestrisXcc1635Rif^r；保藏编号：CCTCCNO:M2012464；保藏日期：2012年11月20号；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、武汉大学、菌种保藏中心。