CN115141757A - 一株出芽短梗霉菌株及其发酵法生产普鲁兰多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株出芽短梗霉菌株及其发酵法生产普鲁兰多糖的方法，属于微生物制药领域，具体涉及一株生产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株（Aureobasidium pullulans）EP1001，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.40158，及其生产普鲁兰多糖的方法。该方法以出芽短梗霉菌株EP1001为生产菌株，利用葡萄糖和蔗糖为复合碳源，发酵培养基采用纯无机盐组合配方，发酵周期在60hr‑96hr，生物量仅15g/L‑19 g/L，普鲁兰多糖产量64.0 g/L‑68.9 g/L，普鲁兰多糖产量与生物量的比值在3.62‑4.26之间，该菌株具有较高的底物糖利用和转化能力。
Description
技术领域
本发明属于微生物制药领域，具体涉及一株出芽短梗霉菌株及其发酵法生产普鲁兰多糖的方法。
背景技术
2006年5月19日，国家卫生部发布了第8号公告，普鲁兰多糖为新增四种食品添加剂产品之一。日本Hayashibara 公司生物化学研究所同美国辉瑞 (Pfizer)公司合作，成功开发出以普鲁兰多糖为原料制成的硬质胶囊，第一次将普鲁兰多糖应用到医药领域，这种硬质胶囊新产品的崩散性、不透氧性和稳定性都很好。我国也于2020年，将普鲁兰多糖空心胶囊列入2020中国药典四部的药用辅料部分。国内普鲁兰多糖已在糖果、巧克力包衣、膜片和果蔬汁饮料等方面中得到应用。因此，普鲁兰多糖是一种具有极大经济价值和开发潜力的多功能新型生物材料，具有广阔的市场前景。
微生物发酵法生产普鲁兰多糖最初是在1959年由德国科学家Bender发现的。普鲁兰多糖(pulluans)是由出芽短梗霉(Aurebasidium pulluans)利用糖质化合物为基质进行好气发酵生产的一种粘性胞外多糖，无毒、无害、 无色、无味，耐热、耐盐、耐酸碱、黏度低、可塑性强、造膜性强、成膜性好和非常优良的增稠作用等特点，已广泛应用于医药、 食品、轻工、化工和石油等领域。
目前普鲁兰多糖产量提高主要是通过寻找高产菌株、构建基因工程菌、诱变筛选等为主，往往效果不太明显，发酵周期长，底物转化率不高，且整个发酵培养基都需要高温甚至超高温灭菌，蒸汽消耗量大，导致普鲁兰多糖生产成本居高不下。如何经济高效的采用出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖，成为当前工业企业普遍关注的重点。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一株出芽短梗霉菌株及其发酵法生产普鲁兰多糖的方法，该菌株于2022年04月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC）；保藏编号为 CGMCC No.40158，分类命名为出芽短梗霉Aureobasidium pullulans，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；发酵培养基采用纯无机盐组合配方，无需高温高压灭菌，该菌株的底物转化率高达68.9%，普鲁兰多糖产量与菌体生物量的比值在3.62-4.26左右，极大的提高了底物糖的利用效率和转化效率。
本发明一株出芽短梗霉菌株及其发酵法生产普鲁兰多糖的方法，主要包括以下步骤。
种子斜面培养：将保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCCNo.40158的EP1001菌株，通过接种针以划线的方式接种到PDA斜面培养基中，进行活化培养；具体步骤是：将出芽短梗霉菌株EP1001从负八十冰箱中取出，冰上自然溶解，用接种针在无菌超净工作台上转接到PDA斜面培养基上，在恒温培养箱中30℃避光培养72小时。
液体种子培养：将步骤（1）中活化的出芽短梗霉菌株EP1001转接到液体种子培养基中培养16小时。具体步骤是：将PDA斜面培养基活化培养72小时的培养物接种于装有50ml液体种子培养基的250ml的三角瓶中，接种量2%，培养温度30℃，摇床转速220rpm，振荡培养16小时，获得出芽短梗霉菌株液体培养物。
发酵培养基培养：将步骤（2）中的液体培养物，转接到发酵培养基中连续培养60小时，离心分离菌体和上清，菌体在120℃烘箱中烘干24小时后称重，即得发酵液中菌体的生物量；上清用1.8倍体积的无水乙醇沉淀普鲁兰多糖，120℃烘干24小时后称重，即得普鲁兰多糖的产量。具体步骤是：将培养16小时的出芽短梗霉菌液体培养物，接种于装有2.5L发酵培养基的5L玻璃发酵罐中，接种量10%，装液量50%，通气比1:1.8，搅拌转速400rpm，pH值控制在2.7，发酵培养60小时。
菌体收集和普鲁兰多糖产量的测定步骤是：取10ml发酵培养液，12000rpm离心15分钟，将上清转移到新的离心管中，沉淀物120℃烘干24小时后称重，即得发酵液中菌体的生物量；转移到新离心管的上清液，加入上清体积1.8倍的无水乙醇，上下颠倒混匀30次后，于高速离心机中12000rpm离心20分钟，弃上清，将沉淀物120℃烘干24小时后称重，即普鲁兰多糖的产量。
本发明的优势在于，出芽短梗霉菌株EP1001菌株于2022年04月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC）；保藏编号为 CGMCC No.40158，分类命名为出芽短梗霉Aureobasidium pullulans，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。出芽短梗霉菌EP1001发酵生产普鲁兰多糖的方法中，发酵培养基组分全部由无机盐组成，无需高温高压灭菌，发酵培养60小时后普鲁兰多糖的产量高达68.9g/L，菌体生物量仅有19.0g/L，底物转化率高达68.9%，，普鲁兰多糖产量与菌体生物量的比值为3.62-4.26左右，极大提高了底物糖的利用效率和转化效率。
附图说明
图1 EP1001菌株在麦芽汁、YPD、PDA培养基上生长72小时形态。
图2 EP1001菌株PDA斜面培养上生长情况。
图3 EP1001菌株在液体培养基中的生长状态变化。
图4 EP1001菌株在不同接种量情况下的生长曲线。
图5 EP1001菌株在不同接种量情况下的生物量变化曲线。
图6 EP1001菌株在不同接种量情况下的普鲁兰多糖产量变化曲线。
图7 EP1001菌株在5L发酵罐中的装液情况。
图8 EP1001菌株在5L发酵罐中的发酵状态控制实时运行图。
图9 EP1001菌株在5L发酵罐中的残糖含量测定结果。
图10 EP1001菌株在5L发酵罐中的生物量测定结果。
图11 EP1001菌株在5L发酵罐中的普鲁兰多糖量测定结果。
图12 EP1001菌株在5L发酵罐中的生物量、普鲁兰多糖、残糖测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明。
一株出芽短梗霉菌株及其发酵法生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
1）种子培养；
1.1）制备斜面种子培养基；
1.1.1）制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基，称取去皮马铃薯200g，切成小块，加1000mL水煮沸30min，用六层纱布滤成清液，向清液中加水至1000mL，然后加入20g 葡萄糖完全溶解，再加入琼脂20g，搅拌混合均匀后，即可获得马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
1.1.2）制备斜面种子，将保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.40158的EP1001菌株，从负八十冰箱中取出，冰上自然溶解后，用接种针在无菌超净工作台上转接到PDA斜面培养基上，在恒温培养箱中27℃避光培养72小时；
1.1.3）制备液体种子，将出芽短梗霉菌斜面单菌落接于液体种子培养基中进行摇瓶活化，具体为：将30ml种子培养基装入250ml的三角瓶中进行高温高压灭菌，冷却后，将出芽短梗霉菌种斜面单菌落接于液体种子培养基中进行摇瓶活化，培养条件为：转速为220rpm，温度30℃，培养至OD600=10.0；所述液体种子培养基包含以下组分：酵母浸粉2.0g/L，葡萄糖16.0g/L，蔗糖4.0g/L，糖蜜10.0g/L，(NH4)2SO4 0.66 g/L，NaNO3 0.84 g/L，K2HPO4 5.0 g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；
2）发酵培养；
2.1）将活化后的液体种子培养液以体积百分比10%的量接于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵培养；其中，所述发酵培养基包含以下组分：(NH4)2SO4 0.66 g/L，NaNO30.84 g/L，K2HPO4 5.0g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，pH 7.0，即得发酵培养基；
2.2）发酵罐的工艺参数为：5.0L发酵罐，装液量2.5L，按照体积百分比10.0%的接种量将液体种子培养基接种到发酵培养基中，发酵温度30℃，搅拌速度400rpm-600rpm，通空气量1.0：2.0 vvm；pH值分别用浓度为1.0M的盐酸溶液和1.0M氢氧化钠溶液进行调控。在发酵过程中，发酵前24小时，控制pH在4.5-7.0，24小时后控制pH值在2.7；发酵过程中进行连续流加碳源，即16.0g/L葡萄糖和4.0g/L蔗糖的混合溶液，流加速率是每小时0.2g/L，控制残糖0.1g/L，当发酵过程中残糖含量为0.0g/L时发酵结束，发酵时间在60hr-96hr之间，期间每12小时取样测葡萄糖、生物量、普鲁兰多糖产量；
2.3）生物量和普鲁兰多糖产量的测定步骤：取10ml发酵培养液，12000rpm离心15分钟，将上清转移到新的离心管中，沉淀物120℃烘干24小时后称重，即得发酵液中菌体的生物量；转移到新离心管的上清液，加入上清体积1.8倍的无水乙醇，上下颠倒混匀30次后，于高速离心机中12000rpm离心20分钟，弃上清，将沉淀物120℃烘干24小时后称重，即普鲁兰多糖的产量。
实施例1
将保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.40158的EP1001菌株，从负八十冰箱中取出，冰上自然溶解后，用接种针在无菌超净工作台上分别转接到麦芽汁、YPD、PDA斜面培养基上，在恒温培养箱中27℃避光培养72小时，比较EP1001菌株在不同固体培养基上的生长差异。可见，EP1001菌株在PDA培养基上生长相对较慢（图1），菌落边缘白色，中间微黄色，菌落直径在5mm-10mm之间，有利于进行斜面保藏。
实施例2
将保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.40158的EP1001菌株，从负八十冰箱中取出，冰上自然溶解后，用接种针在无菌超净工作台上转接PDA斜面培养基上，在恒温培养箱中27℃避光培养72小时；将出芽短梗霉菌种斜面单菌落（图2）接于液体种子培养基中进行摇瓶活化，分别接种到50ml/250ml、100ml/250ml、50ml/500ml、70ml/500ml、90ml/500ml、110ml/500ml、130ml/500ml液体种子培养基中进行摇瓶培养，转速为220rpm，温度为30℃，比较不同装液量和培养时间对EP1001菌株发酵液颜色（图3）、生物量和普鲁兰多糖产量的影响（图4）。
结果发现，50ml/250ml和50ml/500ml培养液中的生物量（图5）和普鲁兰多糖产量（图6）都是最高的，说明EP1001菌株是好氧型微生物，发酵装液量或者发酵罐通气量是影响该菌株生产普鲁兰多糖的重要因素。
实施例3
将出芽短梗霉菌种斜面单菌落（图2）接种于装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中进行活化，转速为220rpm，温度为30℃，培养至OD600=5.0。将活化后的种子培养液以体积百分比10%的量接种于装有发酵培养基的发酵罐中（图7），进行发酵培养。
发酵罐工艺参数为：5.0L发酵罐，装液量2.5L，发酵温度30℃，搅拌速度600rpm，通空气量1:2.0 vvm；发酵过程中的pH值分别用浓度为1.0M的盐酸和1.0M氢氧化钠进行调控（图8）。
在发酵过程中，发酵前24小时，控制pH在4.5-7.0，24小时后控制pH值在2.6；发酵过程中连续流加16.0g/L葡萄糖和4.0g/L蔗糖的混合溶液，流加速率是每小时1.0g/L，控制残糖10.0g/L，当发酵过程中残糖含量为0.0g/L时发酵结束（图9、图12）。
菌体收集和普鲁兰多糖产量的测定：取10ml发酵培养液，12000rpm离心15分钟，将上清转移至新的离心管中，沉淀物120℃烘干24小时后称重，即得发酵液中菌体的生物量干重。转移到新离心管的上清液，加入上清体积1.8倍的无水乙醇，上下颠倒混匀30次后，于高速离心机中12000rpm离心20分钟，弃上清，将沉淀物120℃烘干24小时后称重，即普鲁兰多糖的产量。该批次发酵的最终生物量干重19.0g/L（图10、图12）、普鲁兰多糖产量68.9 g/L（图11、图12），底物糖转化率68.9%。
本发明提供了一株出芽短梗霉菌株及其发酵法生产普鲁兰多糖的方法，该菌株命名为EP1001（图2），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCCNo.40158；本发明采用的发酵培养基，其组分全部为无机盐组合，切发酵培养基不需要高温高压灭菌，降低了工业生产中发酵培养基采用蒸汽灭菌所带来的高温高压对操作人员的危险系数，增强了人身的安全性，生产成本也因此大大降低；本发明利用该菌株进行的普鲁兰多糖产量试验中，发酵周期在60hr-96hr，出芽短梗霉生物量仅有15.0g/L-19.0g/L，普鲁兰多糖产量在64.0 g/L -68.9 g/L，普鲁兰多糖产量与生物量的比值在3.62-4.26之间，底物糖转化率在68.0%以上，极大的提高了底物的利用率和转化率。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (5)
1.一株生产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株，其特征在于，出芽短梗霉菌株EP1001于2022年04月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏编号为 CGMCC No.40158。
2.根据权利要求1所述的出芽短梗霉发酵法生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
种子斜面培养：即种子活化培养；
液体种子培养：将活化的出芽短梗霉菌株EP1001转接到液体种子培养基中培养获得出芽短梗霉种子培养物；
发酵培养基培养：将培养的出芽短梗霉种子培养物，接种于装有2.5L发酵培养基的5L玻璃发酵罐中，接种量10%，装液量50%，通气比1:1.8，搅拌转速400-600rpm，pH值控制在2.7，发酵培养60 hr -96hr。
3.根据权利要求2所述的出芽短梗霉菌株EP1001生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，发酵培养基组分为：(NH4)2SO4 0.66 g/L，NaNO3 0.84 g/L，K2HPO4 5.0g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO4 7H2O 0.2g/L，pH 7.0，无需经过高温高压灭菌。
4.根据权利要求2所述的出芽短梗霉菌株EP1001生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，发酵法生产普鲁兰多糖的控制工艺如下：5.0L发酵罐，装液量2.5L，按照体积百分比10.0%的接种量将液体种子培养基接种到发酵培养基中，发酵温度30℃，搅拌速度400rpm-600rpm，通空气量1.0：2.0 vvm；pH值分别用浓度为1.0M的盐酸溶液和1.0M氢氧化钠溶液进行调控，在发酵过程中，发酵前24小时，控制pH在4.5-7.0，24小时后控制pH值在2.7；发酵过程中进行连续流加碳源，流加速率是每小时0.2g/L，控制残糖0.1g/L，当发酵过程中残糖含量为0.0g/L时发酵结束，发酵时间在60hr-96hr之间。
5.根据权利要求2所述的出芽短梗霉菌株EP1001生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，发酵过程中流加的碳源为16.0g/L葡萄糖和4.0g/L蔗糖的混合溶液。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110678555A (zh) * | 2017-04-14 | 2020-01-10 | 比利时胶囊公司 | 制作普鲁兰的方法 |
| CN115637277A (zh) * | 2022-11-08 | 2023-01-24 | 山东省农业科学院 | 碳酸钙在提高普鲁兰多糖产量中的应用及应用方法 |
| CN115637278A (zh) * | 2022-11-08 | 2023-01-24 | 山东省农业科学院 | 出芽短梗霉在发酵生产普鲁兰多糖中的应用 |
| CN117070367A (zh) * | 2022-11-08 | 2023-11-17 | 山东省农业科学院 | 出芽短梗霉ncps2022-m及培养方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102492740A (zh) * | 2011-12-16 | 2012-06-13 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种出芽短梗霉联产聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法 |
| CN103060204A (zh) * | 2012-12-31 | 2013-04-24 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 大量生产普鲁兰多糖的诱变菌株及其培养方法 |
| CN104911231A (zh) * | 2014-12-26 | 2015-09-16 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 补料发酵提高普鲁兰多糖产量的方法 |
| CN105695347A (zh) * | 2016-04-28 | 2016-06-22 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种产普鲁兰多糖菌种及其应用、普鲁兰多糖的生产方法 |
| CN107641634A (zh) * | 2017-11-02 | 2018-01-30 | 北京艾普希隆生物科技有限公司 | 一种出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的生产工艺 |
| CN107760608A (zh) * | 2017-06-08 | 2018-03-06 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高效生产低分子普鲁兰多糖的诱变菌株及其应用 |
-
2022
- 2022-07-26 CN CN202210887696.9A patent/CN115141757A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102492740A (zh) * | 2011-12-16 | 2012-06-13 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种出芽短梗霉联产聚苹果酸和普鲁兰多糖的方法 |
| CN103060204A (zh) * | 2012-12-31 | 2013-04-24 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 大量生产普鲁兰多糖的诱变菌株及其培养方法 |
| CN104911231A (zh) * | 2014-12-26 | 2015-09-16 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 补料发酵提高普鲁兰多糖产量的方法 |
| CN105695347A (zh) * | 2016-04-28 | 2016-06-22 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 一种产普鲁兰多糖菌种及其应用、普鲁兰多糖的生产方法 |
| CN107760608A (zh) * | 2017-06-08 | 2018-03-06 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高效生产低分子普鲁兰多糖的诱变菌株及其应用 |
| CN107641634A (zh) * | 2017-11-02 | 2018-01-30 | 北京艾普希隆生物科技有限公司 | 一种出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的生产工艺 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李冰;相苒;王玉华;姚曼;张敏;张予心;宋秋梅;杨雪娇;: "出芽短梗霉发酵生产茁霉多糖工艺优化研究", 食品科技, no. 09, pages 11 - 15 * |
| 郭法利;欧杰;马晨晨;董博;: "出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)生物合成普鲁兰多糖的研究进展", 广东农业科学, no. 13, pages 113 - 115 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110678555A (zh) * | 2017-04-14 | 2020-01-10 | 比利时胶囊公司 | 制作普鲁兰的方法 |
| CN110678555B (zh) * | 2017-04-14 | 2023-10-13 | 比利时胶囊公司 | 制作普鲁兰的方法 |
| CN115637277A (zh) * | 2022-11-08 | 2023-01-24 | 山东省农业科学院 | 碳酸钙在提高普鲁兰多糖产量中的应用及应用方法 |
| CN115637278A (zh) * | 2022-11-08 | 2023-01-24 | 山东省农业科学院 | 出芽短梗霉在发酵生产普鲁兰多糖中的应用 |
| CN117070367A (zh) * | 2022-11-08 | 2023-11-17 | 山东省农业科学院 | 出芽短梗霉ncps2022-m及培养方法 |
| CN115637278B (zh) * | 2022-11-08 | 2024-01-16 | 山东省农业科学院 | 出芽短梗霉在发酵生产普鲁兰多糖中的应用 |
| CN117070367B (zh) * | 2022-11-08 | 2024-01-26 | 山东省农业科学院 | 出芽短梗霉ncps2022-m及培养方法 |
| CN115637277B (zh) * | 2022-11-08 | 2024-03-15 | 山东省农业科学院 | 碳酸钙在提高普鲁兰多糖产量中的应用及应用方法 |
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