TWI708844B

TWI708844B - 生產聚羥基鏈烷酸酯類之方法

Info

Publication number: TWI708844B
Application number: TW108118826A
Authority: TW
Inventors: 周聖炘; 郭家倫
Original assignee: 行政院原子能委員會核能研究所
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2020-11-01
Also published as: TW202043456A

Abstract

本發明提供一種生產聚羥基鏈烷酸酯類之方法，其包含下列步驟：(a) 提供木質纖維素水解液；及(b) 以嗜鹽菌株發酵該木質纖維素水解液形成發酵液，將該木質纖維素水解液中的糖分轉化為聚羥基鏈烷酸酯類。藉由如上所述之方法，可以解決習知微生物生產聚羥基鏈烷酸酯類之方法其產率過低之問題。

Description

生產聚羥基鏈烷酸酯類之方法

本發明係關於一種生產聚羥基鏈烷酸酯類之方法，尤其是一種以木質纖維素料源生產聚羥基鏈烷酸酯類之方法。

隨著環保意識提升以及石油資源的日漸耗盡，為了降低對石油資源的依賴，習知技術已發展出不使用石油作為原料且具有生物可分解性的生質塑膠。聚羥基鏈烷酸酯類 (Polyhydroxyalkanoates, PHA)為眾多生質塑膠材料之一，PHA因其材料性質與傳統的石化塑膠類似，且PHA為現階段唯一能在海洋中自行分解的生質塑膠，因此，PHA為目前較被廣泛運用的生質塑膠材料之一。

目前 PHA 主要可經由化學合成方法和生物合成方法製備取得。生物合成方法主要為微生物發酵方法，透過微生物發酵生產PHA的過程中，需要優勢菌種培養、料源饋料、滅菌和萃取純化等步驟，微生物發酵過程中使用的料源通常為糧食作物（例如：玉米）。

然而，習知利用微生物發酵生產PHA方法的PHA產量大多僅達到1.77至3.44 g/L的程度，而無法應用於商業生產。因此，習知微生物發酵生產PHA方法仍有產率過低之問題。

本發明之目的即針對上述問題，提供一種生產聚羥基鏈烷酸酯類之方法，其包含下列步驟：(a) 提供木質纖維素水解液；及(b) 以嗜鹽菌株發酵該木質纖維素水解液形成發酵液，將該木質纖維素水解液中的糖分轉化為聚羥基鏈烷酸酯類。

如上所述之方法，在(b)步驟中，當該發酵液的pH值上升至pH 7.1以上時，在該發酵液中饋入碳源。

如上所述之方法，在(b)步驟中，該嗜鹽菌株係於溫度為35-39℃的環境中進行發酵。

如上所述之方法，在(b)步驟中，該發酵液的pH值範圍為6.7~7.2。

如上所述之方法，在(b)步驟中，該發酵液中的通氣量為0.8~1.2 vvm。

如上所述之方法，在(b)步驟中，該發酵液中的溶氧率至少為20%以上。

如上所述之方法，在(b)步驟中，於該發酵液添加含氮物質。

如上所述之方法，該木質纖維素水解液為木屑水解糖液或蔗渣水解糖液。

如上所述之方法，在(b)步驟中，該嗜鹽菌株係於溫度為37℃的環境中進行發酵，該發酵液的pH值為7，該發酵液中的通氣量為1 vvm，該發酵液中的溶氧率至少為20%以上。

相較於習知微生物發酵生產PHA方法，其PHA之產量大多僅達到1.77至3.44 g/L的程度，藉由如上所述以木質纖維素作為料源生產聚羥基鏈烷酸酯類之方法，可以解決習知微生物發酵生產PHA方法其產率過低之問題。

為充分瞭解本發明之目的、特徵及功效，茲藉由下述具體之實施例，並配合所附之圖式，對本發明做一詳細說明，說明如後：

嗜鹽菌株( Haloferax mediterranei)利用不同料源發酵生產聚羥基鏈烷酸酯類(Polyhydroxyalkanoates, PHA)之比較試驗：

在本試驗中，係透過嗜鹽菌株( Haloferax mediterranei) 來生產PHA，本試驗之嗜鹽菌株的培養過程如下所述。

首先，由中華民國食品工業發展研究所購買嗜鹽菌株 (Haloferax mediterranei) AR10047，將該嗜鹽菌株AR10047進行馴化並以菌種保存樣本型態保存，該嗜鹽菌株AR10047的菌種保存樣本係以甘油在-80℃環境中保存。接著，將前述菌種保存樣本從-80℃環境中取出，置於冰上，待冷凍的菌種保存樣本溶回液體狀。該菌種保存樣本溶回液體狀之後，利用白金耳接種環從該菌種保存樣本中取菌，以三區劃菌的方式將菌體塗佈於已滅菌之固體培養基上，本試驗中之固體培養基成分包含NaCl(156 g/L)、NaHCO ₃(0.2 g/L)、MgSO ₄(20 g/L)、MgCl ₂(13 g/L)、CaCl ₂(1 g/L)、葡萄糖(1 g/L)、酵母菌萃取物(Yeast extract)(5 g/L)及洋菜膠(Agar) ( 15 g/L)。將塗佈有上述嗜鹽菌株的固體培養基置於37℃環境中培養5天，由於嗜鹽菌株為會產生紅色色素的菌株，因此當觀察到前述接種有嗜鹽菌株的固體培養基其表面上出現淡紅色之菌落，淡紅色之菌落即為培養出的嗜鹽菌株。

然後，將透過前述方式培養出的嗜鹽菌株接種於不同料源中進行發酵來生產聚羥基鏈烷酸酯類，嗜鹽菌株的發酵過程如下所述。

準備四個1000 ml的搖瓶，各搖瓶中分別裝有250 ml的培養液，各搖瓶中的培養液分別命名為樣本1至樣本4，培養液成分包含NaCl(234 g/L)、NaHCO ₃(0.2 g/L)、MgSO ₄(30 g/L)、MgCl ₂(19.5 g/L)、CaCl ₂(1 g/L)、碳源(5 g/L) 及酵母菌萃取物(Yeast extract)( 7.5 g/L)，其中，樣本1中的碳源為木屑水解糖液，樣本2中的碳源為蔗渣水解糖液，樣本3中的碳源為木糖溶液，樣本4中的碳源為葡萄糖。其中，木屑水解糖液係以木屑進行水解處理而形成的木質纖維素水解液，木屑水解糖液中含有葡萄糖和木糖；蔗渣水解糖液係以蔗渣進行水解處理而形成的木質纖維素水解液，蔗渣水解糖液中含有葡萄糖和木糖。

以白金耳接種環自固體培養基表面刮取嗜鹽菌株菌體重複三次，並將刮取起來的嗜鹽菌株菌體接種於樣本1至樣本4中。將上述已接種有嗜鹽菌株之樣本1至樣本4置於恆溫震盪培養箱，在培養溫度37℃、培養箱中轉速為180 rpm的條件下進行培養，並且持續培養六天。

接種有嗜鹽菌株之樣本1至樣本4於恆溫震盪培養箱中開始培養，每經過24小時便從樣本1至樣本4中取出嗜鹽菌株菌液，並利用分光光度計（Jasco Model V-550, Japan）以OD 520 _nm偵測嗜鹽菌株菌液之吸光值，將所得之吸光值換算成實際菌體濃度。同時，開始培養後的第2天起，每經過24小時在樣本1至樣本4中分別加入0.5 % 碳源（所加入的碳源種類即樣本1至樣本4其各自原本所加入的碳源）以供嗜鹽菌株生長。嗜鹽菌株培養到第六天，從震盪培養箱中取出樣本1至樣本4，測量樣本1至樣本4中各自所含的PHA含量以及計算樣本1至樣本4中的PHA濃度。下列說明嗜鹽菌株中PHA含量及菌液中的PHA濃度

嗜鹽菌株中PHA含量之測量：

測量樣本1至樣本4中的嗜鹽菌株各自所含的PHA含量的測量方法如下所述。由於樣本1至樣本4的PHA含量測量方法皆以相同方式進行，故下列以樣本1為例，說明本試驗中的樣本1至樣本4之PHA含量方法。

首先，從樣本1中取1 ml之菌液放入一微量離心管中，將含有樣本1之菌液的微量離心管在4℃、轉速13000 rpm的環境下離心15 min，離心後去除該微量離心管中的上清液；若該微量離心管中的菌體濃度超過20 g/L，先以10 % NaCl溶液稀釋該微量離心管中的菌體量，再次離心去除該微量離心管中的上清液，保留該微量離心管中的菌體部分。

接著，將透過前述離心方式取得之樣本1的菌體，以10 ml氯仿沖洗到玻璃試管中，並於該裝有菌體-氯仿溶液的玻璃試管上方放置一玻璃珠，用以避免氯仿受熱後溢出試管外。然後，將前述裝有菌體-氯仿溶液的玻璃試管置於加熱盤上以65 ℃加熱。

前述玻璃試管以65 ℃加熱萃取6.5小時後，接著在該玻璃試管中添加氯仿定量至10 ml，並自該玻璃試管中取出0.1 ml的液體（內含PHA），置於第二根玻璃試管中，同時在該第二根玻璃試管中加入5 ml的濃硫酸，該第二根玻璃試管置於加熱盤上加熱100 ℃反應15 min，該第二根玻璃試管上方亦放置玻璃珠，預防硫酸蒸汽溢出。加熱完畢後，待該第二根玻璃試管冷卻至室溫，使用分光光度計以波長235 nm測定其吸光值，並扣除空白試驗值（0.1 ml氯仿加5 ml濃硫酸之溶液，與樣本同時加熱反應）後對照換算表，可換算得PHA含量（μg），再換算成嗜鹽菌株菌體內PHA之含量（單位為%，以PHA重量(g)/菌體乾重(g)來計算）。

PHA之萃取與純化及PHA濃度的測量：

萃取與純化樣本1至樣本4中各自所含的PHA及PHA濃度的測量的方法如下所述。由於樣本1至樣本4中的PHA萃取純化方法及PHA濃度的測量的方法皆以相同方式進行，故下列以樣本1為例，說明本試驗中的樣本1至樣本4之PHA萃取與純化方法及PHA濃度的測量的方法。

首先，取約400 ml的樣本1，以4℃、轉速8000 rpm條件離心60 分鐘後去除樣本1的上清液。接著，在去除上清液的樣本1中加入約400 ml的10 %鹽水，經震盪混勻，並再次離心去除樣本1的上清液後，以250 ml之二次水將樣本1的菌體沖洗至冷凍乾燥瓶中，放置於-80℃冷凍庫過夜。經冷凍過夜處理後的樣本1菌體再放入冷凍乾燥機中乾燥72小時，即可取得樣本1的乾燥菌體。然後，將樣本1的乾燥菌體研磨成粉末，秤取2.5 g的樣本1的乾燥菌體，並將所秤取的樣本1放入脂肪抽出器中，以250 ml氯仿於90℃溫度條件下萃取6.5小時（約回流50次），由此取得含有PHA的氯仿萃取液。最後，以減壓濃縮機回收前述的氯仿萃取液，即可取得一袋狀的PHA薄膜，將該PHA薄膜置於己烷溶液中以去除該PHA薄膜中嗜鹽菌株本身所產出的紅色色素，待紅色色素析出後，即可取得PHA，透過秤取經由前述過程萃取純化所得之PHA的重量，便可進一步換算出樣本1的PHA濃度。

此外，樣本1的木屑水解糖液的製備過程係透過下列前處理過程來完成。先將木屑纖維加入濃度為1~1.5%的硫酸液中進行混酸處理，再以160 -180℃的蒸氣爆裂溫度，對上述經過混酸處理的木屑纖維進行蒸氣爆烈反應，視需求反應1~10分鐘，即可取得木屑水解糖液。樣本2的蔗渣水解糖液製備過程與樣本1的木屑水解糖液相同。但本試驗的木質纖維素料源水解液製備方法亦可採用現有已知的其他木質纖維素水解製程，或是直接購買取得，而不以本實施例為限。

先參見圖1及下表一，樣本1與樣本2的生長曲線非常相似，樣本1、2其最高菌體濃度分別可達11.70與11.92 g/L，明顯高於樣本3、樣本4。因此於搖瓶實驗規模（即前述試驗）中無法得知樣本1與樣本2的料源對嗜鹽菌株生長是否有差異，需後續進一步放大至5 L發酵槽中比較。在樣本4中，雖然菌體於生長速度與樣本1、2相同，但在最高菌體濃度方面略低，為10.31 g/L。而在樣本3中，嗜鹽菌株的生長速度明顯較慢，遲滯期長達兩天，菌體濃度於第五天達最高濃度10.26 g/L。

樣本1至樣本4中的PHA濃度及含量參見下表一，試驗結果如表一所示，以木屑水解糖液、蔗渣水解糖液為碳源的樣本1、2其PHA產量皆可達5 g/L以上，其中樣本2具有最高的PHA濃度5.48 g/L，PHA含量為46%。樣本1、2之PHA濃度與PHA含量皆高於樣本4之PHA濃度4.14 g/L、PHA含量40.2 %。而樣本3之PHA含量則偏低，為38.7%，PHA濃度為3.97 g/L。

表一、嗜鹽菌株於不同碳源下之最高菌體濃度、PHA濃度與PHA含量

	最高菌體濃度(g/L)	PHA濃度(g/L)	PHA含量(%)
樣本1	11.70	5.18	44.3
樣本2	11.92	5.48	46.0
樣本3	10.26	3.97	38.7
樣本4	10.31	4.14	40.2

在本試驗中，係選用木屑及蔗渣作為木質纖維素水解液的料源，但在其他試驗中，亦可選用其他性質與木屑或蔗渣類似的木質纖維素料源製得木質纖維素水解液，來供嗜鹽菌株發酵生產PHA，而不以本試驗為限。

以蔗渣水解糖液作為料源之5L發酵槽規模嗜鹽菌株生產PHA製程開發試驗：

首先，在5 L發酵槽中配置2.5 L的液態培養基（內含NaCl(234 g/L)、NaHCO ₃(0.2 g/L)、NaBr (0.5 g/L)、MgSO ₄(30 g/L)、MgCl ₂(19.5 g/L)、CaCl ₂(1 g/L)、葡萄糖(1 g/L) 及酵母菌萃取物 ( 7.5 g/L)）。

接著，在2.5 L的液態培養基中接種250 mL嗜鹽菌株菌液，以轉速800 rpm、溫度37℃、通氣量 1 vvm、pH 7.0、溶氧率(Dissolved Oxygen, DO) 20 %等發酵條件進行嗜鹽菌株的發酵培養，持續發酵時間為80小時，並且適時於發酵液中饋入料源，當發酵液的pH值逐漸上升至pH 7.1以上時（因發酵液中碳源或氮源耗盡造成pH上升），在發酵液中饋入1 L碳源（蔗渣水解糖液）(46 g/L)/氮源培養基(75 g/L)，使嗜鹽菌株有足夠料源可進行發酵反應。並且，當發酵液體積達4.5 L時，移出2 L發酵液。在本試驗中，是在發酵反應開始後第23.6小時開始饋料。

在本試驗中，係採用半連續式饋料發酵，以10N NaOH及10N HCl調整發酵液中的pH值，並控制發酵液中pH範圍維持約在6.8~7.2。

此外，本試驗中的發酵溫度可為35-39℃，該發酵液中的通氣量可為0.8~1.2 vvm，視試驗需求或製程開發試驗需求進行調整，而不以本實施例為限。另外，本試驗中的饋料內容物亦可視試驗需求或製程開發試驗需求進行調整，例如，僅選擇加入碳源而不額外補充氮源，而不以本實施例為限。

在本試驗中，菌體濃度、PHA濃度及嗜鹽菌株菌體內PHA之含量的測量，係依據前述嗜鹽菌株利用不同料源發酵生產聚羥基鏈烷酸酯類之比較試驗中的菌體濃度、PHA濃度及PHA含量測量方式進行測量。

本試驗的結果參照圖2，嗜鹽菌株的最高菌體濃度可達53.3 g/L。而PHAs濃度在嗜鹽菌株生長進入指數期(log phase)時快速增加，PHA最高濃度可達18.3 g/L。而嗜鹽菌株菌體內PHA含量部分，發酵前期由14%快速提升至34.3 %，隨後則維持於30~35 %，直至發酵結束。

以木屑水解糖液作為料源之5L發酵槽規模嗜鹽菌株生產PHA製程開發試驗：

本試驗之進行方式與前述以蔗渣水解糖液作為料源之嗜鹽菌株生產PHA製程開發試驗的進行方式大致上相同，唯一差別在於，本試驗中所使用之料源為木屑水解糖液。

本試驗的結果參照圖3，自發酵初期，嗜鹽菌株的菌體濃度便快速增加，其最高菌體濃度可達49.1 g/L。而PHAs濃度在嗜鹽菌株菌體生長進入指數期時亦快速增加，隨著發酵反應進入中後期，嗜鹽菌株生長進入停滯期(stationary phase)後，PHAs濃度亦隨之持平，最高可達15.0 g/L。而PHA含量部分，大多維持於25~31%之間。

以木屑水解糖液作為料源之30 L發酵槽規模嗜鹽菌株生產PHA製程開發試驗：

首先，在5 L發酵槽中配置4.0 L的液態培養基（內含NaCl(234 g/L)、NaHCO ₃(0.2 g/L)、NaBr (0.5 g/L)、MgSO ₄(30 g/L)、MgCl ₂(19.5 g/L)、CaCl ₂(1 g/L)、葡萄糖(1 g/L) 及酵母菌萃取物 ( 7.5 g/L)）。

接著，在4 L的液態培養基中接種500 mL嗜鹽菌株菌液之後，以轉速800 rpm、溫度37℃、通氣量 1 vvm、pH 7.0、溶氧率(Dissolved Oxygen, DO) 20 %等發酵條件進行嗜鹽菌株的發酵培養。在本試驗中，係以5N H ₂SO ₄及5N NaOH調整發酵液中的pH值，並控制發酵液中pH範圍維持約在6.8~7.2，後續放大發酵培養亦同。

在5L發酵槽培養約36小時後，將5L發酵槽中的3L發酵菌液接種於30L發酵槽（其中配製有10 L初始培養基）中進一步放大培養。前述初始培養基中含有NaCl(234 g/L)、NaHCO ₃(0.2 g/L)、NaBr (0.5 g/L)、MgSO ₄(30 g/L)、MgCl ₂(19.5 g/L)、CaCl ₂(1 g/L)、葡萄糖(1 g/L) 及酵母菌萃取物 ( 7.5 g/L)。

前述發酵菌液接種於30L發酵槽後，以轉速100 rpm、溫度37℃、通氣量 1 vvm、pH 6.7~7.2、溶氧率(Dissolved Oxygen, DO) 20 %以上、操作體積10 L等發酵條件進行嗜鹽菌株的放大發酵培養，持續發酵時間為94小時。當進行放大發酵培養24~36小時後，開始於發酵液中饋料，本試驗採用半連續式饋料發酵，當發酵液的pH值逐漸上升至pH 7.1以上時（因發酵液中碳源或氮源耗盡造成pH產生變化），在發酵液中饋入4 L碳源（木屑水解糖液）(42 g/L)/氮源培養基(75 g/L)。

本試驗的結果參照圖4，嗜鹽菌株之菌體濃度最高可達34.2 g/L。而PHAs濃度亦隨著菌體濃度增加而逐漸累積，PHAs濃度最高可達10.4 g/L。在本試驗的發酵製程中期，PHA的含量約為16 %~18 %左右，直至發酵製程後期PHA含量才提升至30%左右。

相較於習知微生物發酵生產PHA方法，其PHA之產量大多僅達到1.77至3.44 g/L的程度，本實施例之以木質纖維素作為料源生產聚羥基鏈烷酸酯類的方法，所產出的聚羥基鏈烷酸酯類濃度至少可達18.3 g/L以上，糖轉化為PHA的效率至少可達36%~40%（產出的PHA/饋入的葡萄糖之百分比）以上，本實施例之生產聚羥基鏈烷酸酯類的方法由此可以提高PHA產量，解決習知微生物生產聚羥基鏈烷酸酯類之方法其產率過低之問題。同時，習知微生物發酵生產PHA方法使用的料源通常為糧食作物（例如：玉米），導致利用微生物發酵方法生產PHA需要耗費較高的生產成本，進而限制其應用發展，本實施例之以木質纖維素作為料源生產聚羥基鏈烷酸酯類的方法則可利用農林廢棄物中的木質纖維素進行發酵，而不需要使用糧食作物作為料源，本實施例之生產聚羥基鏈烷酸酯類的方法藉此可以進一步降低生產成本。

本發明在上文中已以較佳實施例揭露，然熟習本項技術者應理解的是，該實施例僅用於描繪本發明，而不應解讀為限制本發明之範圍。應注意的是，舉凡與該實施例等效之變化與置換，均應設為涵蓋於本發明之範疇內。因此，本發明之保護範圍當以申請專利範圍所界定者為準。

無

圖1為本發明實施例的嗜鹽菌株利用不同料源發酵生產聚羥基鏈烷酸酯類之比較試驗的實驗結果圖；圖2為本發明實施例的以蔗渣水解糖液作為料源之5L發酵槽規模嗜鹽菌株生產PHA製程開發試驗的實驗結果圖；圖3為本發明實施例的以木屑水解糖液作為料源之5L發酵槽規模嗜鹽菌株生產PHA製程開發試驗的實驗結果圖；及圖4為本發明實施例的以木屑水解糖液作為料源之30 L發酵槽規模嗜鹽菌株生產PHA製程開發試驗的實驗結果圖。

無

Claims

一種生產聚羥基鏈烷酸酯類之方法，其包含下列步驟： (a) 提供木質纖維素水解液；及 (b) 以嗜鹽菌株發酵該木質纖維素水解液形成發酵液，將該木質纖維素水解液中的糖分轉化為聚羥基鏈烷酸酯類。
如請求項1所述之方法，其中在(b)步驟中，當該發酵液的pH值上升至pH 7.1以上時，在該發酵液中饋入碳源。
如請求項1所述之方法，其中在(b)步驟中，該嗜鹽菌株係於溫度為35-39℃的環境中進行發酵。
如請求項1所述之方法，其中在(b)步驟中，該發酵液的pH值範圍為6.7~7.2。
如請求項1所述之方法，其中在(b)步驟中，該發酵液中的通氣量為0.8~1.2 vvm。
如請求項1所述之方法，其中在(b)步驟中，該發酵液中的溶氧率至少為20%以上。
如請求項1所述之方法，其中在(b)步驟中，於該發酵液添加含氮物質。
如請求項1所述之方法，其中該木質纖維素水解液為木屑水解糖液或蔗渣水解糖液。
如請求項1或2所述之方法，其中在(b)步驟中，該發酵液的pH值為7，該發酵液中的通氣量為1 vvm，該發酵液中的溶氧率至少為20%以上。