CN111662840B - 一种沙雷氏菌及其运用及其菌悬液制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株沙雷氏菌及其应用及其菌悬液制备方法，本发明的技术方案是：一种沙雷氏菌，其特征在于：其保藏编号为CGMCC NO.18654；以及降解群体感应信号分子C8‑HSL中的应用；以及将菌株Serratia sp.Z4 MK431391划线于LB培养基或无机盐培养基固体平板上，在一定条件下得到菌株Serratia sp.Z4 MK431391的菌悬液，通过采用上述方案，提供一种新型的用于群体感应淬灭的菌株及其应用及其菌悬液制备方法。

Description

一种沙雷氏菌及其运用及其菌悬液制备方法
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株沙雷氏菌及其应用及其菌悬液制备方法。
背景技术
胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）和溶解性微生物产物（soluble microbial products, SMP）是一定条件下有细菌分泌的于体外的高分子聚合物，其化学组分复杂，主要成分包括蛋白质、多糖、DNA、腐殖酸等，其中蛋白质和多糖组分占比70%~80%。EPS作为活性污泥的重要组成部分，是细菌在一定条件下形成的用于自我保护和相互粘附并在饥饿环境下为细菌提供碳源和能量的有机物质。EPS和SMP能够在细胞之间构成一种架桥作用，将微生物粘结在一起，从而形成紧密的细胞菌落，并通过这些胞外物质进行物质流通及能量传递，在污水处理的活性污泥工艺中具有重要作用，而在膜生物反应器中则是膜生物污染的重要影响因素。
大量研究表明活性污泥作为高密度的微生物活动体，存在一种群体感应现象，主要指细菌以细胞分泌的小分子自诱导剂信号分子作为细菌间的通讯物质，调控细菌细胞之间信息交流，协调细菌群体行为以适应环境。且研究发现革兰氏阴性菌分泌的酰基高丝氨酸内酯类信号分子中的C8-HSL（N-octanoyl-L-Homoserine lactone，N-辛酰基-高丝氨酸内酯）信号分子是调控EPS和SMP分泌、生物膜形成的重要信号分子。
近年来，一种基于微生物群体感应理论，通过破坏群体感应信号分子结构，干扰群体感应的群体感应淬灭技术，以生物防治技术为基础，具有高效、低毒、持久及低成本等优势，逐渐成为环境微生物技术的研究热点。目前群体感应抑制剂的研发主要集中在群体感应抑制剂、群体感应淬灭酶、群体感应淬灭菌三个方面。其中从植物中提取的群体感应淬灭剂然存在提取及纯化方法步骤复杂，大多数的群体淬灭剂具有单一作用性只能针对信号分子中个别高丝氨酸内酯物产生抑制作用，且对共存微生物毒害性不明确等问题，不利于实际应用。群体感应淬灭酶由于其本身的不稳定性、难获取性、保存困难、易失活等特征，使得使用范围和使用寿命大大受限。
发明内容
本发明克服现有技术存在的问题，提供一种新型的用于群体感应淬灭的菌株及其应用及其菌悬液制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种沙雷氏菌，其特征在于：其保藏编号为CGMCC NO.18654。
通过采用上述方案，该沙雷氏菌Serratia sp.Z4 MK431391，对群体感应信号分子C8-HSL有显著的降解作用，在防治C8-HSL介导的活性污泥EPS和SMP分泌方面有巨大的应用潜力，这为以生物防治替代化学防治且以阻断群体感应为靶标而不引起选择压力的治疗策略提供了新的开发途径。
本发明应用的技术方案是：沙雷氏菌Serratia sp.Z4 MK431391在降解群体感应信号分子C8-HSL中的应用，或在制备降解信号分子C8-HSL的产品中的应用，或在防治信号分子C8-HSL介导的EPS和SMP分泌中的应用，或在制备依赖信号分子C8-HSL的防治制剂的应用，或在防治信号分子C8-HSL介导的微生物群体感应的应用，或在制备依赖信号分子C8-HSL介导的群体感应淬灭制剂的应用，或沙雷氏菌Serratia sp.Z4 MK431391的菌悬液处理活性污泥，或防治膜生物反应器膜生物污染的生物制剂。
采用上述方案的应用，可以实现沙雷氏菌Serratia sp.Z4 MK431391对群体感应信号分子C8-HSL有显著的高效降解作用，从而干扰C8-HSL介导的群体感应系统，可显著减轻依赖C8-HSL诱导的EPS和SMP分泌，达到实际生物防治效果的功能。
本发明菌悬液制备方法的技术方案是：将菌株Serratia sp.Z4 MK431391划线于LB培养基或无机盐培养基固体平板上，30℃~35℃下培养20-28h，挑取单菌落接种于LB液体培养基或无机盐培养基中预培养至对数期，所得菌体用0.6-1.2%的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液，再将种子悬液按照体积比 0.5%~5%的接种量接种至LB液体培养基或无机盐培养基培养至对数期，菌体用PBS缓冲液重悬得到菌株Serratia sp.Z4 MK431391的菌悬液。
本发明的菌悬液制备方法的进一步技术方案是：LB 培养基的配方为：胰蛋白胨9-11 g/L，酵母提取物 4.5-6.5 g/L，氯化钠9-11 g/L，pH 7.0~7.5，110-130℃灭菌 15-25min，LB 固体培养基配方是在液体培养基中加入1.5%(w/v)的琼脂，即每10mlLB液体培养基加入0.1-0.2g琼脂粉。
无机盐培养基基本组成：(NH4)2SO4 0.9-1.1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.15-0.25g/L、CaCl2 0.15-0.25g/L、NaH2PO4 0.4-0.6g/L、K2HPO4 0.4-0.6g/L、NaCl 0.15-0.25g/L、Fe2(SO4)3·7H2O 0.0005-0.0012g/L，pH 7.5，无机盐固体培养基配方是在液体培养基中加入1.5%(w/v)的琼脂。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
附图说明
图1 是Serratia sp. Z4 MK431391基因组DNA和PCR产物16S rDNA基因琼脂糖电泳图；
图2 是采用MEGA7.0软件，邻位连接法显示菌株MK431391与相关种的16S rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于70%数值；
图3 是温度对Serratia sp. Z4 MK431391 降解C8-HSL能力的影响；
图4 是pH对Serratia sp. Z4 MK431391 降解C8-HSL能力的影响；
图5 是菌悬液体积分数对Serratia sp. Z4 MK431391 降解C8-HSL能力的影响；
图6 是C8-HSL浓度对Serratia sp. Z4 MK431391 降解C8-HSL能力的影响；
图7 是生活污水理化性质；
图8是可溶性微生物代谢产物组分蛋白质浓度；
图9 是可溶性微生物代谢产物组分多糖浓度；
图10 是胞外聚合物组分蛋白质浓度；
图11 是胞外聚合物组分多糖浓度；
图12 是EPS提取缓冲液。
具体实施方式
图1中泳道1和2为基因组DNA，3、4、5、6为16S rDNA基因，M为DNA Marker。
本文件中“群体感应淬灭”是指降解革兰氏阴性菌AHLs类信号分子，“C8-HSL ”指信号分子N-辛酰基-高丝氨酸内酯，N-octanoyl-L-Homoserine lactone。“EPS”指微生物胞外聚合物。“SMP”指可溶性微生物代谢产物。
实施例1：群体感应淬灭菌的分离和鉴定
（1）初筛
采用基本培养基定向分离法，以C8-HSL为唯一的碳源，可以筛选出能代谢降解AHL，利用代谢产物生长的菌株。
从浙江省温州市各大污水处理厂采集活性污泥水样和土样，每份样品均称取10g置装有90ml无菌水的三角烧瓶内，振荡摇匀后取5ml接种于装有50ml LB培养基的三角瓶内，在30℃、150r/min下富集培养。LB培养基基本组成：酵母浸出粉5.0 g；胰蛋白胨10.0 g；NaCl 10.0 g，蒸馏水1000ml ，pH 值调至7.5，121 ℃灭菌30 min，备用，待长出菌体后(培养3天左右)转接新的LB培养基在同样条件下培养，充分富集污泥混合液中的菌株。
配置唯一碳源为C8-HSL（10mg/L）的无机盐液体培养基，接种活性污泥富集培养液20µL，30℃、150rpm下培养48h后，取20µL涂布至LB固体培养基平板、30℃培养2d。无机盐培养基基本组成：(NH4)2SO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl2 0.2g、NaH2PO4 0.5g、K2HPO40.5g、NaCl 0.2g、Fe2(SO4)3·7H2O 0.001g，蒸馏水1000ml，pH 7.5。观察LB固体平板菌落生长情况，挑取不同形态的菌落重新转接至含有C8-HSL的筛选无机盐液体培养基中。挑取平板上颜色、形态不同的菌落划线接种于无机盐固体培养基上(配方同前)在相同条件下培养进行纯化，直至经镜检为纯培养物为止。然后转接LB斜面培养后在4℃下保藏。从采自温州市工业园区第一污水处理厂等活性污泥土壤样品中获得7株纯培养物。
（2）复筛
将初筛获得的7株纯培养物分别接种于10mL LB液体培养基，30℃、150rpm培养至OD600=1.5，制备成种子培养液。取种子培养液20µL（0.2% v/v）接种至含C8-HSL 10mg/L的无机盐液体培养基中，30℃、150rpm培养24h后取出。采用乙酸乙酯萃取3次，弃水相，混合有机相，将提液置于旋转蒸发仪内，旋转蒸干，取0.5mL/次乙酸乙酯洗脱三次，自然挥发后无水甲醇定容至1mL，4℃冷藏保存待测。HPLC-MS上机检测，提取定量离子峰（m/z 228.3、峰宽0.1min）的峰面积，对照标准线性曲线计算C8-HSL浓度。以C8-HSL降解率公式计算筛选菌株的降解率，以降解率≥50%为标准，分别检测计算培养起止无机盐培养基中C8-HSL的浓度。
C8-HSL采用高效液相色谱-质谱联用仪测定（马晨晨，分析化学, 2010, 38(10):1428-1432）。
C8-HSL降解率/%=(培养前培养基C8-HSL浓度-培养后培养基C8-HSL浓度)/培养前培养基C8-HSL浓度×100%。
经复筛，从7株初筛获得的纯培养物中获得1株优良的群体感应淬灭菌，它从采自浙江省温州市滨海工业园区第一污水处理厂活性污泥样品中分离获得，编为MK431391，其对基本培养基中加C8-HSL 10mg/L降解率为93.7±0.05 %。
（3）稳定性实验
将复筛获得的菌株MK431391在LB斜面上连续转接10代，将每代培养的菌株分别接种于装有10ml无机盐培养基的20ml锥形瓶中，在30℃、150 r/min下振荡培养2天。无机盐培养基的基本组成同初筛，其中一组基本培养基中加C8-HSL 10mg/L，分别测定培养起止无机盐培养基中的C8-HSL浓度，计算C8-HSL降解率。
第10代的菌株MK431391培养物对基本培养基中加C8-HSL 10mg/L降解率分别为97.899±0.272%，表明菌株MK431391是稳定的。
（4）鉴定
图1为菌株MK431391的形态，菌株MK431391菌落为呈近似圆形、边缘周边光滑、不透明，缺氧条件下能产生紫红色素，革兰氏阴性。
以菌株MK431391的基因组DNA为模板，以细菌通用引物进行克隆并做16S rDNA序列分析，引物序列为：正向引物5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3´(SEQ ID NO: 1)，反向引物5´-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3´(SEQ ID NO: 2)，图1为菌株MK431391基因组DNA和PCR产物16S rDNA基因的琼脂糖电泳图，16S rDNA基因的测序委托上海生工公司完成，测序结果通过GenBank Blast进行比对分析。
菌株MK431391的16S rDNA 由1444 bp碱基组成，如SEQ ID NO.1所示；通过GenBank Blast进行比对分析，与GenBank中的Serratia属的16S rDNA 序列具有很高同源性，与Serratia marcescens subsp. marcescens Db11的同源性超过99 %，编号为Serratia sp. Z4 MK431391。采用MEGA7.0软件，Neighbor-Joining法显示菌株KX255631与相关种的16S rDNA系统发育树见图2。
本发明的沙雷氏菌（Serratia sp.），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.18654，保藏起始日期为2019年10月10日，分类名称沙雷氏菌（Serratia sp.）。
实施例2：Serratia sp. Z4 MK431391降解C8-HSL的条件
菌株Serratia sp. Z4 MK431391（1.5ml冷冻管融化后菌液）接种于装有50 ml LB培养基的250ml锥形瓶中，在30℃、150 r/min下培养24h进行菌种活化；
以按百分之五的体积分数转接于装有100 ml LB培养基的500 ml锥形瓶中，在30℃、150 r/min下培养24h，8000 r/min下离心10min后用无菌水洗涤菌体两次，然后用无菌水调配成OD600=0.999-1.000的菌悬液；按百分之一的体积分数接入装有10ml无机盐培养基的25ml锥形瓶中，在一定温度和转速下振荡培养两天，分别测定培养起止无机盐培养基(基本组成同实施例一(1))中的C8-HSL浓度，计算C8-HSL降解率测定同实施例一(2))。
（1）温度对Serratia sp. Z4 MK431391降解C8-HSL能力的影响
无机盐培养基中加入C8-HSL 10mg/L，培养基pH 7.5，取菌株菌悬液20 µl (0.2%v/v)接种至含C8-HSL 10mg/L的 10 mL无机盐液体培养基中，分别在15、20、25、30、35、40、45℃七个温度梯度下培养，转速均为150 r/min，结果如图3。由图3看出，Serratia sp. Z4MK431391降解C8-HSL的适宜温度为25～40℃。
（2）pH对Serratia sp. Z4 MK431391降解C8-HSL能力的影响
无机盐培养基内加C8-HSL 10mg/L，培养基pH用1mol/L HCL和1mol/L NaOH分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，接入菌悬液后在30℃、150 r/min下培养，结果如图4。由图4看出，Serratia sp. Z4 MK431391降解C8-HSL的适宜pH为7.0～8.0，即中性偏碱。
（3）菌悬液体积分数对Serratia sp. Z4 MK431391降解C8-HSL能力的影响
无机盐培养基中加入C8-HSL 10mg/L，培养基pH 7.5，设置温度30℃、转速150rpm，取菌悬液体积分数梯度设为0.1%、0.5%、1%、5%、10% 5个，结果如图5所示。由图5看出，Serratia sp. Z4 MK431391降解C8-HSL的菌悬液体积分数为0.5%~5%。
（4）C8-HSL浓度对Serratia sp. Z4 MK431391降解C8-HSL能力的影响
无机盐培养基中加入C8-HSL设置 5、10、15、20、25mg/L5个梯度分别培养，培养基pH 7.5，设置温度30℃、转速150 rpm，结果如图6所示。由图6看出，Serratia sp. Z4MK431391降解C8-HSL的能力随浓度增加效率下降。
实施例3：Serratia sp. Z4 MK431391调控活性污泥混合液实验
采用原位持续性生物刺激法研究Serratia sp. Z4 MK431391对实际生活污水好氧生物处理活性污泥混合液特性调控效果。具体方法为：从温州大学学生公寓化粪池采集生物污水，经沉淀后去上层污水，测定生活污水的理化性质（如图7）；模拟污水处理好氧反应池，活性污泥取自温州市瓯海区南片污水处理厂经驯化后使用，建立两套并行处理系统，共用一个进水箱，设置污泥混合液悬浮固体浓度为8000±500mg/L、水力停留时间为20h、曝气量3.0 L/min、污泥停留时间无限（试验期间不排泥）。设置A组不加菌悬液，B组每隔三天加入5%(v/v) Serratia sp. Z4 MK431391菌悬液，整个试验周期设置为15d，每隔48h取50ml污泥混合液提取可溶性微生物代谢产物（soluble microbial products，SMP）、胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS），并分别检测污泥混合液SMP组分蛋白质浓度（如图8 ）、多糖浓度（如图9），污泥混合液EPS蛋白质浓度（如图10）、多糖浓度（如图11）。
菌株Serratia sp. Z4 MK431391 (1.5ml冷冻管融化后菌液)接种于装有50ml LB培养基的250ml锥形瓶中，在25℃、150 r/min下培养24h进行菌种活化；然后按百分之五的体积分数转接于装有100 ml LB培养基的500 ml锥形瓶中，在25℃、150 r/min下培养24h，8000 r/min下离心10min后用无菌水洗涤菌体两次，然后用无菌水调配成OD600=0.999-1.000的菌悬液，按百分之五的体积分数比加入A组反应器混匀。
生活污水化学需氧量检测采用美国哈希DR1010COD快速消解分光光度法定量分析检测。
生活污水氨氮检测采用纳氏试剂比色法测定，执行国家标准GB/T7479—1987。
生活污水总氮检测采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，执行国家标准：GB/T11894—1989。
生活污水总磷检测采用钼酸铵分光光度法测定，执行国家标准：GB/T 11893—1989。
活性污泥混合液溶解性微生物代谢产物与胞外聚合物提取分离采用阳离子交换树脂法分层提取（袁冬琴,环境科学, 2012, 33(10): 3522-3528.）。取污泥混合液50mL，4000rpm、4℃、离心15min，取上清液过0.45µm滤膜，即得溶解性微生物代谢产物溶液。向残余污泥沉，加入EPS提取缓冲液（配方见图12）至50mL，20Khz、40w水浴超声10min使之混匀后，以70g/g VSS的量加入清洗好的阳离子交换树脂，4℃、200rpm搅拌2h，再以4℃、15500rpm离心20min，离心结束取上清液过0.45µm滤膜，即得胞外聚合物。
多糖检测采用苯酚-硫酸法测定（Dubois M，Analytical chemistry, 1956, 28(3): 350-356.）：取1mlSMP待测样品加入到10ml试管中，加入1ml 5%的苯酚溶液、5ml的浓硫酸，混匀，反应30min，波长490nm下测定吸光度，根据标准曲线计算多糖浓度。
蛋白质检测：采用改良型Lowry法蛋白质浓度测定试剂盒测定（购自上海生工生物科技有限公司），取200 µl 待测EPS溶液加入之微量离心管，加入1ml改良型lowry反应工作液，反应10min后，加入100μl Folin酚试剂，迅速混匀，室温下静置30 min，分光光度计上测各离心管中的A750值，根据标准曲线计算蛋白浓度。
由图8 和图9看出，原为持续性生物刺激添加Serratia sp. Z4 MK431391菌悬液可有效减少活性污泥混合液中可溶性微生物代谢产物的蛋白质和多糖组分的浓度，可溶性微生物代谢产物蛋白质下降1.80%~25.87%，多糖下降10.70%~32.57%；同时也可以减少胞外聚合物的蛋白质和多糖组分，胞外聚合物蛋白质下降1.72%~12.42%，多糖组分下降1.09%~9.01%。表明人工加入B组活性污泥的群体感应淬灭菌Serratia sp. Z4 MK431391能适应活性污泥环境生长并减少可溶性微生物代谢产物和胞外聚合物浓度。

Claims (6)

1.一种沙雷氏菌，其特征在于：其保藏编号为CGMCC NO.18654。
2.权利要求1所述的沙雷氏菌的应用，其特征在于：沙雷氏菌在降解群体感应信号分子C8-HSL中的应用，或在制备降解信号分子C8-HSL的产品中的应用，或在防治信号分子C8-HSL介导的EPS和SMP分泌中的应用，或在制备依赖信号分子C8-HSL的防治制剂的应用，或在防治信号分子C8-HSL介导的微生物群体感应的应用，或在制备依赖信号分子C8-HSL介导的群体感应淬灭制剂的应用，其中，C8-HSL指信号分子N-辛酰基-高丝氨酸内酯，EPS指微生物胞外聚合物，SMP指可溶性微生物代谢产物。
3.权利要求1所述的沙雷氏菌的应用，其特征在于：使用沙雷氏菌的菌悬液处理活性污泥。
4.权利要求1所述的沙雷氏菌的应用，其特征在于：制备防治膜生物反应器膜生物污染的生物制剂。
5.使用权利要求1所述的沙雷氏菌制备菌悬液的方法，其特征在于：将菌株划线于LB培养基或无机盐培养基固体平板上，30℃~35℃下培养20-28h，挑取单菌落接种于LB液体培养基或无机盐培养基中预培养至对数期，所得菌体用0.6-1.2%的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液，再将种子悬液按照体积比 0.5%~5%的接种量接种至LB液体培养基或无机盐培养基培养至对数期，菌体用PBS缓冲液重悬得到菌株的菌悬液。
6.根据权利要求5所述的沙雷氏菌制备菌悬液的方法，其特征在于：LB 培养基的配方为：胰蛋白胨9-11 g/L，酵母提取物 4.5-6.5 g/L，氯化钠9-11 g/L，pH 7.0~7.5，110-130℃灭菌 15-25 min，LB 固体培养基配方是在液体培养基中加入1.5%(w/v)的琼脂，即每10mlLB液体培养基加入0.1-0.2g琼脂粉，无机盐培养基基本组成：(NH4)2SO4 0.9-1.1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.15-0.25g/L、CaCl2 0.15-0.25g/L、NaH2PO4 0.4-0.6g/L、K2HPO4 0.4-0.6g/L、NaCl 0.15-0.25g/L、Fe2(SO4)3·7H2O 0.0005-0.0012g/L，pH 7.5，无机盐固体培养基配方是在液体培养基中加入1.5%(w/v)的琼脂。
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