CN103695358B - 一株海洋微小链霉菌及其在群体感应抑制方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株海洋微小链霉菌及其在群体感应抑制方面的应用。所述海洋微小链霉菌（Streptomyces parvulus）是HY026，它的保藏编号是CGMCC No.8493。本发明的微小链霉菌具有高效低毒的群体感应抑制活性及显著的抗肿瘤活性，其中一个活性组分在浓度为50μg/片时即有显著的群体感应抑制作用，在12.5μg/mL时对指示菌Chromobacterium.Violaceum12472紫色菌素的产生有显著抑制作用，其抑制率达64.9%，优于目前已报道的许多群体感应抑制活性物质或粗提物。该菌株活性成分的产量较大。有望应用于以群体感应系统为靶点的新型抗菌物质的开发。

Description

一株海洋微小链霉菌及其在群体感应抑制方面的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株海洋微小链霉菌及其在群体感应抑制方面的应用。

背景技术

群体感应（quorum-sensing，QS）是由Fuqua等在1994首先提出的，是细菌根据自身细胞密度变化进行自我调节的一种群体行为。

许多细菌能产生并释放一种被称为自诱导物(Auto Inducer，AI)的信号分子，随着细菌密度的增加，信号分子积累到一定浓度时则会与胞浆受体蛋白结合,调控细菌相关基因的表达，使细菌形成一种群体行为来有效地抵御环境压力、攻击宿主等(Antimicrobial AgentsChemotherapy,2000,44:640-646;Molecular Microbiology,2004,53:755-769)。在一些机会致病菌(如铜绿假单胞菌、聚团肠杆菌、粘质沙雷氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等)中，群体感应系统调控相关致病因子的产生，如促进毒素的产生、黏附、生物膜的形成等。大量文献表明，缺失了群体感应系统的菌株其致病能力大大降低。

细菌耐药性问题日趋严重，传统的抗菌药物容易使病原菌产生抗药性，要从根本上去除细菌的致病性还是要通过阻断或改变其致病过程中必须的通路，使致病基因无法表达，这样不仅消除了细菌的致病性，还确保了不会产生耐药性问题。对群体感应系统具有抑制作用的物质并不干扰细菌的蛋白质合成、细胞壁合成、DNA超螺旋形成等重要的生命过程，不会直接杀死病原菌，可作为抗感染药物研发的新靶标。通过研究细菌的群体感应体系，建立科学的筛选模型，找到具有抑制细菌群体感应活性的天然产物，是开发新型抗菌物质的有效途径。

海洋生境的特殊性，使生活于其中的海洋生物具有与陆生生物不同的生理性状和生理功能，并产生许多结构新颖、作用特殊的活性物质。有的具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒或降压降脂等医药活性功能，有的含有可用于工业用途的极端酶类（如耐高温酶、高压酶、低温酶、耐酸碱酶等）等等（Advance in Applied Microbiology,1997,43,57-90;Journal of Coastal Development,2004,7:109-118;Applied and Environmental Microbiology,2009,75:1838-1844。所以海洋生物成为陆地生物之后的一个最重要、最巨大的宝库，是目前功能生物开发、饵料开发、食品开发、药物开发、活性化合物开发、保健品开发等众多行业的重要资源。海洋微生物因其具有种类繁多，生长快速，易于规模发酵培养，代谢产物多样且活性代谢产物结构相对简单，易于化学合成等优势，使其极具医药、工业和军事价值。因此，从海洋微生物资源中寻找新型天然活性产物已成为目前国际上该领域的研究热点。

申请号为201010295829.0的中国专利申请公开了一种海洋中的链霉菌属菌株及其在群体感应抑制活性方面的，但该专利申请中没有报道具体的活性化合物。

发明内容

本发明的目的是提供一株群体感应抑制活性更高的海洋链霉菌菌株。

本发明从采自连云港海域海水样品中分离海洋放线菌，采用紫色杆菌模型对分离到的菌株进行群体感应抑制活性的筛选，找到一株具有高效群体感应抑制活性的菌株，滤纸片法初筛显示其发酵液粗提物在250μg/片时对指示菌有显著地抑制作用。通过16S rDNA序列分析结合形态特征将其鉴定为（Streptomyces parvulus）.HY026，其与genbank中一株链霉菌同源性达99.3%。对该菌株进行大量发酵并对发酵产物提取物作减压柱粗分离，发现其中一个活性组分在50μg/片时即有显著的群体感应抑制作用，在12.5μg/mL时对指示菌紫色素的产生有显著抑制作用，但在该浓度下对指示菌生长没有明显抑制作用。经LC-MS，NMR等方法初步鉴定该活性组分是以一个已知抗肿瘤活性化合物为主的混合物。该已知化合物尚无群体感应抑制活性方面的报道。采用MTT法检测该菌的抗肿瘤活性显示该菌提取物对人宫颈癌HeLa细胞的生长也具有显著的抑制活性。

本发明所述的微小链霉菌菌株，是HY026，它的保藏号是CGMCC No.8493。

本研究中分离得到的微小链霉菌具有高效低毒的群体感应抑制活性及显著的抗肿瘤活性，其中一个活性组分在浓度为50μg/片时即有显著的群体感应抑制作用，在12.5μg/mL时对指示菌Chromobacterium.Violaceum12472紫色菌素的产生有显著抑制作用，其抑制率达64.9%，优于目前已报道的许多群体感应抑制活性物质或粗提物。该菌株活性成分的产量较大，约40mg/L。有望应用于以群体感应系统为靶点的新型抗菌物质的开发。

与已有技术相比，本发明分离筛选到的活性链霉菌菌株与其不同，该菌株所产生的活性物质的群体感应抑制活性更高。申请号为201010295829.0的中国专利申请中所公开的一株海洋链霉菌Streptomycetes sp.HH-1的提取物在浓度为50mg/mL，100mg/mL，150mg/mL，200mg/mL时对紫色杆菌CV026紫色菌素的抑制率分别为25%，47%，65%和82%。

附图说明

图1.活性菌株HY026的系统发育树。

图2粗分纯样品F1-4在不同浓度下对紫色杆菌产紫色素的抑制情况。F25为阳性对照25μg/mL的呋喃酮。

图3粗分纯样品F1-4对紫色杆菌生长的影响。测试浓度为6.25和12.5，F25为阳性对照25μg/mL的呋喃酮，Control是溶剂对照DMSO。

本发明菌株HY026于2013年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），分类命名为微小链霉菌Streptomycesparvulus，保藏编号为CGMCC No.8493。

具体实施方式

实施例中涉及到的紫色杆菌Chromobacterium.Violaceum12472（Proceedings of the NationalAcadamy of Science USA.2003,100(20):11660–11665）由香港科技大学钱培元教授实验室提供。

样品采集：2011年10月从连云港海域采集上层海水和底泥样品，存放于无菌瓶中。

菌株HY026的分离与培养：将海水样品在55℃下水浴处理1h，梯度稀释后涂布接种到高氏一号固体培养基中，30℃培养，从第二天起每天观察菌落长出情况，挑取新长出的放线菌接种到新鲜的高氏一号固体培养基上纯化。将分离到的菌株46株菌株分别接种到高氏一号液体培养基中，30℃，140rpm振荡培养5天。离心去菌体，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取2次。有机相经旋转蒸发仪浓缩，得到各菌株粗提物样品、称重，待测。

群体感应抑制活性筛选（滤纸片法）：将过夜液体培养后的指示菌紫色杆菌Chromobacterium.Violaceum12472（能由于自身群体感应效应产生色素）涂布到固体培养基上，将250μg待测样品（上述46株菌株的各菌株粗提物）分别加入到无菌滤纸片上，待溶剂挥发后，将滤纸片反扣贴放于已涂布接种指示菌的因体培养基上。30℃培养1天后观察抑菌圈的形态。如果是透明的抑菌圈表明测试菌对报告菌的生长有抑制，如果是白色的抑菌圈则表明测试菌能抑制指示菌QS效应控制的色素产生，但不影响指示菌的生长。挑取少许白色抑菌圈内的琼脂接种到液体培养基中，振荡培养，观察指示菌是否可以生长并产紫色。若可以生长但不产紫色则表明白色抑菌圈内的细菌存活但不可逆的失去了产紫色素的能力，若能产紫色则表明该群体感应抑制效果为可逆的。滤纸片法初筛显示一菌株发酵液粗提物在250μg/片时对指示菌产紫色素有显著地抑制作用，抑制圈直径达11mm，该菌株命名为HY026。

菌株HY026的鉴定：SDS-CTAB法对菌株HY026的基因组DNA进行提取，交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序分析。测定了菌株6S rDNA序列的有效长度为1472bp1，将序列提交BLAST，与GenBank中其它菌株的16S rDNA序列进行同源性比对，应用MEGA软件，分析并构建系统进化树（见图1），发现菌株HY026与Streptomyces parvulus(T);NBRC13193（AB184326）的相似性达99.3%，结合菌落形态，将其鉴定为微小链霉菌Streptomyces parvulus HY026。

菌株HY026活性样品的粗提取：对菌株HY026进行大批量发酵，共45L，发酵液经乙酸乙酯-丙酮萃取，得到粗提物5.01g。采用固体上样，正相减压柱分离，氯仿甲醇梯度洗脱（30:1，20:1，15:1，10:1，5:1，0:100），氯仿甲醇30:1洗脱出来的组分F1经再次正相减压柱分离，氯仿甲醇梯度洗脱（100:0，80:1，60:1，40:1，30:1，20:1，15:1，0:100）。活性组分主要在F1-4中。

组分F1-4群体感应抑制活性的测试：采用色素抑制法对组分F1-4进行活性测试。具体方法为：将过夜培养的紫色杆菌菌液用牛肉膏蛋白胨培养基稀释至OD570=0.10，吸取1mL菌液到指形管中，同时加入经培养基适当稀释的原溶于DMSO中的组分F1-4，使其的终浓度为分别为6.25，12.5，25，50，100μg/mL，以终浓度25μg/mL的呋喃酮为阳性对照，不加样品仅加相应体积培养基和DMSO的为阴性对照，28℃、140rpm摇床培养24h后，将培养液14000rpm离心30min，去除上清液，加入0.5mL二甲基亚砜（DMSO），涡旋使菌体中的色素充分溶解其中，14000rpm再次离心10min，沉淀菌体及碎屑。测定上清液OD₅₇₀。根据公式计算抑制率。 $\mathrm{Inhibitionrate}(\%)\frac{{\mathrm{OD}}_{570\mathrm{control}}-{\mathrm{OD}}_{570\mathrm{sample}}}{{\mathrm{OD}}_{570\mathrm{control}}}\×200\%.$

实验结果显示（图2），组分F1-4在浓度为50μg/片时即有显著的群体感应抑制作用，其对紫色杆菌的产紫色素的抑制率为90.7%，在12.5μg/mL时对指示菌紫色素的产生亦有显著抑制作用，抑制率为64.9%，而阳性对照25μg/mL呋喃酮的抑制率为55.6%。

组分F1-4对紫色杆菌生长影响的测定：将指示菌过夜培养后，接种到含有12.5、25，50，100，200μg/mL/组分F1-4的液体培养基中，振荡培养，测定各处理在培养0、8、12、16、20、24、32、40h时的OD₆₀₀。结果显示（如图3），在浓度为6.25μg/mL/时组分F1-4对紫色杆菌的生长基本没有影响，在浓度为12.5μg/mL/时对指示菌生长亦影响不大，尤其是在培养的初期（前16小时）其影响小于阳性对照呋喃酮。

Claims (2)

1.一株海洋微小链霉菌（Streptomycesparvulus）HY026，它的保藏编号是CGMCC No.8493。

2.如权利要求1所述的海洋微小链霉菌（Streptomycesparvulus）HY026在群体感应抑制方面的应用。