CN107473980A - 一种酰胺类化合物在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用 - Google Patents

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CN107473980A CN201710749459.5A CN201710749459A CN107473980A CN 107473980 A CN107473980 A CN 107473980A CN 201710749459 A CN201710749459 A CN 201710749459A CN 107473980 A CN107473980 A CN 107473980A
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Abstract

本发明公开了一种酰胺类化合物在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用，利用太平洋杆菌XC22919发酵液分离纯化制备化合物2‑甲基‑N‑(2’‑苯乙基)丁酰胺和3‑甲基‑N‑(2’‑苯乙基)丁酰胺，在0～70μg/mL浓度范围内不抑制紫色杆菌CV026的菌体生长，但能显著的降低紫色杆菌紫色素的生成；并且随着浓度的逐渐增加，其抑制紫色素产生的作用越强；在0～100μg/mL的浓度范围内对铜绿假单胞菌PAO1的菌体生长不产生影响，但能显著的降低铜绿假单胞菌毒力因子的表达，能显著的降低绿脓素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶以及生物体膜等毒力因子的表达，且化合物抑制群体感应的作用呈浓度依懒性。

Description

一种酰胺类化合物在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种由海洋来源的太平洋杆菌XC22919(Oceanobacillussp.XC22919)经发酵培养分离纯化具有细菌群体感应抑制活性化合物、结构鉴定及其应用。
(二)背景技术
传统认为只有真核细胞之间才存在信息交流，低等微生物之间不存在。但是后来人们发现，细菌在生长繁殖过程中，也会根据环境的变化分泌一些特定的信号分子到周围环境中去，根据感应这些信号分子的变化来检测所处环境中自身或者其他微生物种群的变化情况，科学家们称这种信号分子为自诱导物(autoinducer,AI)。细菌不断地向外界分泌信号分子，在一定的时期达到一个阈值，细菌就会调整各自体内相关系统来应对这种生存环境的改变，这一调控系统被称为细菌群体感应系统。
随着抗生素大量的使用甚至滥用，临床上出现了广泛的耐药菌株。同时，在新型抗生素研究中也出现了难度增大、研发周期变长、作用效率低下和细菌产生耐药性的时间却越来越短等问题，使得细菌耐药性成为越来越严重的世界性难题。因此，为了克服这些问题，寻找可替代的新型抗菌物质、解决细菌耐药性问题已在研究界受到广泛的关注。目前研究抗菌的另一种策略是抗毒力策略，即在不抑制细菌生长的情况下，直接抑制细菌相关毒力因子的表达，使其降低或失去对宿主的伤害能力。近年来研究表明细菌毒力因子的表达很大程度上都是由细菌群体感应系统调控的。通过抑制细菌群体感应，能够降低细菌毒力因子的产生，抑制细菌群体感应系统的致病力，不易诱导耐药突变。这种群体感应抑制剂可以单独使用，也可以作为抗生素的辅助治疗剂达到防治细菌感染的目的。因此细菌群体感应抑制剂在防治细菌感染方面有关阔的应用前景。
A Proschak等从X.Nematophilus中分离得到了已知化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺并且验证了它具有微弱的细胞毒性，能够诱导细胞凋亡。Teasdale等从革兰氏阳性菌Halobacillussalinus中分离得到了化合物3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺，并证实其具有紫色杆菌CV026和发光哈氏弧菌群体感应抑制作用，但是并未验证其对铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制作用。本发明首次发现海洋杆菌XC22919(Oceanobacillussp.XC22919)(保藏编号为CGMCC NO.12612)液体发酵液的甲醇提取物具有降低紫色杆菌紫色素产生的作用，进而对其化学成分进行了研究。从中分离得到了这两种酰胺类化合物，并且首次研究化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺的对紫色杆菌和铜绿假单胞菌的群体感应抑制活性，以及化合物3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺对铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制作用。目前市场上尚未见到与此相关的药物。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种由太平洋杆菌XC22919(Oceanobacillus sp.XC22919)发酵分离纯化得到的具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌群体感应系统活性的化合物，该类化合物在不抑制致病菌菌体生长的范围内能够显著的降低相关致病因子的表达，降低细菌的毒力，可用于防治具有群体感应系统的细菌感染。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种式(1)所示酰胺类化合物在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用，所述细菌为紫色杆菌或铜绿假单胞菌；
式(1)中，R1＝CH3或H，R2＝H或CH3，且R1、R2不同时为H。
进一步，优选所述细菌为紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)CV026或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01。
本发明还提供一种式(1)所示酰胺类化合物的制备方法，所述式(1)所示酰胺类化合物按如下方法制备：
(1)将太平洋杆菌(Oceanobacillus sp)CGMCC NO.12612接种至LB海水液体培养基，在180rpm，30℃的恒温摇床中振荡培养3天，发酵完成后，发酵液8000rpm离心10min，弃去菌体，取上清液加入等体积的乙酸乙酯，在分液漏斗中振荡萃取3次，合并乙酸乙酯相并减压浓缩至干得到褐色粗提物；所述LB海水液体培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、海盐33.3g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；121℃，灭菌20min。
(2)化合物的分离纯化：将发酵所得粗提物用粒径为75-150μm MCI柱进行初步分离，以纯水(即去离子水)，纯水-甲醇体积比4:1，纯水-甲醇体积比3:2，纯水-甲醇体积比2:3，纯水-甲醇体积比1:4，纯甲醇依次洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，收集洗脱液纯水-甲醇体积比1:4的流出液，浓缩至干利用制备HPLC以水：甲醇＝45：55，v/v等度洗脱再次进行粗分，分别收集25～27.5min、27.5～29min、29～31min时的流份，并浓缩至干，(色谱柱：Phenomenex(USA,Luna 10u C18，250*21.2mm)；HPLC仪器型号：SHIMADZU LC-6AD；流动相：甲醇-水＝45：55，v/v；流速：5mL/min；检测波长：210nm；进样量1mL)，再利用半制备HPLC对29～31min段的浓缩物进行纯化，以水：甲醇＝45：55，v/v等度洗脱(色谱柱：Phenomenex(USA,Luna 5u C18，250*10mm)，流速：2.5mL/min，进样量200μL，其他条件同上)，分别收集25min后连续出现的两个峰，浓缩至干得到2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(R1＝CH3，R2＝H)和3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(R1＝H，R2＝CH3)。
进一步，太平洋杆菌(Oceanobacillus sp)CGMCC NO.12612发酵前还需要经过斜面和种子培养进行扩大：将太平洋杆菌XC22919(Oceanobacillus sp.XC22919)接种至斜面培养基(即：LB海水固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、海盐33.3g/L、琼脂18g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；121℃，灭菌20min)，在30℃恒温培养箱中培养过夜，获得斜面菌体；再将斜面菌体接种至种子培养基(即LB海水液体培养基，去除LB海水固体培养基中琼脂，其它相同)，在30℃恒温摇床中，180rpm振荡培养过夜，获得种子液；将种子液以体积浓度2.5％的接种量接种至LB海水液体培养基中进行发酵培养。
进一步，所述细菌群体感应活性抑制剂为紫色杆菌紫色素合成抑制剂。
进一步，所述细菌群体感应活性抑制剂为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA01群体感应系统调控的毒力因子合成抑制剂，所述毒力因子为绿脓素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶或生物体膜中一种或多种。
本发明所述太平洋杆菌XC22919(Oceanobacillus sp.XC22919)，于2016年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12612，已在专利申请2016111721915中公开。本发明所述式(1)所示酰胺类化合物分别为2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(R1＝CH3，R2＝H)和3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(R1＝H，R2＝CH3)，分子式为C13H19NO。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明提供一种酰胺类化合物的新制备方法，该方法利用太平洋杆菌XC22919发酵液分离纯化制备化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺和3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺，所涉及的太平洋杆菌XC22919菌株具有发酵培养条件可控、代谢产物产量稳定、化合物制备工艺过程简便的优点，同时所得化合物对群体感应抑制作用明显，并且环境友好。本发明涉及的酰胺类化合物具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌感染的作用；该类化合物在0～70μg/mL浓度范围内不抑制紫色杆菌CV026的菌体生长，但能显著的降低紫色杆菌紫色素的生成；并且随着浓度的逐渐增加，其抑制紫色素产生的作用越强；化合物抑制群体感应的作用呈浓度依懒性，能够用于研发新型抗菌先导药物来防治紫色杆菌引起的感染疾病。该类化合物在0～100μg/mL的浓度范围内对铜绿假单胞菌PAO1的菌体生长不产生影响，但能显著的降低铜绿假单胞菌毒力因子的表达，能显著的降低绿脓素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶以及生物体膜等毒力因子的表达，且化合物抑制群体感应的作用呈浓度依懒性，能够用于研发新型抗菌先导药物来防治铜绿假单胞菌引起的感染疾病。
(四)附图说明
图1为两种酰胺类化合物对紫色杆菌生长的影响；
图2为两种酰胺类化合物对紫色杆菌紫色素产量的影响；
图3为两种酰胺类化合物对铜绿假单胞菌生长的影响；
图4为两种酰胺类化合物对铜绿假单胞菌绿脓菌素产量的影响；
图5为两种酰胺类化合物对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的影响；
图6为两种酰胺类化合物对铜绿假单胞菌蛋白水解酶的影响；
图7为两种酰胺类化合物对铜绿假单胞菌生物体膜形成的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1活性化合物的纯化及结构鉴定
(1)粗提物制备：将太平洋杆菌XC22919(Oceanobacillus sp.XC22919)接种至斜面培养基(即：LB海水固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、海盐33.3g/L、琼脂18g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；121℃，灭菌20min)，在30℃恒温培养箱中培养过夜，获得斜面菌体；再将斜面菌体接种至种子培养基(即LB海水液体培养基，将LB海水固体培养基中琼脂去除，其它相同)，在30℃恒温摇床中，180rpm振荡培养过夜，获得种子液；将种子液以体积浓度2.5％的接种量接种至LB海水液体培养基中(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、海盐33.3g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；121℃，灭菌20min)进行发酵培养，在180rpm，30℃的恒温摇床中振荡培养3天。发酵完成后，发酵液8000rpm离心10min，弃去菌体，取上清液加入等体积的乙酸乙酯，在分液漏斗中振荡萃取3次，将乙酸乙酯相减压浓缩至干，得到褐色粗提物。
(2)化合物的分离纯化：将发酵所得褐色粗提物用粒径为75-150μm MCI柱进行初步分离。以纯水(即去离子水)，纯水-甲醇(4:1，v/v)，纯水-甲醇(3:2，v/v)，纯水-甲醇(2:3，v/v)，纯水-甲醇(1:4，v/v)，纯甲醇依次洗脱，以每个梯度洗脱两个柱体积，收集各个流份，分别标记为A、B、C、D、E、F段。浓缩至干后，将浓缩后的各组分称重，以甲醇溶解成50mg/ml的溶液，用群体感应筛选模型检测各流份活性，具体操作：将活化的紫色杆菌ATCC 12472菌种接种到LB液体培养基中(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；121℃，灭菌20min。)30℃，180rpm过夜培养，获得C.violaceum ATCC 12472菌液，备用。将15ml融化的LB固体培养基冷却至40℃，加入100μL过夜培养的C.violaceumATCC 12472菌液，混匀后倒在新鲜LB平板上成双层平板。待平板凝固后，于30℃恒温培养箱培养1h。将培养好的平板用打孔器打孔，每个孔内分别加入得到的各个流份(A、B、C、D、E、F段)的50mg/ml甲醇溶液20μL(每孔1mg)，并由10μL甲醇作为阴性对照，三个平行平板，排除偶然误差因素。放入30℃恒温培养箱中培养24h，观察实验结果。若菌液具有群体感应抑制活性，则加样孔周围应有浑浊但不透明的圆圈，圆圈直径越大即为活性越强。具有群体感应抑制活性的E段利用制备HPLC以水：甲醇＝45：55，v/v等度洗脱，并收集25～27.5min、27.5～29min、29～31min的流份，分别命名为801、802、803段(色谱柱：Phenomenex(USA,Luna10u C18，250*21.2mm)；HPLC仪器型号：SHIMADZU LC-6AD；流动相：甲醇-水；流速：5mL/min；检测波长：210nm；进样量1mL)，再次进行活性验证。利用半制备HPLC将活性段803减压浓缩后以水：甲醇＝45：55，v/v等度洗脱进行纯化(色谱柱：Phenomenex(USA,Luna 5u C18，250*10mm)，流速：2.5mL/min，进样量200μL，其他条件同上)，分别收集25min后连续出现的两个峰，浓缩至干得到酰胺类单体化合物1和化合物2。
(3)化合物的结构鉴定：利用核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)对化合物进行结构鉴定。将核磁共振谱信号进行汇总1H-NMR(500MHz，CDCl3)、13C-NMR(500MHz，CDCl3)通过波谱解析推测及文献对比化合物1和化合物2分别为2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺和3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺，分子量为205，分子式为C13H19NO，化学结构式如下：
式1：2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺
式2：3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺
表1化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺的NMR核磁数据和归属
表2化合物3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺的NMR核磁数据和归属
实施例2两种酰胺类化合物抑制紫色杆菌CV026群体感应活性测试
(1)实验方法：将含有外源信号分子紫色杆菌(Chromobacterium violaceum，获赠于美国罗德岛大学David C.Rowley教授)CV026接种至LB液体培养基中，30℃过夜培养，获得紫色杆菌CV026菌液。
将紫色杆菌CV026菌液用新鲜LB液体培养基以体积比1:100稀释后，每瓶10mL。分别加入不同终浓度(0、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL)的单体化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)和3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)，以甲醇作为阴性对照。将其置于30℃，150rpm摇床约18h，取1mL菌液，12000rpm第一次离心10min，弃上清，加入1mLDMSO，漩涡震荡使紫色菌素完全溶解，8000rpm第二次离心10min，吸取上清液检测585nm的吸光度OD585，第二次离心获得的沉淀，加入1ml的无菌水重新悬浮菌体，取悬浮液测600nm的吸光度OD600，以表征菌体生长密度的变化。
(2)实验结果：以化合物浓度为横坐标，以600nm处的光吸收度为纵坐标，绘制紫色杆菌CV026在化合物作用下24h的菌体生长曲线(图1，两种化合物在0～70μg/ml浓度范围内对紫色杆菌CV026的生长都不产生影响；以化合物浓度为横坐标，以585nm处的光吸收度为纵坐标，绘制紫色杆菌CV026在化合物作用下24h的紫色杆菌紫色素的产量及抑制率(图2)，两种化合物在0～70μg/ml浓度范围内能显著的降低紫色杆菌紫色素的产量，且随着浓度的增加，降低紫色杆菌紫色素产量的作用越明显，呈浓度依赖性，化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺的最大抑制率达到55.8％，化合物3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺的最大抑制率为55.7％。
实施例3两种酰胺类化合物对铜绿假单胞菌PAO1生长及绿脓菌素产量的影响
(1)实验方法：将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1接种至LB培养基中，37℃过夜培养，获得铜绿假单胞菌PAO1菌液。
将铜绿假单胞菌PAO1菌液用新鲜PB液体培养基(蛋白胨20g/L，氯化镁1.4g/L,硫酸钾10g/L，溶剂为去离子水，pH自然；121℃，灭菌20min)以体积比1:100比例稀释后，每瓶10mL。分别加入不同终浓度(0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL)的单体化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)和3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)，以甲醇作为阴性对照。将其置于37℃，150rpm摇床约24h。取6mL菌液，加入3mL氯仿进行抽提；抽提后，氯仿层显蓝色，将其转入新的离心管中，并加入1mL 0.2mol/L的盐酸混合反应，反应后显粉红色；充分混合后，离心收集上层水相；于OD520测定水相吸光值，不同浓度化合物作用下过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液用新鲜的PB培养基稀释100倍，通过测定OD600，来检测菌体密度。
(2)实验结果：以化合物浓度为横坐标，以600nm处的光吸收度为纵坐标，绘制铜绿假单胞菌PAO1在化合物作用下24h的菌体生长曲线(图3)，两种化合物在0～100μg/ml浓度范围内对PAO1的生长不产生影响；以化合物浓度为横坐标，以520nm处的光吸收度为纵坐标，绘制铜绿假单胞菌PAO1在该化合物作用下24h绿脓菌素的产量及抑制率(图4)，两种化合物在0～100μg/ml浓度范围内能显著的降低铜绿假单胞菌绿脓素的产量，且随着浓度的增加，降低铜绿假单胞菌绿脓素的作用越明显，呈浓度依赖性，化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺的最大抑制率达到50.8％，化合物3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺的最大抑制率达到90.6％。
实施例4两种酰胺类化合物对铜绿假单胞菌PAO1弹性蛋白酶的抑制
(1)实验方法：将过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液(同实施例3)用新鲜PB液体培养基(同实施例3)以体积比1:100比例稀释后，每瓶10mL。分别加入不同终浓度(0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL)的单体化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)和3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)，以甲醇作为阴性对照。将其置于37℃，150rpm摇床约24h。将菌液于4℃、12000rpm离心10min，吸取上清液，并用一次性滤器(0.22μm)过滤除菌，获得细菌上清液。在1mL EP管中加入2mg底物弹性蛋白酶-刚果红(Elastin-Congo Red，ECR)和900μL反应缓冲液(0.1MTris-HCL/1mM CaCl2，pH 7.2)，并加入100μL细菌上清液，于37℃摇床振荡反应4h。加入100μL 0.12mol/L的EDTA终止反应，并将反应物置于冰上5min，于4℃、12000rpm离心10min，去除不可溶的ECR；上清液在OD495处读取吸光度，
(2)实验结果：如图5，在不抑制PAO1生长的浓度范围内，当化合物浓度在100μg/mL时，化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺对PAO1弹性蛋白酶的抑制达到最大值26.8％，化合物3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺对PAO1弹性蛋白酶的抑制达到最大值16.9％。
实施例5两种酰胺类化合物对铜绿假单胞菌PAO1蛋白水解酶的抑制
(1)实验方法：将过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液(同实施例3)用新鲜PB液体培养基以体积比1:100比例稀释后，每瓶10mL。分别加入不同终浓度(0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL)的单体化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)和3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)，以甲醇作为阴性对照。将其置于37℃恒温摇床中200rpm培养12h。将菌液离心除去菌体，上清液用0.22μm滤膜过滤，获得细菌上清液。取150μL细菌上清液并加入1mL 0.3％的偶氮酪蛋白溶液(以磷酸盐缓冲液PBS配制，操作无菌条件下进行，并在4℃冰箱中稳定2～3d备用)。在37℃下恒温培养箱反应15min，12000rpm离心5min，结束后通过加入三氯乙酸终止反应(10％，0.5mL)，离心，取出上清液，在OD440处读取吸光度，
(2)实验结果：如图6，在不抑制PAO1生长的浓度范围内，当化合物浓度在100μg/mL时，化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺对PAO1蛋白水解酶的抑制达到最大值28.3％，化合物3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺对PAO1蛋白水解酶的抑制率达到最大值28.8％。
实施例6两种酰胺类化合物对铜绿假单胞菌PAO1生物体膜形成的影响
(1)实验方法：将单体化合物(2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺、3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺)分别用甲醇稀释成10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL的溶液。将过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液(同实施例3)用新鲜LB液体培养基按体积比1:100的比例稀释。取190μL菌液至96孔板并加入不同浓度的单体化合物溶液10μL，以10μL甲醇作阴性对照。37℃恒温摇床中200rpm培养24h后除去上层细菌，贴壁细胞用去离子水轻轻漂洗2次。风干后加入200μL的0.2％结晶紫(结晶紫0.2g溶于10mL 95％乙醇中，将90mL 1％草酸铵水溶液与之混匀，放置24h后过滤即成)。染色15min后再用去离子水轻轻漂洗2次，最后用200μL 95％乙醇溶解色素。生物体膜含量用OD650处吸光度表示，
(2)实验结果：如图7，在不抑制PAO1生长的浓度范围内，当化合物浓度在100μg/mL时，化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺对PAO1生物体膜的抑制率达到50.5％，化合物3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺对PAO1生物体膜的抑制率达到42.2％，两种酰胺类化合物对铜绿假单胞菌PAO1生物体膜具有较好的抑制作用。
结论：两种酰胺类化合物2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺和3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺能够明显地抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌的群体感应活性，具有较好的群体感应抑制潜力，可作为先导化合物用于新型抗菌药物的研究以及治疗耐药性细菌引起的感染。

Claims (5)

1.一种式(1)所示酰胺类化合物在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用，其特征在于所述细菌为紫色杆菌或铜绿假单胞菌；
式(1)中，R1＝CH3或H，R2＝H或CH3，且R1、R2不同时为H。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述细菌为紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)CV026或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述式(1)所示酰胺类化合物按如下方法制备：(1)将太平洋杆菌(Oceanobacillus sp)CGMCC NO.12612接种至LB海水液体培养基，在180rpm，30℃的恒温摇床中振荡培养3天，发酵完成后，发酵液8000rpm离心10min，弃去菌体，取上清液加入等体积的乙酸乙酯，振荡萃取，取乙酸乙酯相并减压浓缩至干得到褐色粗提物；所述LB海水液体培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、海盐33.3g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；
(2)化合物的分离纯化：将发酵所得褐色粗提物用粒径为75-150μm MCI柱进行初步分离，以纯水，纯水-甲醇体积比4:1，纯水-甲醇体积比3:2，纯水-甲醇体积比2:3，纯水-甲醇体积比1:4，纯甲醇依次洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，收集洗脱液纯水-甲醇体积比1:4的流出液，浓缩至干利用制备HPLC以体积比45：55的水：甲醇进行等度洗脱再次粗分，分别收集25～27.5min、27.5～29min、29～31min时的流份，并分别浓缩至干，再利用半制备HPLC对29～31min段的浓缩物进行纯化，以体积比45：55的水：甲醇等度洗脱，收集25min后连续出现的两个峰，浓缩至干分别得到2-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺和3-甲基-N-(2’-苯乙基)丁酰胺。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述细菌群体感应活性抑制剂为紫色杆菌紫色素合成抑制剂。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述细菌群体感应活性抑制剂为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01群体感应系统调控的毒力因子合成抑制剂，所述毒力因子为绿脓素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶或生物体膜中一种或多种。
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