CN107630048A

CN107630048A - 一种苯甲酸苄酯在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用

Info

Publication number: CN107630048A
Application number: CN201710749428.XA
Authority: CN
Inventors: 王鸿; 严银春; 陈小春; 陈建伟; 章华伟
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2017-08-28
Filing date: 2017-08-28
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2037-08-28
Also published as: CN107630048B

Abstract

本发明公开了一种苯甲酸苄酯在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用，该方法利用太平洋杆菌XC22919发酵产物分离提取，在0～60μg/mL浓度范围内不抑制紫色杆菌CV026的菌体生长，但能显著的降低紫色杆菌紫色素的生成；并且随着浓度的逐渐增加，其抑制紫色素产生的作用越强；化合物抑制群体感应的作用呈浓度依懒性。在0～100μg/mL的浓度范围内对铜绿假单胞菌PAO1的菌体生长不产生影响，但能显著的降低铜绿假单胞菌毒力因子的表达，能显著的降低绿脓素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶以及生物体膜等毒力因子的表达，且化合物抑制群体感应的作用呈浓度依懒性。

Description

一种苯甲酸苄酯在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种由海洋来源的海洋杆菌XC22919(Oceanobacillus sp.XC22919)经发酵培养分离纯化具有细菌群体感应抑制活性化合物、结构鉴定及其应用。

(二)背景技术

传统认为只有真核细胞之间才存在信息交流，低等微生物之间不存在。但是后来人们发现，细菌在生长繁殖过程中，也会根据环境的变化分泌一些特定的信号分子到周围环境中去，根据感应这些信号分子的变化来检测所处环境中自身或者其他微生物种群的变化情况，科学家们称这种信号分子为自诱导物(autoinducer,AI)。细菌不断地向外界分泌信号分子，在一定的时期达到一个阈值，细菌就会调整各自体内相关系统来应对这种生存环境的改变，这一调控系统被称为细菌群体感应系统。

随着抗生素大量的使用甚至滥用，临床上出现了广泛的耐药菌株。同时，在新型抗生素研究中也出现了难度增大、研发周期变长、作用效率低下和细菌产生耐药性的时间却越来越短等问题，使得细菌耐药性成为越来越严重的世界性难题。因此，为了克服这些问题，寻找可替代的新型抗菌物质、解决细菌耐药性问题已在研究界受到广泛的关注。目前研究抗菌的另一种策略是抗毒力策略，即在不抑制细菌生长的情况下，直接抑制细菌相关毒力因子的表达，使其降低或失去对宿主的伤害能力。近年来研究表明细菌毒力因子的表达很大程度上都是由细菌群体感应系统调控的。通过抑制细菌群体感应，能够降低细菌毒力因子的产生，抑制细菌群体感应系统的致病力，不易诱导耐药突变。这种群体感应抑制剂可以单独使用，也可以作为抗生素的辅助治疗剂达到防治细菌感染的目的。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的机会致病菌，其群体感应系统包括基于AHL信号分子的las系统和rhl系统外，还包括以2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(PQS)为信号分子的假单胞喹诺酮信号系统。铜绿假单胞菌多种致病毒力均受到群体感应调控。紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)群体感应信号分子属于高丝氨酸内酯类，其可以调控次生代谢产物紫色菌素等毒力因子的合成，因此，对细菌的感染能力具有重要的调控作用。其他动植物病原如弧菌、农杆菌都具有群体感应系统。

目前发现细菌群体感应调控病原菌的胞外蛋白酶(如弹性蛋白酶)、毒素(如绿脓菌素)、鼠李糖脂等多种致病因子的表达，并调控造成细菌耐药的生物被膜形成有关，并能调控病原菌的运动行为能力。通过抑制细菌的群体感应，也抑制这些细菌群体感应系统调控的毒力，降低细菌对于宿主的危害，达到预治或辅助抗生素治疗细菌感染的目的。因此细菌群体感应抑制剂是在防治细菌感染方面有广阔的应用前景。

L.P.Candido等的研究证明苯甲酸苄酯对小麦胚芽鞘生长具有很高的抑制活性。根据市场调查，苯甲酸苄酯也用作人造麝香、香兰素等香料的溶剂，花香型香精的定香剂及依兰等香精的调合香料。本发明首次发现太平洋杆菌XC22919(Oceanobacillussp.XC22919)(保藏编号为CGMCC NO.12612)液体发酵的甲醇提取物具有降低紫色杆菌紫色素产生的作用，进而对其化学成分进行了研究，从中分离得到了苯甲酸苄酯，并且首次研究它的群体感应抑制活性。目前未见该化合物具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌群体感应活性的报道，因此市场上也尚未见到与此相关的药物。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种由海洋杆菌XC22919(Oceanobacillus sp.XC22919)发酵分离纯化得到的具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌群体感应系统活性的化合物，该类化合物在不抑制致病菌菌体生长的范围内能够显著的降低相关致病因子的表达，降低细菌的毒力，可用于防治具有群体感应系统的细菌感染。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种苯甲酸苄酯在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用，所述细菌为紫色杆菌或铜绿假单胞菌，更优选为紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)CV026或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01。

本发明所述苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)，分子式为C₁₄H₁₂O₂，化学结构式如下：

本发明还提供一种苯甲酸苄酯的制备方法，所述苯甲酸苄酯按如下方法制备：(1)将海洋杆菌(Oceanobacillus sp)CGMCC NO.12612接种至LB海水液体培养基，在180rpm，30℃的恒温摇床中振荡培养3天，发酵完成后，发酵液8000rpm离心10min，弃去菌体，取上清液加入等体积的乙酸乙酯，在分液漏斗中振荡萃取3次，合并乙酸乙酯相并减压浓缩至干得到褐色粗提物；所述LB海水液体培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、海盐33.3g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；121℃，灭菌20min。

(2)化合物的分离纯化：将发酵所得粗提物用粒径为75-150μm MCI柱进行初步分离，以纯水(即去离子水)，纯水-甲醇体积比4:1，纯水-甲醇体积比3:2，纯水-甲醇体积比2:3，纯水-甲醇体积比1:4，纯甲醇依次洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，收集洗脱液纯甲醇的流出液，浓缩至干，利用高效液相制备系统制备HPLC以水：甲醇＝40：60，v/v等度洗脱(色谱柱：Phenomenex(USA,Luna 10u C18，250*21.2mm)；HPLC仪器型号：SHIMADZU LC-6AD；流动相：甲醇-水；流速：5mL/min；检测波长：210nm；进样量1mL)纯化，收集大约35min(34-36min)出现的峰，并浓缩至干得到所述苯甲酸苄酯。

进一步，太平洋杆菌(Oceanobacillus sp)CGMCC NO.12612发酵前还需要经过斜面和种子培养进行扩大：将太平洋杆菌XC22919(Oceanobacillus sp.XC22919)接种至斜面培养基(即：LB海水固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、海盐33.3g/L、琼脂18g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；121℃，灭菌20min)，在30℃恒温培养箱中培养过夜，获得斜面菌体；再将斜面菌体接种至种子培养基(即LB海水液体培养基，去除LB海水固体培养基中的琼脂，其它相同)，在30℃恒温摇床中，180rpm振荡培养过夜，获得种子液；将种子液以体积浓度2.5％的接种量接种至LB海水液体培养基中进行发酵培养。

进一步，所述细菌群体感应活性抑制剂为紫色杆菌紫色素合成抑制剂。

进一步，所述细菌群体感应活性抑制剂为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA01群体感应系统调控的毒力因子合成抑制剂，所述毒力因子为绿脓素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶或生物体膜中一种或多种。

本发明所述海洋杆菌XC22919(Oceanobacillus sp.XC22919)，于2016年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12612，已在专利申请2016111721915中公开。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明提供了一种苯甲酸苄酯的新制备方法，该方法利用太平洋杆菌XC22919(Oceanobacillus sp.XC22919)发酵产物分离提取，而所述海洋杆菌XC22919具有发酵培养条件可控、代谢产物产量稳定、化合物制备工艺过程简便的优点，同时所得化合物对群体感应抑制作用明显，并且环境友好。本发明分离得到的苯甲酸苄酯具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌感染的作用；该化合物在0～60μg/mL浓度范围内不抑制紫色杆菌CV026的菌体生长，但能显著的降低紫色杆菌紫色素的生成；并且随着浓度的逐渐增加，其抑制紫色素产生的作用越强；化合物抑制群体感应的作用呈浓度依懒性，能够用于研发新型抗菌先导药物来防治紫色杆菌引起的感染疾病。该化合物在0～100μg/mL的浓度范围内对铜绿假单胞菌PAO1的菌体生长不产生影响，但能显著的降低铜绿假单胞菌毒力因子的表达，能显著的降低绿脓素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶以及生物体膜等毒力因子的表达，且化合物抑制群体感应的作用呈浓度依懒性，能够用于研发新型抗菌先导药物来防治铜绿假单胞菌引起的感染疾病。

(四)附图说明

图1为苯甲酸苄酯对紫色杆菌生长的影响；

图2为苯甲酸苄酯对紫色杆菌紫色素产量的影响；

图3为苯甲酸苄酯对铜绿假单胞菌生长的影响；

图4为苯甲酸苄酯对铜绿假单胞菌绿脓菌素产量的影响；

图5为苯甲酸苄酯对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的影响；

图6为苯甲酸苄酯对铜绿假单胞菌蛋白水解酶的影响；

图7为苯甲酸苄酯对铜绿假单胞菌生物体膜形成的影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1苯甲酸苄酯的纯化及结构鉴定

(1)粗提物制备：将太平洋杆菌XC22919(Oceanobacillus sp.XC22919)接种至斜面培养基(即：LB海水固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、海盐33.3g/L、琼脂18g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；121℃，灭菌20min)，在30℃恒温培养箱中培养过夜，获得斜面菌体；再将斜面菌体接种至种子培养基(即LB海水液体培养基，将LB海水固体培养基中的琼脂去除，其它相同)，在30℃恒温摇床中，180rpm振荡培养过夜，获得种子液；将种子液以体积浓度2.5％的接种量接种至LB海水液体培养基中(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、海盐33.3g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；121℃，灭菌20min)，在180rpm，30℃的恒温摇床中振荡培养3天。发酵完成后，发酵液8000rpm离心10min，弃去菌体，取上清液加入等体积的乙酸乙酯，在分液漏斗中振荡萃取3次，将乙酸乙酯相减压浓缩至干得到褐色粗提物。

(2)化合物的分离纯化：将发酵所得褐色粗提物用粒径为75-150μm MCI柱进行初步分离。以纯水(即去离子水)，纯水-甲醇(4:1，v/v)，纯水-甲醇(3:2，v/v)，纯水-甲醇(2:3，v/v)，纯水-甲醇(1:4，v/v)，纯甲醇依次洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，收集各个流份，分别标记为A、B、C、D、E、F段。分别浓缩至干，将浓缩后的各组分称重，以甲醇溶解成50mg/ml的溶液，用群体感应筛选模型检测各流份活性，具体操作：将活化的紫色杆菌ATCC 12472菌种接种到LB液体培养基中(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；121℃，灭菌20min。)30℃，180rpm过夜培养，获得C.violaceum ATCC 12472菌液，备用。将15ml融化的LB固体培养基冷却至40℃，加入100μL过夜培养的C.violaceum ATCC12472菌液，混匀后倒在新鲜LB平板上成双层平板。待平板凝固后，于30℃恒温培养箱培养1h。将培养好的平板用打孔器打孔，每个孔内分别加入得到的各个流份的甲醇溶液20μL(每孔1mg)，并由10μL甲醇作为阴性对照，三个平行平板，排除偶然误差因素。放入30℃恒温培养箱中培养24h，观察实验结果。若菌液具有群体感应抑制活性，则加样孔周围应有浑浊但不透明的圆圈，圆圈直径越大即为活性越强。减压浓缩后，具有群体感应抑制活性的F段利用高效液相制备系统制备HPLC以水：甲醇＝40：60，v/v等度洗脱(色谱柱：Phenomenex(USA,Luna 10u C18，250*21.2mm)；HPLC仪器型号：SHIMADZU LC-6AD；流动相：甲醇-水；流速：5mL/min；检测波长：210nm；进样量1mL)进行纯化，收集大约35min(即34-36min)出现的峰，并浓缩至干得到化合物。

(3)化合物的结构鉴定：利用核磁共振(¹H-NMR、¹³C-NMR)对化合物进行结构鉴定。将核磁共振谱信号进行汇总¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)、¹³C-NMR(500MHz，CDCl₃)通过波谱解析推测及文献对比化合物为苯甲酸苄酯，分子量为212，分子式为C₁₄H₁₂O₂，化学结构式如下：

表1苯甲酸苄酯的NMR核磁数据和归属

实施例2苯甲酸苄酯对抑制紫色色杆菌生长及紫色色素产生的影响

(1)实验方法：将含有外源信号分子紫色杆菌(Chromobacterium violaceum，获赠于美国罗德岛大学David C.Rowley教授CV026接种至LB液体培养基中，30℃过夜培养，获得紫色杆菌CV026菌液。

将紫色杆菌CV026菌液用新鲜LB液体培养基以体积比1:100稀释后，每瓶10mL。分别加入不同终浓度(0、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL)的苯甲酸苄酯(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)，以甲醇作为阴性对照。将其置于30℃，150rpm摇床约18h，取1mL菌液，12000rpm第一次离心10min，弃上清，加入1mL DMSO，漩涡震荡使紫色菌素完全溶解，8000rpm第二次离心10min，吸取上清液检测585nm的吸光度OD₅₈₅，第二次离心获得的沉淀，加入1ml的无菌水重新悬浮菌体，取悬浮液测600nm的吸光度OD₆₀₀，以表征菌体生长密度的变化。

(2)实验结果：以苯甲酸苄酯浓度为横坐标，以600nm处的光吸收度为纵坐标，绘制紫色杆菌CV026在苯甲酸苄酯作用下24h的菌体生长曲线(图1，该化合物在0～60μg/ml浓度范围内对紫色杆菌CV026的生长都不产生影响；以化合物浓度为横坐标，以585nm处的光吸收度为纵坐标，绘制紫色杆菌CV026在化合物作用下24h的紫色杆菌紫色素的产量及抑制率(图2)，该化合物在0～60μg/ml浓度范围内能显著的降低紫色杆菌紫色素的产量，且随着浓度的增加，降低紫色杆菌紫色素产量的作用越明显，呈浓度依赖性，最大抑制率达到94.1％，具有较好的群体感应抑制潜力。

实施例3苯甲酸苄酯对铜绿假单胞菌PAO1生长及绿脓菌素产量的影响

(1)实验方法：将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1接种至LB培养基中，37℃过夜培养，获得铜绿假单胞菌PAO1菌液。

将铜绿假单胞菌PAO1菌液用新鲜PB液体培养基(蛋白胨20g/L，氯化镁1.4g/L,硫酸钾10g/L，溶剂为去离子水，pH自然；121℃，灭菌20min)以体积比1:100比例稀释后，每瓶10mL。分别加入不同终浓度(0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL)的苯甲酸苄酯(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)，以甲醇作为阴性对照。将其置于37℃，150rpm摇床约24h。取6mL菌液，加入3mL氯仿进行抽提；抽提后，氯仿层显蓝色，将其转入新的离心管中，并加入1mL 0.2mol/L的盐酸混合反应，反应后显粉红色；充分混合后，离心收集上层水相；于OD₅₂₀测定水相吸光值，不同浓度化合物作用下过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液用新鲜的PB培养基稀释100倍，通过测定OD₆₀₀，来检测菌体密度。

(2)实验结果：以化合物浓度为横坐标，以600nm处的光吸收度为纵坐标，绘制铜绿假单胞菌PAO1在化合物作用下24h的菌体生长曲线(图3)，该化合物在0～100μg/ml浓度范围内对PAO1的生长不产生影响；以化合物浓度为横坐标，以520nm处的光吸收度为纵坐标，绘制铜绿假单胞菌PAO1在该化合物作用下24h绿脓菌素的产量及抑制率(图4)，该化合物在0～100μg/ml浓度范围内能显著的降低铜绿假单胞菌绿脓素的产量，且随着浓度的增加，降低铜绿假单胞菌绿脓素的作用越明显，呈浓度依赖性，最大抑制率达到98％。

实施例4苯甲酸苄酯对铜绿假单胞菌PAO1弹性蛋白酶的抑制

(1)实验方法：将过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液(同实施例3)用新鲜PB液体培养基(同实施例3)以体积比1:100比例稀释后，每瓶10mL。分别加入不同终浓度(0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL)的苯甲酸苄酯(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)，以甲醇作为阴性对照。将其置于37℃，150rpm摇床约24h。将菌液于4℃、12000rpm离心10min，吸取上清液，并用一次性滤器(0.22μm)过滤除菌，获得细菌上清液。在1mL EP管中加入2mg底物弹性蛋白酶-刚果红(Elastin-Congo Red，ECR)和900μL反应缓冲液(0.1M Tris-HCL/1mM CaCl₂，pH 7.2)，并加入100μL细菌上清液，于37℃摇床振荡反应4h。加入100μL0.12mol/L的EDTA终止反应，并将反应物置于冰上5min，于4℃、12000rpm离心10min，去除不可溶的ECR；上清液在OD₄₉₅处读取吸光度，

(2)实验结果：如图5，在不抑制PAO1生长的浓度范围内，当化合物浓度在100μg/mL时，苯甲酸苄酯对PAO1弹性蛋白酶的抑制达到最大值11.8％。

实施例5苯甲酸苄酯对铜绿假单胞菌PAO1蛋白水解酶的抑制

(1)实验方法：将过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液(同实施例3)用新鲜PB液体培养基以体积比1:100比例稀释后，每瓶10mL。分别加入不同终浓度(0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL)的苯甲酸苄酯(以50mg/mL甲醇溶液的形式加入)，以甲醇作为阴性对照。将其置于37℃恒温摇床中200rpm培养12h。将菌液离心除去菌体，上清液用0.22μm滤膜过滤，获得细菌上清液。取150μL细菌上清液并加入1mL 0.3％的偶氮酪蛋白溶液(以磷酸盐缓冲液PBS配制，操作无菌条件下进行，并在4℃冰箱中稳定2～3d备用)。在37℃下恒温培养箱反应15min，12000rpm离心5min，结束后通过加入三氯乙酸终止反应(10％，0.5mL)，离心，取出上清液，在OD₄₄₀处读取吸光度，

(2)实验结果：如图6，在不抑制PAO1生长的浓度范围内，当化合物浓度在100μg/mL时，苯甲酸苄酯对PAO1蛋白水解酶的抑制达到最大值20.9％。

实施例6苯甲酸苄酯对铜绿假单胞菌PAO1生物体膜形成的影响

(1)实验方法：将苯甲酸苄酯用甲醇稀释成10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL的苯甲酸苄酯溶液。将过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液(同实施例3)用新鲜LB液体培养基按体积比1:100的比例稀释。取190μL菌液至96孔板并加入不同浓度的苯甲酸苄酯溶液10μL，以10μL甲醇作阴性对照。37℃恒温摇床中200rpm培养24h后除去上层细菌，贴壁细胞用去离子水轻轻漂洗2次。风干后加入200μL的0.2％结晶紫(结晶紫0.2g溶于10mL 95％乙醇中，将90mL 1％草酸铵水溶液与之混匀，放置24h后过滤即成)。染色15min后再用去离子水轻轻漂洗2次，最后用200μL 95％乙醇溶解色素。生物体膜含量用OD₆₅₀处吸光度表示，

(2)实验结果：如图7，在不抑制PAO1生长的浓度范围内，当化合物浓度在100μg/mL时，苯甲酸苄酯对PAO1生物体膜的抑制率达到37.7％。

结论：苯甲酸苄酯能够明显地抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌的群体感应活性，具有较好的群体感应抑制潜力，可作为先导化合物用于新型抗菌药物的研究以及治疗耐药性细菌引起的感染。

Claims

1.一种苯甲酸苄酯在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述细菌为紫色杆菌或铜绿假单胞菌。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述细菌为紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)CV026或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述苯甲酸苄酯按如下方法制备：

(1)将海洋杆菌(Oceanobacillus sp)CGMCC NO.12612接种至LB海水液体培养基，在180rpm，30℃的恒温摇床中振荡培养3天，发酵完成后，发酵液8000rpm离心10min，弃去菌体，取上清液加入等体积的乙酸乙酯，在分液漏斗中振荡萃取3次，合并乙酸乙酯相并减压浓缩至干得到褐色粗提物；所述LB海水液体培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、海盐33.3g/L，溶剂为去离子水，pH 7.4；

(2)化合物的分离纯化：将发酵所得褐色粗提物用粒径为75-150μm MCI柱进行初步分离，以纯水，纯水-甲醇体积比4:1，纯水-甲醇体积比3:2，纯水-甲醇体积比2:3，纯水-甲醇体积比1:4，纯甲醇依次洗脱，每个梯度洗脱两个柱体积，收集洗脱液纯甲醇的流出液，浓缩至干，利用制备HPLC以体积比40：60的水：甲醇等度洗脱，收集35min出现的峰，并浓缩至干得到所述苯甲酸苄酯。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述细菌群体感应活性抑制剂为紫色杆菌紫色素合成抑制剂。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述细菌群体感应活性抑制剂为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01群体感应系统调控的毒力因子合成抑制剂，所述毒力因子为绿脓素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶或生物体膜中一种或多种。