CN106591191A - 太平洋杆菌xc22919及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种太平洋杆菌XC22919及在制备群体感应抑菌剂中的应用，本发明太平洋杆菌XC22919发酵培养的条件简单，活性次级代谢产物的制备工艺过程简单易控，制备的代谢物具有明显的抑制细菌群体感应的活性等特点，群体感应抑制的最佳有效浓度为0.15mg/ml，即对紫色杆菌的最低抑菌浓度范围内的群体感应抑制活性最大浓度。

Description

太平洋杆菌XC22919及其应用

(一)技术领域

本发明涉及海洋微生物与抗生素领域，具体即一株太平洋杆菌(Oceanobacillussp.XC22919)及其次级代谢产物在群体感应抑制方面的应用。

(二)背景技术

细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染。细菌感染一直威胁着人类的健康，人类一面寻找这些看似不起眼的微生物，一面对抗他们。青霉素开始应用于临床，并成功解决了金黄色葡萄球菌感染这一难题，开创了细菌感染性疾病治疗的新纪元。随后多种抗生素以惊人的速度被发现，经过半个世纪的迅猛发展，大部分的急性细菌感染都可以得到抗生素的有效治疗。随着抗生素的广泛应用甚至滥用，微生物的耐药谱越来越广、耐药强度越来越高，耐药性形成的速度越来越快，与抗菌素灭菌能力成比例上升。多重耐药菌的不断出现给免疫功能受损人群(如艾滋病患者)或公共环境(如医院和病房)带来了很大的危险，细菌耐药性的产生成为了寻找广谱抗菌新药的新瓶颈，因此发现合适的新型抗细菌耐药性的抗生素是现在亟待解决的问题。

群体感应(Quorum Sensing,QS)是细菌利用自身所产生的信号分子来监测自身细胞群体密度的变化，进而调节基因表达、协同适应环境、维持共同发展的一种群体行为。目前，研究人员发现并且认可的调节细菌群体感应的信号分子主要有三种，(1)N-酰基高丝氨酸内酷(AHLS)，这是一种广泛存在于革兰氏阴性细菌中的群体感应的信号分子；(2)自体诱导肽(AutoinducingPePtides,AIP)，AIP是一类短肽分子，它主要存在于革兰氏阳性细菌中；(3)自体诱导物类分子(Autoinducingll,AI2)，是以费氏弧菌(Vibriofischeri)为代表的由luxs酶催化的AI2系统的信号分子。细菌群体感应调控着许多生理功能，在革兰氏阴性细菌中，如铜绿假单胞菌(PSeudomonaSaeruginosa)等，其生物被膜形成、有害毒素产生、致病因子释放等行为均受到AHLS类信号分子的调节。大量科学研究表明，群体感应系统的的缺失能使菌株的致病能力大大降低，但是其不直接杀死细菌或者抑制细菌生长从而不会对细菌产生耐药性。

群体感应抑制是通过干扰微生物细胞间的QS系统阻断细菌之间的信息传递，从而阻止QS依赖型基因的表达而防御病原菌感染，控制有关基因表达的一种现象，称为群体感应抑制(QSI)或群体感应猝灭。细菌QS系统需要一系列过程，包括信号分子合成、识别和基因的启动等。从理论上来讲，阻断其中的任何一个环节都可以阻碍QS系统的调控作用，从而降低细菌的致病力和侵袭力。Kusari等(2014)发现植物内生菌Bacillus sp.strain B3具有酰基酶，能阻断C6-HSL，C8-HSL和3-oxo-C10-HSL从而抑制C.violaceum DSM 30191的紫色素生成；Teasdale等(2009)发现海洋嗜盐细菌Halobacillus salinus中两种苯乙基胺代谢产物能有效抑制V.harveyi的生物荧光的产生、C.violaceum的紫色素的产生，并于浓度200μg/mL下不影响细菌的生长；Colleen等(2013)发现溴化硫代内酯(meta-bromo-thiolactone)因其结构与3-oxo-C₁₂-HSL相似而阻断了铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的lasR-I系统。因此利用这种思路从天然产物寻找潜在的新型的群体感应抑制剂(quorumsensing inhibitor,QSI)，是控制和降低病原菌感染的一种有效方法。

紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)是一种革兰氏阴性、兼性厌氧及无芽孢的球杆菌，它会生产出紫色杆菌素。因其产紫色素的基因受群体感应系统的控制而受到研究人员的关注。一旦其信号分子被抑制，紫色素的产生便会受到抑制。C.violaceum CV026是野生株C.violaceum ATCC 31532的mini-Tn5变体，能灵敏的探测胞外N-己酰基高丝氨酸内酯(C6-HSL)产生紫色素。紫色杆菌具有典型的革兰氏阴性菌LuxI-LuxR型群体感应系统。利用紫色杆菌表型的易于观察，可以快速筛选出群体感应抑制剂，更可以简单方便地验证群体感应抑制活性。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)也是革兰阴性菌，是一种机会致病菌，可引起免疫力低下，尤其是会引起囊性纤维化患者(cysticfibrosis,CF)、烧伤患者发生严重感染。由于对传统抗生素具有很强的耐药性，铜绿假单胞菌的根治显得尤为困难。因此，寻找新的靶点、新的药物治疗铜绿假单胞菌感染是具有非常深远的意义。

海洋环境高盐、高压、寡营养、低光照，这可以造就与陆地微生物不同的生理功能和代谢机制，大大提高了海洋微生物次级代谢产物的结构多样性和活性多样性。从海洋微生物当中筛选得到结构新颖，药理活性好的先导化合物是药学工作者的重心，相对具有比陆地微生物更加深远的研究价值。

(三)发明内容

本发明目的是针对现有技术不足，首次提供一株群体感应抑制活性较高的太平洋杆菌属细菌XC22919。该菌株提取物具有抑制紫色杆菌群体感应系统的活性，还可以抑制致病菌毒力因子的产生，减弱致病菌的耐药性。

本发明采用的技术方案是：

本发明从东太平洋海山区深海海泥中采用海水LB培养基筛选细菌，筛选得到的细菌采用紫色杆菌ATCC12472初筛出具有群体感应抑制活性的细菌，紫色杆菌CV026重复筛选，得到了一株具有群体感应高抑制活性的菌株--太平洋杆菌(Oceanobacillus sp.)XC22919，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2016年6月15日，保藏编号为CGMCC NO.12612，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明还涉及一种所述太平洋杆菌XC22919在制备群体感应抑菌剂中的应用。

进一步，所述抑菌剂是将太平洋杆菌XC22919发酵培养获得的上清液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层浓缩至干，即为抑菌剂。

进一步，所述太平洋杆菌XC22919发酵方法为：将太平洋杆菌XC22919接种于LB液体培养基中(容量为250ml的锥形瓶，每瓶100ml培养基)，在30℃恒温，180rpm摇床中震荡培养3天，发酵完成后，发酵液在8000rpm离心10min，弃去菌体，获得上清液。

进一步，优选所述抑菌剂为紫色素产生抑菌剂或绿脓素产生抑菌剂。

进一步，优选所述紫色素产生抑菌剂为紫色杆菌ATCC12472紫色素产生抑菌剂。

进一步，优选所述绿脓素产生抑菌剂为野生型铜绿假单胞菌的绿脓素产生抑菌剂。

此外，本发明还涉及一种所述太平洋杆菌XC22919在制备细菌耐药性药物中的应用。

本发明所述的活性代谢产物的获得方法主要包括海洋细菌的筛选分离、培养和提取物制备两个步骤。取活化后的海洋细菌，接种到发酵培养基中进行摇床培养，发酵结束后，离心除去菌体，上清液采用等体积的乙酸乙酯萃取，真空低温浓缩至膏状，然后用甲醇溶解得甲醇提取物，将甲醇提取物用0.22微米有机滤头过滤后定溶至100mg/ml备用，用于生物活性检测。

本发明通过紫色杆菌紫色素含量实验和紫色杆菌生长抑制实验，得到该细菌粗提物群体感应抑制的最佳有效浓度为0.15mg/ml，即对紫色杆菌的最低抑菌浓度范围内的群体感应抑制活性最大浓度。通过铜绿假单胞菌绿浓素含量测定实验可以，XC22919和生物体膜抑制以及群及运动，进一步证明XC22919的群体感应抑制活性。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明太平洋杆菌XC22919发酵培养的条件简单，活性次级代谢产物的制备工艺过程简单易控，制备的代谢物具有明显的抑制细菌群体感应的活性等特点，群体感应抑制的最佳有效浓度为0.15mg/ml，即对紫色杆菌的最低抑菌浓度范围内的群体感应抑制活性最大浓度。

(四)附图说明

图1为太平洋杆菌XC22919菌落形态。

图2为太平洋杆菌XC22919光学显微镜下的菌体形态。

图3为太平洋杆菌XC22919的系统发育树。

图4为太平洋杆菌XC22919抑制紫色杆菌活性的生物学检测照片。

图5为太平洋杆菌XC22919菌液抑制紫色杆菌群体感应有效浓度分析，A为XC22919对紫色杆菌12472紫色素抑制情况，B为XC22919对紫色杆菌12472生长抑制情况，单位mg/ml，C为XC22919菌液对紫色杆菌紫色素抑制表观颜色呈现的浓度依赖性变化。

图6为太平洋杆菌XC22919菌液对铜绿假单胞菌绿脓菌素抑制的影响。

图7为太平洋杆菌XC22919菌液对铜绿假单胞菌群集运动的影响，从左至右依次为Swarming培养基中加入太平洋杆菌XC22919菌液终浓度0、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例中涉及到的紫色杆菌C.violaceum(ATCC12472)和紫色杆菌C.violaceum(CV026)由美国罗德岛大学David Rowley教授馈赠并保存于本实验室；野生型铜绿假单胞菌由浙医二院滨江分院微生物所馈赠并保存于本实验室；海洋来源海泥样品由中国国家海洋局第二海洋研究院许学伟研究员馈赠并于-20℃保存于本实验室，样品采集于东太平洋海山区。

实施例中所用的不同培养基配方如下：

富集、筛选与发酵培养基(LB液体培养基)：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、海盐33.3g/L，溶剂为去离子水，pH7.4。LB平板在LB液体培养基中添加质量浓度2％琼脂。

绿脓素培养基(PB培养基)：蛋白胨20g/L、氯化镁1.4g/L、硫酸钾10g/L，溶剂为去离子水，pH自然。

swarming培养基：蛋白胨10g/L、NaCl10g/L、琼脂0.3％[W/V]，溶剂为去离子水，pH自然。

实施例1：海洋细菌的分离纯化与鉴定

1、菌株筛选

10个海泥样品，分别采集自太平洋海山区不同深度，10个样品分别放置于无菌样品袋中，在-20℃下进行保藏。将10个海泥样品分别进行如下操作，筛选细菌。

(1)取备用海泥5g，在无菌研钵中加适量无菌海水进行研磨成细，置于预先装有灭好菌的LB液体培养基的锥形瓶中，30℃、180rpm震荡培养，富集12h，获得富集海泥悬液。

(2)然后取1ml富集海泥悬液用无菌去离子水进行梯度稀释，获得10^-1-10^-9九个稀释度的海泥悬液。

(3)分别取各稀释度海泥悬液100μL涂布于LB平板上，于30℃恒温培养箱中培养24h后，观察，挑取生长形态不同的菌落，在新的LB平板上进行划线，在30℃恒温培养箱中继续进行培养，连续传代至少5次，直至单个筛选平板上长成形态单一的单菌落。

(4)挑取纯化好的单菌落进行试管斜面纯培养，生长好的斜面菌落可在-20℃短期保存(3-6个月)，用20％甘油为冻存剂，刮取生长势态好的菌落在1ml EP管中制成甘油管，-80℃长期保存。

(5)总共筛选得到了50株细菌，表观形态、颜色各异，分别对其进行命名和保藏。结果如下表1：

表1：太平洋海山区海泥样品筛得菌株汇总表

2、细菌的发酵及浸膏的制备

挑取上述各个菌株单菌落接种于LB液体培养基中(容量为250ml的锥形瓶，每瓶100ml培养基)，接种完成后在30℃恒温，180rpm摇床中震荡培养3天。发酵完成后，发酵液在8000rpm离心10min，弃去菌体，取上清液加入等体积的乙酸乙酯，在分液漏斗中震荡萃取三次，获得的乙酸乙酯相用旋转蒸发仪将乙酸乙酯蒸干，得到褐色浸膏，甲醇定溶至100mg/ml，即为各个菌株的提取液，备用。

3、群体感应抑制活性的筛选

当体外存在群体感应抑制剂时，紫色杆菌CV026(突变型)与紫色杆菌ATCC 12472(野生型)中的C6-HSL将不能与靶向细胞结合，从而抑制紫色素的生产。采用紫色杆菌ATCC12472进行抑制紫色素产生的群体感应抑制剂的筛选，再用C.violaceum CV026来检测活性菌株群体感应抑制的稳定性，双模型筛选群体感应抑制活性菌株。若群体感应抑制因子存在，则能抑制紫色菌素的产生，在琼脂板上表现出浑浊但不透明的圆圈。

1)群体感应抑制菌株的初筛：

(1)紫色杆菌活化培养：将甘油管保藏的紫色杆菌ATCC12472接种到预先制备好的LB平板上，30℃过夜活化，直至平板上出现单菌落。挑取单菌落接种到预先制备并灭菌好的LB液体培养基中(250ml锥形瓶，100ml培养基)，30℃，180rpm过夜培养，获得C.violaceumATCC 12472菌液，备用。

(2)筛选平板制备：将15ml融化的LB固体培养基冷却至40℃，加入100μL过夜培养的C.violaceum ATCC 12472菌液，混匀后倒在新鲜LB平板上成双层平板。待平板凝固后，于30℃恒温培养箱培养1h。

(3)加样：将培养好的平板用打孔器打孔，每个孔内一次加入2μL、4μL、6μL、8μL、10μL步骤2制备的各个菌株的粗提液(浓度为100mg/ml)，并由10μL甲醇作为阴性对照，每个样品做三个平行平板，排除偶然误差因素。放入30℃恒温培养箱中培养24h，观察实验结果。若菌液具有群体感应抑制活性，则加样孔周围应有浑浊但不透明的圆圈，圆圈直径越大即为活性越强。

(4)结果：筛选得到8株具有活性的菌株，并且有四株的半透明抑制圈更加明显。筛选结果如下表2：

表2紫色杆菌ATCC12472初筛结果汇总表(直径mm)

+++表示群体感应抑制活性最好，++表示群体感应抑制活性较好，+表示群体感应抑制活性一般，NO表示没有全体感应抑制活性。

2)群体感应抑制菌株的复筛：

将初筛得到的8株具有紫色杆菌ATCC12472群体感应抑制活性的菌株利用CV026再次进行筛选，不仅可以利用实验的重现性筛选出更加稳定的群体感应抑制剂，又可以初步排除群体感应抑制剂阻断信号分子形成而阻断群体感应通路的猜想。

(1)紫色杆菌活化培养：将甘油管保藏的紫色杆菌CV026接种到预先制备好的LB平板上，30℃过夜活化，直至平板上出现单菌落。挑取单菌落接种到预先制备并灭菌好的LB液体培养基中(250ml锥形瓶，100ml培养基)，30℃，180rpm过夜培养，获得C.violaceum CV026菌液，备用。

(2)筛选平板制备：15mL融化的LB固体培养基冷却至40℃，加入100μL过夜培养的C.violaceum CV026菌液、15μL 5mmol/L的C6-HSL，混匀后倒LB平板。待平板凝固后，于30℃恒温培养箱培养1h。

(3)加样：将培养好的平板用打孔器打孔，每个孔内一次加入2μL、4μL、6μL、8μL、10μL步骤2方法制备的步骤3筛选的8个菌株的粗提液(浓度为100mg/ml)，并由10μL甲醇作为阴性对照，每个样品做三个平行平板，排除偶然误差因素。放入30℃恒温培养箱中培养24h，观察实验结果。若提取物具有群体感应抑制活性，则加样孔周围应有浑浊但不透明的圆圈，圆圈直径越大即为活性越强。

(4)结果：得到四株活性最好的细菌DC5，XC22919，DS1252，XC22913，XC22919，并且呈现一定的浓度依赖性，浓度依赖性可以反应出该菌株具有较好的群体感应抑制活性。综合抑菌圈大小以及鉴定结果，将菌株XC22919作为后续更加深入研究的菌株。结果如图4所示。

4、菌株XC22919的鉴定与保藏

(1)生理生化特征：菌株XC22919菌体呈现淡黄色偏乳白色，菌落表面不光滑，有细小白色颗粒。在1000倍光学显微镜下可见为杆菌。

(2)菌株XC22919鉴定采用16s rRNA进行，正向引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，反向引物：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR条件：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环，72℃延伸10min。NCBI BLAST 16s rRNA序列(菌株XC22919的16s rRNA见SEQ ID NO.1)搜索结果与Oceanobacillus sp.菌株同源性99.3％，结合生理生化特点，最终鉴定为Oceanobacillus sp.,命名为太平洋杆菌(Oceanobacillussp.)XC22919，于2016年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12612。

实施例2：太平洋杆菌XC22919对紫色杆菌ATCC12472的生长抑制和紫色素抑制

1、不同浓度太平洋杆菌XC22919提取液对C.violaceum ATCC12472紫色素产生的影响

1.1C.violaceum ATCC12472菌液以及培养基准备

1.1.1从平板上挑取紫色杆菌ATCC12472单菌落接种于事先准备好的装有LB液体培养基的锥形瓶(250ml锥形瓶，100ml培养基)中，30℃，180rpm过夜培养至对数期，获得紫色杆菌ATCC12472菌液，备用。

1.1.2采用25ml的锥形小瓶27个，总共分为3组，分别为空白组，阴性对照组，实验组，其中实验组设置7个浓度梯度，每组3个平行样，每个锥形小瓶中放10ml LB液体培养基，高温高压灭菌，备用。

1.2加样培养

1.2.1将过夜培养的紫色杆菌ATCC12472菌液用新鲜的LB液体培养基稀释，调整菌液浓度至OD600≈0.05，将调整好吸光度的紫色杆菌ATCC12472菌液10ml分别加入到阴性对照组和实验组的25ml的锥形小瓶中(空白组除外，用等体积新鲜的LB液体培养基替代)。

1.2.2实验组：太平洋杆菌XC22919单菌落接种于LB液体培养基中(容量为250ml的锥形瓶，每瓶100ml培养基)，接种完成后在30℃恒温，180rpm摇床中震荡培养3天。发酵完成后，发酵液在8000rpm离心10min，弃去菌体，取上清液加入等体积的乙酸乙酯，在分液漏斗中震荡萃取三次，获得的乙酸乙酯相用旋转蒸发仪将乙酸乙酯蒸干，得到褐色浸膏，甲醇定溶至100mg/ml，即为太平洋杆菌XC22919提取液。

实验组分别加入5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL太平洋杆菌XC22919提取液(浓度为100mg/ml)，阴性对照组加入10μL甲醇作为对照，空白组不做处理。30℃摇床培养24h。

1.3紫色素含量测定

吸取1mL上述培养好的菌液于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，使菌体和紫色菌素沉淀至离心管底部；去上清，加入1mL二甲基亚砜于离心管中，涡旋震荡、超声使紫色菌素充分溶解于二甲基亚砜中；12000rpm室温再次离心3min，去除菌体及碎屑；吸取200μL上清在酶标仪上测定OD585处的光吸收。实验结果如图5所示，太平洋杆菌XC22919的有效浓度为0.15mg/ml，最大抑制率为45.23％。

2.不同浓度太平洋杆菌XC22919酶液对C.violaceum ATCC 12472生长的影响

2.1.1从平板上挑取紫色杆菌ATCC 12472单菌落接种于事先准备好的装LB液体培养基的锥形瓶中(250ml锥形瓶，100ml培养基)中，30℃，180rpm过夜培养至对数期，获得紫色杆菌ATCC12472菌液，备用。

2.1.2采用25ml的锥形小瓶27个，总共分为3组，分别为空白组，阴性对照组，实验组，其中实验组设置7个浓度梯度，每组3个平行样，每个锥形小瓶中放10ml LB液体培养基，高温高压灭菌，备用。

2.2加样培养

2.2.1将过夜培养的紫色杆菌ATCC12472菌液用新鲜的LB液体培养基稀释，调整菌液浓度至OD600≈0.05，将调整好吸光度的紫色杆菌ATCC12472菌液10ml分别加入阴性对照组和实验组的25ml的锥形小瓶中(空白组除外，用等体积新鲜LB液体培养基替代)。

2.2.2实验组：太平洋杆菌XC22919单菌落接种于LB液体培养基中(容量为250ml的锥形瓶，每瓶100ml培养基)，接种完成后在30℃恒温，180rpm摇床中震荡培养3天。发酵完成后，发酵液在8000rpm离心10min，弃去菌体，取上清液加入等体积的乙酸乙酯，在分液漏斗中震荡萃取三次，获得的乙酸乙酯相用旋转蒸发仪将乙酸乙酯蒸干，得到褐色浸膏，甲醇定溶至100mg/ml，即为太平洋杆菌XC22919提取液。

实验组分别加入5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL太平洋杆菌XC22919提取液(浓度为100mg/ml)，阴性对照组加入10μL甲醇作为对照，空白组不做处理。30℃摇床培养24h。

3.吸取1mL上述培养好的菌液于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，使菌体和紫色菌素沉淀至离心管底部；去上清，加入1mL二甲基亚砜于离心管中，涡旋震荡、超声使紫色菌素充分溶解于二甲基亚砜中；12000rpm室温再次离心3min，弃去上清，加入1ml LB液体培养基吹打混匀洗涤；12000rpm室温再次离心2min，去上清加入300μL LB液体培养基，吹打混匀；吸取200μL上清在酶标仪上测定OD600处的光吸收。结果如图5所示，XC22919对紫色杆菌TACC12472的有效浓度为0.15mg/ml，其最大抑制率为41.97％。

实施例3：太平洋杆菌XC22919对野生型铜绿假单胞菌的绿脓素抑制和丛动泳动抑制

1、太平洋杆菌XC22919对野生型铜绿假单胞菌的绿脓素抑制

1.1.1接种野生型铜绿假单胞菌在PB液体培养基中，37℃培养生长到对数期后，25ml的锥形小瓶27个，总共分为3组，分别为空白组，阴性对照组，实验组，其中实验组设置7个浓度梯度，每组3个平行样，每个锥形小瓶中放10ml PB液体培养基，高温高压灭菌，备用。

1.1.2取铜绿假单胞菌菌液用新鲜的PB液体培养基稀释，调整菌液浓度至OD≈0.05，在每个实验组和阴性对照组的锥形小瓶中(空白组除外)分别加入10ml调整好OD值的菌液。实验组加入5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL太平洋杆菌XC22919提取液(浓度为100mg/ml，制备方法同实施例2)，阴性对照组加入10μL甲醇作为对照，空白组不做处理。30℃摇床培养24h。

1.1.3取培养好的菌液6ml至15ml离心管中，加入3ml氯仿轻轻摇动，轻轻萃取20min，绿脓菌素逐渐进入下层氯仿层，显蓝色。氯仿层移入干净的试管中，加入1ml0.2mol/L HCl轻轻摇动提取20min，绿脓菌素进入上层水层，显红色。将上层液体取出，10000rpm离心5min。

1.1.4用可见分光光度计测量波长520nm处的吸光度值OD520。绿脓菌素的产量用OD520表示，OD520越小表示样品对绿脓素的抑制率越高。抑制率计算公式：

与阴性对照组相比，XC22919提取液在0.2mg/ml，0.25mg/ml，0.3mg/ml绿脓菌素抑制率达到了15.99％，17.86，31.40％，且三个分别与阴性对照组作显示组间差异有显著性(P＝0.000<0.05)，具有统计学意义，可以作为可参考数据。结果如表3和图6所示。

表3 XC22919对铜绿假单胞菌绿脓菌素的影响

2、太平洋杆菌XC22919对野生型铜绿假单胞菌的swarming抑制

按照培养基配方预先将Swarming平板做好。实验组的Swarming培养基中事先加入一定浓度太平洋杆菌XC22919提取液，加入终浓度依次为：0、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml。平板倒好后在室温放置一个晚上干燥。挑取2μL过夜培养的野生型铜绿假单胞菌菌液点于平板正中央，放入30℃恒温培养箱中，24h后观察结果。实验结果如图7所示。XC22919具有Swarming抑制作用，并且呈现较好的浓度依赖性，多次重复实验重现性较好，因此可以在这方面看出太平洋杆菌XC22919菌液具有铜绿假单胞菌群体感应抑制活性。

本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 太平洋杆菌XC22919及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1364

<212> DNA

<213> Oceanobacillus sp.

<400> 1

tggaatgagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggcaacc tgcctgtaag actgggataa 60

ccccgggaaa ccggggctaa taccggataa tactttcttt tgcataaagg aaagttgaaa 120

ggcggcttcg gctgtcactt acagatgggc ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa 180

cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact 240

gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa 300

gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaaa ctctgttgtt 360

agggaagaac aagttgggta gtaactgacc caaccttgac ggtacctaac cagaaagcca 420

cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta 480

ttgggcgtaa agcgctcgca ggcggtcctt taagtctgat gtgaaatctc gcggctcaac 540

cgcgaacggt cattggaaac tggaggactt gagtacagaa gaggagagtg gaattccacg 600

tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt 660

ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 720

tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgaagt 780

taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaagaattg 840

acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 900

accaggtctt gacatcctct cccattccta gagataggaa gttcccttcg gggacagagt 960

gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1020

cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc atttagttgg gcactctaag gtgactgccg 1080

gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1140

tacacacgtg ctacaatgga tggaacaaag ggaagcaaaa ccgcgaggtc aagcaaatcc 1200

cataaaacca ttctcagttc ggattgcagg ctgcaactcg cctgcatgaa gccggaatcg 1260

ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320

cgtcacacca cgagagttgg taacacccga agtcggtgag gtaa 1364

Claims (8)

1.太平洋杆菌(Oceanobacillus sp.)XC22919，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2016年6月15日，保藏编号为CGMCC NO.12612，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

2.一种权利要求1所述太平洋杆菌XC22919在制备群体感应抑菌剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抑菌剂为紫色素产生抑菌剂或绿脓素产生抑菌剂。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述抑菌剂是将太平洋杆菌XC22919发酵培养获得的上清液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层浓缩至干，即为抑菌剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述太平洋杆菌XC22919发酵方法为：将太平洋杆菌XC22919接种于LB液体培养基中，在30℃恒温，180rpm摇床中震荡培养3天，发酵完成后，发酵液在8000rpm离心10min，弃去菌体，获得上清液。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述紫色素产生抑菌剂为紫色杆菌ATCC12472紫色素产生抑菌剂。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述绿脓素产生抑菌剂为野生型铜绿假单胞菌的绿脓素产生抑菌剂。

8.一种权利要求1所述太平洋杆菌XC22919在制备细菌耐药性药物中的应用。