CN110358800A - 一种短肽类发酵产物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种短肽类发酵产物及其制备方法和应用。其制备方法包括以下步骤：(1)将保藏编号为CCTCC NO：M 2018731的产黄青霉DXY‑1活化后，接种至培养基中，震荡培养65～80h，得种子液；(2)将种子液接种至液体培养基中，震荡培养7～10天后，收集发酵液；(3)破碎发酵液中的菌丝球，再加入乙酸乙酯萃取，收集并浓缩有机相即可。本发明提取得到的发酵产物能治疗铜绿假单胞菌和紫色杆菌引起的感染，在海洋真菌代谢产物中含量相对较高，可以大规模提取。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种短肽类发酵产物及其制备方法和应用。
背景技术
世界卫生组织(WHO)在2014年发表的报告书中指出，具有强力耐药性的“超级细菌”的发病感染正不断蔓延并呈逐年严重化的趋势，人类的生存受到巨大威胁，解决日益严重的细菌耐药性问题已成为全球关注的重大难题。因此，通过寻找新的作用靶点是生物医学领域开发新型抗菌药物的新战略。群体感应(Quorum sensing,QS)是细菌细胞之间进行通讯的系统，它能够调控细菌的生存与致病性，这引起了药学家的密切关注，已成为药学界研制新型抗菌药物的重要靶点。以细菌QS系统为目标进行筛选得到的抗菌药物，在不破坏细菌细胞生长的情况下，仅抑制细菌毒力因子、生物被膜的产生，从而使细菌的感染能力降低或丧失。由于对细菌没有生存压力，理论上不易诱导细菌耐药性突变。因此，以抑制QS系统为目的的药物研究能有效地治疗细菌感染，有望成为解决耐药细菌感染的新型策略。
海洋真菌独特的生活环境使其生物合成机制的复杂程度和代谢产物种类的多样性远超其他来源的细菌、真菌，从中发现结构新颖、有特殊生物活性的新型化合物的机率将远远高于普通微生物。环二肽类化合物是多产于海洋真菌代谢产物中的一类活性短肽类化合物。采用有机溶剂萃取法获得的产黄青霉代谢产物具有显著地抑制紫色杆菌QS系统的活性。目前尚未见该短肽类化合物具有抑制细菌QS活性的报道，在市场上也尚未见到与此相关的药物。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种短肽类发酵产物及其制备方法和应用，可有效的淬灭细菌群体感应系统的活性，治疗其引起的感染。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种短肽类发酵产物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将保藏编号为CCTCC NO：M 2018731的产黄青霉DXY-1活化后，接种至培养基中，于25～30℃、120～150r/min震荡培养65～80h，得种子液；
(2)将种子液接种至液体培养基中，于25～30℃、120～150r/min震荡培养7～10天后，收集发酵液；其中，种子液的接种量为液体培养基体积的5～10％；
(3)破碎发酵液中的菌丝球，再加入乙酸乙酯萃取3～5次，收集并浓缩有机相即可；其中，发酵液与乙酸乙酯的体积比为1:1～3。
进一步地，步骤(1)中培养基为PDA培养基，其具体组成如下：2％葡萄糖、2％琼脂、20％马铃薯，以及0.01％氯霉素，溶于陈海水，并在115℃灭菌30min；培养条件为：28℃、150r/min震荡培养72h。
进一步地，步骤(2)中种子液的接种量为液体培养基体积的5％；液体培养基的具体组成如下：4％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％NaCl，溶于陈海水，并在115℃灭菌30min。
进一步地，步骤(2)中培养条件为28℃、150r/min震荡培养7天。
进一步地，还包括步骤(4)：
用甲醇溶解步骤(3)所得产物后，分别用二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇，以及甲醇作为洗脱液进行硅胶柱层析，洗脱体积为一个柱体积。
进一步地，二氯甲烷-甲醇作为洗脱液进行洗脱时，以20:1、10:1、5:1、2:1和1:1的比例进行梯度洗脱。
上述方法提取得到的发酵产物。
上述发酵产物在制备淬灭细菌群体感应系统活性的抑制剂中的应用。
进一步地，细菌为紫色杆菌或铜绿假单胞菌。
一种治疗由细菌群体感应系统调控引起的感染的药物，包括上述发酵产物，以及该发酵产物在药学上可接受的辅助成分。
本发明的有益效果为：
1、本发明提取得到的发酵产物能显著地降低由铜绿假单胞菌QS系统介导的绿脓菌素合成、群集运动及生物被膜形成，可用于治疗铜绿假单胞菌引起的感染。
2、本发明提取得到的发酵产物能显著地降低由QS系统介导的紫色素合成，可用于治疗紫色杆菌引起的感染。
3、本发明提取得到的发酵产物在海洋真菌代谢产物中含量相对较高，可以大规模提取。因此，本发明具有分离方法简单、无耐药性，并适合大规模制备的优点。
附图说明
图1为浓度的发酵产物对紫色杆菌菌体及紫色素产量的影响；
图2为不同浓度发酵产物对铜绿假单胞菌菌体、绿脓菌素、弹性蛋白酶及蛋白水解酶产量的影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1提取发酵产物
一种短肽类发酵产物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将保藏编号为CCTCC NO：M 2018731；保藏时间为：2018年10月31日；保藏地址为：中国典型培养物保藏中心的产黄青霉DXY-1(Penicillium chrysogenum DXY-1)活化后，接种至培养基中，于28℃、150r/min震荡培养72h，得种子液；
该培养基的组分为：2％葡萄糖、2％琼脂、20％马铃薯，以及0.01％氯霉素，溶于陈海水；并在115℃对该培养基灭菌30min；
(2)将种子液以5％的接种量转接到装有400mL液体培养基的1000mL锥形瓶中，于28℃、150r/min震荡培养7天后，收集发酵液；
该液体培养基的组分为：4％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％NaCl，溶于陈海水；并在115℃对该液体培养基灭菌30min；
(3)用匀浆机破碎发酵液中的菌丝球，再加入等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，收集并旋干有机相，得发酵产物；
(4)用少量甲醇溶解发酵产物，转移至旋蒸瓶中，加入少量100～200目的硅胶，晃匀后用旋转蒸发仪旋干样品中的甲醇。根据样品质量选择合适尺寸的层析柱，将层析柱垂直固定在铁架台上，向层析柱中加入适量300～400目的硅胶，边加入硅胶边轻微拍打柱身两侧使硅胶界面下降，然后再填入硅胶至合适高度，敲打两侧使硅胶表层均匀水平，最后将下面出口与真空泵相连，减压抽真空1h，使硅胶柱紧实，关闭真空泵。在硅胶柱上面加入拌好的样品，轻轻敲打使样品硅胶表面平整，再接上真空泵抽紧实。为避免洗脱液冲散样品硅胶，应在上层加一层棉花。用梯度洗脱法进行洗脱，洗脱剂分别为二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇混合液(体积比20:1、10:1、5:1、2:1、1:1)、甲醇。每个组分洗脱3～4次，每次一个柱体积。
(5)收集到的每个组分用旋转蒸发仪浓缩，并用毛细管吸取少量组分用薄层层析板展开，香草醛显色剂显色。根据TLC结果，将相似组分合并，即得纯化后的短肽类发酵产物。
实施例2发酵产物抑制紫色杆菌QS活性的分析
1、紫色杆菌筛选模型及其方法
紫色杆菌CV026过夜活化后，按体积2％的比例接种到20mL的灭菌LB培养基中，加入20μL卡那霉素，100μL信号分子，向摇瓶中加入200μL发酵产物溶液，形成不同浓度梯度，分别为0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.3mg/mL，0.4mg/mL，0.5mg/mL，加入甲醇做空白对照。28℃、150r/min培养12h。然后取1mL菌液于1.5mL离心管中，12000r/min离心10min，菌体和紫色色素一同沉淀，除去上清，向离心管中加入1mL DMSO，重新溶解紫色素和菌体，再次在12000r/min离心10min，紫色素溶于上清DMSO中，菌体沉淀，吸取上清液，菌体沉淀中加入1mL ddH2O重溶。分别取200μL的紫色素液和菌液于96微孔板，用酶标仪测OD值，紫色素波长为585nm，菌体波长600nm。
2、结果分析
如图1所示，该发酵产物在0.1～0.5mg/ml浓度范围内能抑制紫色杆菌CV026紫色素产生，并且随着浓度的增加，抑制效果增强，而对菌体生长影响不大。当浓度为0.5mg/mL时，对紫色素的抑制量分别为78.67％；当浓度超过0.5mg/mL时，紫色杆菌的生长明显受到抑制，菌体被大量杀灭。
实施例3发酵产物抑制铜绿假单胞菌PA01毒力因子合成的分析
1、绿脓菌素产量检测
将铜绿假单胞菌PA01活化至对数期，稀释至OD600≈0.05，分装4组，3组为平行实验，每组加入不同浓度的发酵产物，空白对照为甲醇，阳性对照为0.2mg/mL的阿奇霉素，37℃，震荡培养12h。离心除去菌体，取5mL上清加入3mL氯仿抽提，氯仿相转入新离心管并加入1mL 0.2mol/L的盐酸，充分混匀萃取后，离心收集上层水相，用酶标仪测波长520nm处的OD值，其结果见图2。
2、蛋白酶产量检测
过夜活化铜绿假单胞菌PA01，在液体LB培养基中接种1％PA01，并加入不同浓度发酵产物，加入甲醇的为空白对照，加入0.2mg/mL的阿奇霉素的为阳性对照，37℃、150r/min培养12h。取菌液离心，将上清用0.22μm尼龙膜过滤，取100μL上清加入400μL含0.8％偶氮酪蛋白的50mmol/L K2HPO4(pH7.0)溶液，混匀后30℃培养3h。然后加入1.5mol/L HCl并置于冰上反应10min，离心后，上清加入0.5mol/L NaOH；再离心后，取上清在440nm处测吸光度，其结果见图2。
3、弹性蛋白酶产量测定
过夜活化铜绿假单胞菌PA01，在液体LB培养基中接种1％PA01，并加入不同浓度发酵产物，加入甲醇为空白对照，加入0.2mg/mL的阿奇霉素为阳性对照，37℃、150r/min培养12h。取菌液离心，将上清用0.22μm尼龙膜过滤，取100μL上清加入10mg弹性蛋白-刚果红和900μL Na2HPO4(pH7.0)，混匀后37℃震荡培养2h。10000r/min离心10min，取上清在495nm处测吸光度，其结果见图2，图2中每组检测包括四条柱状图，每组柱状图从左至右分别表示图中记载的Absorbance at 600nm(％)、Pyocyanin(％)、Elastase activity(％)、Proteolytic activity(％)。
由图2可知在浓度低于0.5mg/mL范围内，发酵产物对菌体的生长影响不大，而阳性对照阿奇霉素(AZM)有明显的抑菌作用。
在不抑制菌体生长的浓度范围内，以甲醇为空白对照，随着发酵产物的浓度增大，弹性蛋白酶产量降低，发酵产物浓度为0.1～0.5mg/mL时，PA01弹性蛋白酶产量分别降低5.19％、21.35％、24.34％、29.18％和38.98％，同时蛋白水解酶产量也逐渐降低。
发酵产物浓度为0.5mg/mL时，PA01蛋白水解酶产量降低12.52％。阿奇霉素虽然对PA01的毒力因子抑制效果特别明显，但它作为抗生素对细菌的生长也有明显的抑制作用，阿奇霉素的浓度仅为0.2mg/mL时，以甲醇为空白对照，它对菌体的抑制率可达42.38％。
Claims (10)
1.一种短肽类发酵产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将保藏编号为CCTCC NO：M 2018731的产黄青霉DXY-1活化后，接种至培养基中，于25～30℃、120～150r/min震荡培养65～80h，得种子液；
(2)将种子液接种至液体培养基中，于25～30℃、120～150r/min震荡培养7～10天后，收集发酵液；其中，所述种子液的接种量为液体培养基体积的5～10％；
(3)破碎发酵液中的菌丝球，再加入乙酸乙酯萃取3～5次，收集并浓缩有机相即可；其中，所述发酵液与乙酸乙酯的体积比为1:1～3。
2.根据权利要求1所述的短肽类发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养基为PDA培养基，其具体组成如下：2％葡萄糖、2％琼脂、20％马铃薯，以及0.01％氯霉素，溶于陈海水，并在115℃灭菌30min；所述培养条件为：28℃、150r/min震荡培养72h。
3.根据权利要求1所述的短肽类发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述种子液的接种量为液体培养基体积的5％；所述液体培养基的具体组成如下：4％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％NaCl，溶于陈海水，并在115℃灭菌30min。
4.根据权利要求1所述的短肽类发酵产物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养条件为28℃、150r/min震荡培养7天。
5.根据权利要求1所述的短肽类发酵产物的制备方法，其特征在于，还包括步骤(4)：
用甲醇溶解步骤(3)所得产物后，分别用二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇，以及甲醇作为洗脱液进行硅胶柱层析，洗脱体积为一个柱体积。
6.根据权利要求5所述的短肽类发酵产物的制备方法，其特征在于，所述二氯甲烷-甲醇作为洗脱液进行洗脱时，以20:1、10:1、5:1、2:1和1:1的比例进行梯度洗脱。
7.权利要求1～6任一项所述方法提取得到的发酵产物。
8.权利要求7所述的发酵产物在制备淬灭细菌群体感应系统活性的抑制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细菌为紫色杆菌或铜绿假单胞菌。
10.一种治疗由细菌群体感应系统调控引起的感染的药物，其特征在于，包括权利要求7所述的发酵产物，以及该发酵产物在药学上可接受的辅助成分。
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| CN107630048A (zh) * | 2017-08-28 | 2018-01-26 | 浙江工业大学 | 一种苯甲酸苄酯在制备细菌群体感应活性抑制剂中的应用 |
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