CN104109642A - 一种粘质沙雷氏菌及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种粘质沙雷氏菌，命名为Serratia marcescens subsp.PGPRB，保藏号为CCTCC No：M2013617；筛选方法由菌株分离、鉴定步骤组成，粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB用于制备灵菌红素prodigiosin，用于制备脂肽serrawettin W2。

Description

一种粘质沙雷氏菌及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及到粘质沙雷氏菌。 

背景技术

植物病害一直严重地威胁着农业生产，人类防治植物病害可以追溯到几千年前，上世纪40年代初期，有机合成农药大量产生，有效地控制了病害，但抗药性、环境污染和人类健康受到威胁，即人们常说的三害。三害的出现引起了人们的广泛关注,于是生物防治的研究开发应用被提到了议事日程上来,并得到各国政府的重视。植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是存在于植物根际的一些对植物生长有促进和保护作用的微生物。其中研究较深入的是假单胞菌属和芽孢杆菌属,近年来沙雷氏菌属细菌作为生防细菌逐渐受到很多学者的重视。沙雷氏菌通常可产生多种抗生性代谢产物，如灵菌红素、环脂肽类物质（serrawettinW1、W2、W3）、硝吡咯菌素、大环内酯类抗生素、水解酶(几丁质酶和1,3-葡聚糖酶)和嗜铁素等抗菌物质,对多种植物病原真菌具有抑制作用。已报道普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica HRO-C48、A21-4、IC14和IC1270)、粘质沙雷氏菌(S.marcenscens N4-5)可防治多种土传、气传和采后病害的发生。 

灵菌红素是一类具有甲氧基吡咯环结构的天然色素的总称。目前已报道的灵菌红素及其类似物有prodigiosin，metacycloprodigiosin，butyl-meta-cycloheptylprodigiosin，butylcycloheptyl-prodigiosin，nonylprodigiosin等，含甲氧基三吡咯环组成的基本骨架结构，具有抗细菌、抗疟疾、抗真菌、抗原生动物等生物活性。目前最另人们感兴趣的是其具有免疫抑制活性和引起肿瘤细胞凋亡作用。如灵菌红素类似物GX15-070（Obatoclax），在临床上已被用于治疗多种癌症。同时灵菌红素及其类似物在由各种藻类引起的海洋赤潮和淡水水华等方面具有极佳的治理效果，且不会给水体带来二次污染；另外灵菌红素对天然纤维和化学纤维具有较强的着染力及抗菌性能，可作为生态染料。 

粘质沙雷氏菌产生的脂肽类物质主要有serrawettin W1、serrawettin W2和serrawettin W3。研究发现serrawettin对细菌、真菌卵菌具有抑制作用，Escobar-D₁′az等研究表明AT514（serrawettin W1）能诱导人癌细胞和B-慢性淋巴细胞性白血病细胞凋亡，目前在肿瘤治疗领域正处于临床开发阶段。 

随着全球高致病耐药菌，如耐甲氧西林金葡菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）和耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）等的不断出现，临床上对新型抗生素的需求变得十分迫切。玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）产生的环脂肽类抗生素家族的第一个产品—达托霉素（Daptomycin）对以上耐药菌均有很好的杀菌效果，且制剂用药方便，毒副作用小；类芽孢菌属（Paenibacilluspolymyxa）所产多粘菌素（Polymyxins）已在临床上用于治疗革兰氏阴性菌感染。粘质沙雷氏菌属 所产的多种环脂肽和灵菌红素可作为潜在的抗生素类药物被开发，具有很好的应用前景。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种能应用于生防领域的粘质沙雷氏菌。 

解决上述技术问题所采用的技术方案是：命名为Serratia marcescens subsp.PGPRB的粘质沙雷氏菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址武汉,保藏日期为2013年11月28日,保藏号为CCTCC NO：M 2013617； 

粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB的16S rDNA核苷酸序列为： 

粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB的rpoB核苷酸序列为： 

上述粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB的筛选方法由以下步骤组成： 

1、菌株分离 

取烟草根际土样置于离心管中，加入10倍质量的无菌水制成土壤悬液，置于漩涡震荡仪震荡15分钟，静置5分钟，吸取上清液分别加入10倍、100倍、1000倍、10000倍体积的无菌水制成菌悬液，取不同浓度的菌悬液分别涂布于KB固体培养基平板上，每种浓度的菌悬液做三个重复，在恒温培养箱内28℃倒置培养24～48小时，挑取红色菌落，重复划线3次，得到粘质沙雷氏菌，命名为Serratia marcescens subsp.PGPRB，在冰箱-20℃低温保存。 

上述的烟草根际土样来源于福建省永定县。KB培养基1L中含蛋白胨20g、MgSO₄.7H₂O1.5g、K₂HPO₄.3H₂O2g、甘油10ml、氨苄青霉素40mg、氯霉素13mg、放线菌酮素100mg，调pH至7.0。 

2、菌株鉴定 

将得到的粘质沙雷氏菌通过形态学、分子测序、生理生化分析、脂肪酸分析进行鉴定。 

粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB在制备灵菌红素prodigiosin中的用途。 

粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB在制备脂肽serrawettin W2中的用途。 

附图说明

图1是Serratia marcescens subsp.PGPRB的扫描电镜图。 

图2是Serratia marcescens subsp.PGPRB在KB培养基上28℃培养72小时的菌落图。 

图3是Serratia marcescens subsp.PGPRB光学显微镜放大100倍的形态图。 

图4是Serratia marcescens subsp.PGPRB16S rDNA系统进化树。 

图5是Serratia marcescens subsp.PGPRB rpoB基因系统进化树。 

图6是灵菌红素prodigiosin的电喷雾质谱。 

图7是灵菌红素prodigiosin的二级质谱图谱。 

图8是脂肽Serrawettin W2的分析型高压液相色谱图谱。 

图9是脂肽Serrawettin W2的电喷雾质谱图谱。 

图10是脂肽Serrawettin W2的二级质谱图谱。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于下面的实施例。 

实施例1 

命名为Serratia marcescens subsp.PGPRB的粘质沙雷氏菌，保藏号为CCTCC NO：M2013617； 

粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB的16S rDNA核苷酸序列为： 

粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB的rpoB核苷酸序列为： 

上述粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB的筛选方法由以下步骤组成： 

1、菌株分离 

取来源于福建省永定县的烟草根际土样1g置于离心管中，加入10g无菌水制成土壤悬液，置于漩涡震荡仪震荡15分钟，静置5分钟，吸取上清液分别加入10倍、100倍、1000倍、10000倍体积的无菌水制成菌悬液，取不同浓度的菌悬液分别涂布于平板玻璃上的KB固体培养基（KB 培养基1L中含蛋白胨20g、MgSO₄.7H₂O1.5g、K₂HPO₄.3H₂O2g、甘油10ml、氨苄青霉素40mg、氯霉素13mg、放线菌酮素100mg，调pH至7.0），每种浓度的菌悬液做三个重复，在恒温培养箱内28℃倒置培养24～48小时，挑取红色菌落，重复划线3次，得到粘质沙雷氏菌，命名为Serratia marcescens subsp.PGPRB，在冰箱-20℃低温保存。 

2、菌株鉴定 

（1）形态特征 

Serratia marcescens subsp.PGPRB菌株的菌落凸起，中心不透明，边缘不规则，湿润，短杆状，大小为(1.2～1.4)μm×(0.6～0.7)μm，革兰氏阴性，周生鞭毛，见图1，有动力，在KB固体培养基上可产生树枝状的特别菌落，见图2；28℃培养产生红色色素，37℃培养不产红色色素，28℃培养又产生红色色素，灵菌红素在胞外以胞外膜泡形式存在，见图3箭头所指；对氨苄青霉素和氯霉素具有抗性。 

（2）生理生化特征 

生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》。生理生化结果表明Serratia marcescens subsp.PGPRB能代谢阿拉伯糖和D-木糖，与标准菌株Serratia marcescens代谢不同，见表1。 

表1Serratia marcescens subsp.PGPRB生理生化特征 

注：+为90％以上菌株阳性；-为90％以上菌株阴性；d为11%～89％的菌株阳性 

（3）脂肪酸分析 

脂肪酸测定委托武汉大学中国典型培养物保藏中心完成。Serratia marcescens subsp.PGPRB脂肪酸分析主要成分为C_16:0含量为30.73％，与大部分沙雷氏菌相同；MIDI数据库比对与戴氏西地西菌(Cedecea davisae)相似度最高（SI=0.718），戴氏西地西菌明胶实验为阴性，与Serratia marcescens subsp.PGPRB生理生化特征矛盾。参考Zhang等（Zhang C-X,Yang S-Y,Xu M-X,et al.Serratia nematodiphila sp.nov.,associated symbiotically with the entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis(Rhabditida:Rhabditidae).International journal of systematic and evolutionary microbiology,2009,59(7):1603-1608.）数据发现Serratia marcescens subsp.PGPRB脂肪酸成分与沙雷氏属其它种具有一定的差别，见表2。 

表2Serratia marcescens subsp.PGPRB和部分沙雷氏菌脂肪酸成分比较 

1，Serratia nematodiphila DZ0503SBS1；2，S.marcescens subsp.sakuensis；3，S.marcescens GC subgroup B；4，S.ureilytica；5，S.odorifera；6，S.rubidaea；7，Serratia marcescens subsp.PGPRB 

（4）16S rDNA序列分析 

以Serratia marcescens subsp.PGPRB菌液直接为模板，引物BS-for（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和Bs-rev（AAGGAGGTGATCCAGCCGCA），PCR产物16℃过夜连接到PMD20-T载体中，转化至E.coli trans10，菌落PCR验证，菌液送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。得到了1534bp序列，在EzTaxon server2.1数据库中比对分析，与模式菌株Serratia marcescens subsp.sakuensis同源性最高（99.733％），选取部分同源性较高的模式菌株序列（≥97.764％），采用MEGA5.1，NJ法建树，bootstrap值为1000。系统进化树分析：Serratia marcescens subsp.PGPRB与Serratia marcescens subsp.sakuensis亲缘关系较近，见图4。 

（5）rpoB序列分析 

提取菌株全基因组DNA，引物LAPS5（TGGCCGAGAACCAGTTCCGCGT）和LAPS27（CGGCTTCGTCCAGCTTGTTCAG），PCR产物16℃过夜连接到PMD20-T载体中，转化至E.coli trans10，菌落PCR验证，菌液送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。得到了1529bp序列，在 NCBI上Blast比对，Serratia marcescens subsp.PGPRB与Serratia marcescens WW4同源性最高（99％），Serratia plymuthica4Rx13次之（95％），选取相似度较高的序列（≥94％），采用MEGA5.1，NJ法建树，bootstrap值为1000。Serratia marcescens subsp.PGPRB与Serratia marcescens WW4亲缘关系较近，见图5。 

从烟草根际筛选到菌株Serratia marcescens subsp.PGPRB，经16S rDNA和rpoB序列分析，与粘质沙雷氏菌亲缘关系最近；结合生理生化特征和脂肪酸分析，发现本次筛选到的菌株一些指标与粘质沙雷氏菌Serratia marcescens有一定的差别。 

实施例2 

采用实施例1筛选分离的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB制备灵菌红素prodigiosin的方法步骤如下： 

1、菌种活化 

用接种环蘸取粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB在LB固体斜面上划线，28℃恒温箱中过夜培养。 

2、种子制备 

取50ml的种子培养基（蛋白胨20g/L、MgSO₄.7H₂O1.5g/L、K₂HPO₄.3H₂O2g/L、甘油10ml/L，pH7.0），装于250ml的三角瓶，取活化菌株斜面一支，加入0.5ml无菌水，制成菌悬液，倒入种子培养基中，在恒温培养振荡器上过夜培养，转速200r/min，温度28℃，得种子培养液。 

3、发酵培养 

取200mL的发酵培养基（蛋白胨20g/L、MgSO₄.7H₂O1.5g/L、K₂HPO₄.3H₂O2g/L、甘油10ml/L，pH7.0），装于1L的三角瓶，将种子培养液转入到发酵培养基中，种子培养液与发酵培养基的体积比为1:100，在恒温培养振荡器上培养72小时，转速200r/min，温度28℃。 

4、灵菌红素提取 

发酵结束后，10000r/min离心30min，弃上清液，收集菌体，用蒸馏水洗涤3次；加入湿菌体质量10倍质量的乙醇，常温下浸提3小时，离心，取提取液，旋转蒸发除去乙醇，真空冷冻干燥，得灵菌红素粗品。 

5、灵菌红素prodigiosin分离、鉴定 

（1）分离 

灵菌红素粗品用乙酸乙酯溶解，进行硅胶柱层析分离（200-300目），以石油醚与乙酸乙酯按体积比1：1混合液洗脱，得到3个组分，确定灵菌红素prodigiosin。 

（2）灵菌红素prodigiosin鉴定 

将硅胶柱层析分离到的三个组分用甲醇溶解，调节pH值为3.0或9.0，在200～800nm下进行全波长扫描；用电喷雾质谱仪分析，实验条件：三个组分用甲醇（色谱级）溶解，离子化方式 ESI（＋）、Capillary4500V、Collision Cell RF80.0Vpp、Dry Heater180℃、Dry Gas4.0/min。 

结果表明在酸性条件下，组分2在532nm处有最大吸收峰，在碱性条件下，最大吸收峰移至457nm，与灵菌红素prodigiosin吸收光谱一致。电喷雾质谱仪分析结果表明组分2相对分子质量为323.2，与灵菌红素prodigiosin相对分子质量相同。选定准分子离子[323.2+H]+进行二级质谱分析，能获得309、292、266、252、238灵菌红素特征碎片峰，结果见图6，由图可见组分2为灵菌红素prodigiosin。 

实施例3 

采用实施例1筛选分离的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB制备脂肽serrawettin W2的方法步骤如下： 

菌种活化步骤1、种子制备步骤2、发酵培养步骤3、脂肽serrawettin W2提取步骤4与制备灵菌红素prodigiosin相同。 

5、脂肽serrawettin W2分离纯化 

（1）硅胶柱初步分离纯化 

粗品用乙酸乙酯溶解，进行硅胶柱层析分离（200-300目），以石油醚与乙酸乙酯按体积比1：1混合液洗脱，再用乙醇进行洗脱，得到含有脂肽serrawettin W2的混合物。 

（2）用日本SHIMADZU公司的LC-8A型半制备高效液相色谱仪对含有脂肽serrawettin W2的混合物进行纯化、鉴定，LC-8A型色谱仪的半制备柱为SinoChrome ODS BP(20×250mm，10μm)反向C₁₈柱，纯化的方法如下： 

称取200mg含有脂肽serrawettin W2的混合物溶解在2.0mL甲醇中，每次进样量为0.5mL；流动相流速为10mL/min；流动相A为0.05%三氟乙酸水溶液(v/v)，流动相B为色谱级100%甲醇；梯度洗脱，0分钟，85％B；0～15分钟，90%B；15～30分钟，95%B。共收集到八个组分，在真空冷冻干燥仪内干燥，用表面张力仪测定表面张力，用薄层色谱分析和电喷雾质谱仪确定脂肽serrawettin W2。 

6、脂肽serrawettin W2鉴定 

（1）定性分析 

用分析型高压液相色谱仪（型号为LC-20A，日本岛津公司）对半制备高压液相色谱仪收集的八个组分进行分析，分析柱为SinoChrome ODS BP(4.6×250mm，5μm)反向C₁₈柱，检测波长为214nm，进样量20μL，流动相流速为0.6mL/min；流动相A为0.05%三氟乙酸水溶液(v/v)，流动相B为色谱级100%甲醇；梯度洗脱，0分钟，85％B；0～15分钟，90%B；15～30分钟，95%B。 

（2）薄层色谱检测 

取样品1mg于安瓿瓶中，加入6.0mol/L的盐酸溶液1mL，封口，110℃水解24小时，水解产物进行薄层色谱分析，以正丁醇与冰乙酸、水的体积比4：1：1为展开剂，当展开剂前沿达到 薄板的3/4时,将薄板取出,用吹风机吹干，喷洒质量浓度为0.1%茚三酮的丙酮溶液，置105℃烘箱中10分钟。 

（3）测定表面张力 

称取1mg的样品，溶于0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH为7.4)中。测试温度25℃，用表面张力仪（型号DCAT11，德国德菲公司）测定样品表面张力。 

（4）电喷雾质谱仪确定分子量及结构 

电喷雾质谱仪（型号Esquire6000，德国布鲁克公司）；实验条件：色谱级甲醇溶解样品，离子化方式ESI（＋），Capillary4500V，Dry Heater300℃，Dry Gas5.0L/min。 

表面/界面张力仪测定在保留时间为18.792分钟的组分（见图7）能显著降低液面张力，其表面张力值为26.829mN/m，酸水解产物经茚三酮显色为红色；电喷雾质谱结果：[M+H]⁺732.2、[M+Na]⁺754.6、[M+K]⁺770.6，确定该组分分子质量为731.1，与serrawettin W2分子质量相同，见图8。二级质谱显示脂肽首先失去的是氨基酸残基， 

$754.6\frac{\mathrm{Ile}}{113.16}641.4\frac{\mathrm{Phe}}{147.18}494.3\frac{\mathrm{Thr}}{101.10}393.3\frac{\mathrm{Ser}}{87.08}306.5$

只有环状化合物才有这种可能，即从开环部分开始，从中间部分失去氨基酸残基，因此所分析的脂肽为环状结构见图9，在图9中，碎片峰623.3与641.3表示相差一个水分子，因此754.6→623.4即为失去Ile+H₂O，说明肽链中的Ile与羟基酸的羟基相连形成内酯，图中碎片峰448.3为碎片离子SerThrPheIle，碎片峰561.4为碎片离子LeuSerThrPheIle，碎片峰579.3为碎片离子LeuSerThrPheIle+H₂O，见图9，由上述质谱碎片信息确定结构为为serrawettin W2。 

Claims (4)

1.一种粘质沙雷氏菌，命名为Serratia marcescens subsp.PGPRB，保藏号为CCTCC NO：M2013617。

2.一种权利要求1粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB的筛选方法，其特征在于由下述步骤组成：

（1）菌株分离

取烟草根际土样置于离心管中，加入10倍质量的无菌水制成土壤悬液，置于漩涡震荡仪震荡15分钟，静置5分钟，吸取上清液分别加入10倍、100倍、1000倍、10000倍体积的无菌水制成菌悬液，取不同浓度的菌悬液分别涂布于KB固体培养基平板上，每种浓度的菌悬液做三个重复，在恒温培养箱内28℃倒置培养24～48小时，挑取红色菌落，重复划线3次，得到粘质沙雷氏菌，命名为Serratia marcescens subsp.PGPRB，在冰箱-20℃低温保存；

上述的KB培养基1L中含蛋白胨20g、MgSO₄.7H₂O1.5g、K₂HPO₄.3H₂O2g、甘油10ml、氨苄青霉素40mg、氯霉素13mg、放线菌酮素100mg，调pH至7.0；

（2）菌株鉴定

将得到的粘质沙雷氏菌通过形态学、分子测序、生理生化分析、脂肪酸分析进行鉴定。

3.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB在制备灵菌红素prodigiosin中的用途。

4.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.PGPRB在制备脂肽serrawettin W2中的用途。