CN103834577B - 闽浙马尾杉菌根真菌及其产石杉碱甲的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及闽浙马尾杉菌根真菌及其产石杉碱甲的方法和应用。本发明提供一种闽浙马尾杉菌根真菌，命名为裂褶菌（Schizophyllum？commune）MT39，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC？M2013642。本发明的另一技术方案为提供一种闽浙马尾杉菌根真菌，命名为(Chaunopycnis？alba)MT78，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC？M2013643。本发明解决了土壤中细菌含量较多分离纯化内生菌根真菌难度较大的问题，从根际土壤中分离产石杉碱甲的菌根真菌。

Description

闽浙马尾杉菌根真菌及其产石杉碱甲的方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及闽浙马尾杉菌根真菌及其产石杉碱甲的方法和应用。

背景技术

老年痴呆症是一种严重的、退行性脑疾患，由于其发病率高，致残率高，给社会和家庭造成了严重的危害和巨大的经济负担，随着社会老龄化，老年痴呆症发病率相对上升，据统计，世界有5000多万老年人患有不同程度的老年性痴呆症，因此治疗老年痴呆症是摆在当前社会的一大难题。

石杉碱甲[(-)HuperzineA，HupA]是我国科学家刘嘉森于1986年从蛇足石杉中分离得到的一种新型石松类生物碱有效单体。药理实验表明，它能抑制乙酰胆碱酯酶活性，有效地改善老年人记忆功能，对治疗老年痴呆症有特殊疗效。石杉碱甲主要来源于野生蛇足石杉全草，而该植物对环境要求苛刻，生长缓慢，分布零散，资源更新周期长，而且石杉碱甲在蛇足石杉中的含量甚微，仅为万分之几，造成国际市场上石杉碱甲的价格不断攀升，一度达到每千克50万美元，成为制约石杉碱甲开发的瓶颈。由于石杉碱甲的结构特殊，骨架中的桥环结构难以人工合成，目前所有化学合成方法步骤复杂、合成条件苛刻、产率很低，难以实现工业化生产；植物组织培养无法消除内在的微生物污染，同时由于植物生长条件十分苛刻，因此至今未能走出实验室。

植物-菌根真菌-内生真菌三重互惠共生体，其建立共生体的内在机制是两种真菌通过营养竞争或通过分泌次生代谢产物来相互抑制与植物建立共生体。目前已有不少关于从蛇足石杉内生真菌代谢产物中分离到石杉碱甲的报道，如专利CN101195804A（黎万奎等，专利申请号：200610119149.7，内生枝顶孢霉）、CN101240304A(吴东才等，专利申请号：200710003519.5，枝孢霉菌)、CN101942393A(朱笃等，专利申请号：20091010186852.3，竹黄菌)、专利CN103103134A(吴水生等，专利申请号：201110355882.X，炭疽菌)等；杨晓军（《内生真菌YD-01次生代谢产物的研究Ⅰ》2006，37（5）：479-480，中国药科大学学报）均报道了产石杉碱甲及其类似物的内生真菌。以上均表明利用内生真菌发酵生产石杉碱甲成为一种可能，依据该共生体的内在机制从植物根际土壤中可分离到产石杉碱甲的菌根真菌，但目前关于该机制的研究观点不尽相同且土壤中微生物种类繁多，分离纯化工作量大，因此至今关于从植物根际土壤中分离产石杉碱甲菌根菌的研究仍未见报道。

发明内容

本发明的目的是克服土壤中细菌含量较多，分离纯化内生菌根真菌难度较大的缺陷，提供一种供发酵生产石杉碱甲药物的闽浙马尾杉菌根真菌及其产石杉碱甲的方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种闽浙马尾杉菌根真菌，命名为裂褶菌（Schizophyllumcommune）MT39，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCCM2013642。

上述的闽浙马尾杉菌根真菌—裂褶菌MT39，其显微形态为：菌丝棉花状，有隔，分枝，不产孢子。

上述的闽浙马尾杉菌根真菌—裂褶菌MT39，其基因组ITS特征碱基序列如SEQIDNO：1所示。

上述的闽浙马尾杉菌根真菌—裂褶菌MT39，其菌落培养特征为：PDA培养基28℃培养，转速为140rpm，培养第二天开始出现菌丝球，第五天菌丝球直径变大，发酵液变粘稠，发酵液开始变淡黄色，第九天颜色变深，发酵液变得非常粘稠，其菌落形态为：正面白色，菌丝发达，细腻，背面黄白色。

本发明的另一技术方案为提供一种闽浙马尾杉菌根真菌，命名为(Chaunopycnisalba)MT78，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCCM2013643。

上述的闽浙马尾杉菌根真菌—MT78，其显微形态为：菌丝分枝，无隔，孢子梨形，单胞。

上述的闽浙马尾杉菌根真菌—MT78，其基因组ITS特征碱基序列为:SEQIDNO：2。

上述的闽浙马尾杉菌根真菌—MT78，其固体培养菌落特征为：PDA培养基28℃培养，转速为140rpm，第三天明显生长大量菌丝呈颗粒状，第五天发酵液变无色粘稠状液体，第九天菌丝集结成团。其菌落形态为：正面白色，菌丝细小，呈薄膜状，有叶脉状凸起，呈放射状，背面呈脉状放射裂纹，黄白色。

本发明的又一技术方案为提供一种闽浙马尾杉菌根真菌制备石杉碱甲的方法，包括下列步骤：

（1）取闽浙马尾杉菌根真菌-裂褶菌MT39或MT78，在无菌条件下，用接种针挑取菌丝，接入已灭菌过的固体PDA培养基试管，于28℃活化48小时；

（2）取活化后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA培养基，于28℃在140rpm摇床培养72小时，得种子液；

（3）将制备好的种子液接入液体PDA培养基中，于28℃下140rpm摇床培养10天；

（4）发酵完后，加入2%酒石酸，静置过夜，超声两次，每次各40min，抽滤收集上清液，用氨水调节至PH值为9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60℃回收二氯甲烷，用甲醇溶解残留物得到石杉碱甲初提物。

本发明的又一技术方案为提供一种上述的闽浙马尾杉菌根真菌-裂褶菌MT39或MT78制备石杉碱甲的应用。

本发明的有益效果：本发明解决了土壤中细菌含量较多分离纯化内生菌根真菌难度较大的问题，从根际土壤中分离产石杉碱甲的菌根真菌。本发明两株闽浙马尾杉菌根真菌分别通过发酵，经石杉碱甲单克隆抗检测、HPLC、LC-MS分析证实可以产生石杉碱甲化合物，可以作为石杉碱甲新药源，有较大的应用价值。本发明可以利用两株闽浙马尾杉菌根真菌产石杉碱甲的特点以及现代发酵育种技术，达到工业化生产石杉碱甲，以解决石杉碱甲短缺的瓶颈问题，同时可以挽救濒临灭绝的石杉碱甲自然资源。

附图说明

图1为本发明裂褶菌MT39的显微形态图；

图2为本发明MT78的显微形态图；

图3为裂褶菌MT39的菌落形态图；

图4为MT78的菌落形态图；

图5为HupA标准品HPLC色谱图；

图6为裂褶菌MT39发酵提取物色谱图；

图7为MT78发酵提取物色谱图；

图8为HupA标准品质谱图；

图9为裂褶菌MT39发酵提取物质谱图；

图10为MT78发酵提取物质谱图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

本发明所述的两株闽浙马尾杉菌根真菌是从闽浙马尾杉(Phlegmariurusphlegmaria)根际土壤采用土壤稀释法分离纯化得到。经分子生物学及形态学鉴定命名为裂褶菌（Schizophyllumcommune）MT39、ChaunopycnisalbaMT78，已保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学,保藏日期为2013年12月10号，其中ChaunopycnisalbaMT78保藏号CCTCCM2013643，裂褶菌（Schizophyllumcommune）MT39保藏号CCTCCM2013642。

实施例1

1、菌株显微形态观察：将本发明两种产石杉碱甲的菌根真菌接点接种于平板中央，再将灭完菌的盖玻片45°斜插人接完菌的平板中（2片/平板），于28°C真菌培养箱中培养，待菌株长到一定程度（6d）后，取插片（超净台中进行）于显微镜下观察。

请参阅图1为本发明裂褶菌MT39的显微形态图，所述裂褶菌MT39的显微形态为：菌丝棉花状，有隔，分枝，不产孢子。

请参阅图2为本发明MT78的显微形态图，所述MT78显微形态为：菌丝分枝，无隔，孢子梨形，单胞。

2、菌株平板形态观察：将本发明产石杉碱甲的菌根真菌点接到平板中央。于28°C真菌培养箱中培养，每天定时观察记录菌体的生长情况，包括菌落直径、菌落颜色、菌丝变化等菌株形态变化。

闽浙马尾杉菌根真菌—裂褶菌MT39，其菌落培养特征为：PDA培养基28℃培养，转速为140rpm，培养第二天开始出现菌丝球，第五天菌丝球直径变大，发酵液变粘稠，发酵液开始变淡黄色，第九天颜色变深，发酵液变得非常粘稠，其菌落形态为：正面白色，菌丝发达，细腻，背面黄白色。

闽浙马尾杉菌根真菌—MT78，其固体培养菌落特征为PDA培养基28℃培养，转速为140rpm，生长迅速，第三天明显生长大量菌丝呈颗粒状，第五天发酵液变无色粘稠状液体，第九天菌丝集结成团。其菌落形态为：正面白色，菌丝细小，呈薄膜状，有叶脉状凸起，呈放射状，背面呈脉状放射裂纹，黄白色，生长较缓慢，10天约8x7cm。

3、本发明闽浙马尾杉菌根真菌分子生物学特征

菌体收集：将本发明产石杉碱甲菌根真菌接自PDA液体培养基，28℃，140r/min，摇瓶培养，待菌体长到一定量后，8000rpm离心5min，弃上清，将沉淀的菌体转至EP管内，于-80℃冰柜中预冻一晚待用。

DNA提取：采用CTAB法提取基因组DNA，取适量冻干后的菌体，于研钵中充分研磨，加入预热至65℃的CTAB溶液1ml，取500ul转入2ml离心管，加入20μl巯基乙醇，混合，65℃温浴1h；温浴结束后加入等体积的1：1的苯酚：氯仿，缓慢震荡，12000rpm，20℃离心10min，取上清液至新的离心管，重复以上步骤，至上清液澄清，将上清液转入1.5ml离心管（共提2～4次）。加入7/10体积异丙醇，4℃下沉淀，30min后10000rpm离心10min，弃上清；用75%冷乙醇（500ul）洗涤沉淀，然后10000rpm，4℃离心10min，弃上清（重复一次），自然风干；最后加入20ul超纯水充分溶解，最后放置-20℃冰箱保存备用。

PCR扩增：采用ITS1和ITS4作为上下游引物，构建20μl反应体系（含ddH2O12.2μl、10×buffer2μl、dNTP1.6μl、PrimerITS1和PrimerITS4各1μl、模板1μl、Taq酶0.2μl。），以94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，4℃保温的条件进行反应扩增。结束后，以该轮的PCR产物作为模板，再次扩增100μl。

凝胶电泳：采用TBE做缓冲液，取1ul6×loadingbuffer和2ul样品（基因组和扩增产物）混匀上样，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统下观察记录结果。

产物纯化：采用离心柱式PCR产物纯化试剂盒（EZ-10SpinColumnPCRProductPurificationKit）纯化PCR产物。纯化后的PCR产物送交生工生物工程上海股份有限公司完成测序。

本发明所述的两种产石杉碱甲闽浙马尾杉菌根真菌genebank登入号分别为：裂褶菌（Schizophyllumcommune）MT39登入号为KF973228，ChaunopycnisalbaMT78登入号为KF973229。ITS碱基序列为：

裂褶菌（Schizophyllumcommune）MT39（SEQIDNO：1）：

TCTTGTTCTGATCCTGTGCACCTTATGTAGTCCCAAAGCCTTCACGGGCGGCGGTTGACTACGTTCTACCTCACACCTTAAAGTATGTTAACGAATGTAATCATGGTCTTGACAGACCCTAAAAAGTTAATACAACTTTCGACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATACCATCAACCCTCTTTTGACTTCGGTCTCGAGAGTGGCTTGGAAGTGGAGGTCTGCTGGAGCCTAACGGAGCCAGCTCCTCTTAAATGTATTAGCGGATTTCCCTTGCGGGATCGCGTCTCCGATGTGATAATTTCTACGTCGTTGACCATCTCGGGGCTGACCTAGTCAGTTTCAATAGGAGTCTGCTTCTAACCGTCTCTTGACTGAGACTAGCGACTTGTGCGCTAACTTTTGACTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAA

ChaunopycnisalbaMT78（SEQIDNO：2）：

CTGTGACATACCTGAACGTTGCCTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCCAACTCGCGGCCCGGACCCAGGCGCCCGCCGGAGGACCCAAACTCTTGCTTTAAACAGTGGCATACTCTCTGAGTCTCACAAACAAAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGGCCCCCCTTCGCGGGGGGGACCTGGTGTTGGGGGCCGGCCGCCCTGCGCGCGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCTCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCACCGGAGCGCGGAGACGGTCACGCCGTAAAACGCCCAACTTTCAAGAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAACCGGAGGAGC

序列比对及进化树构建：将本发明两种闽浙马尾杉菌根真菌18SrDNA序列测序结果全部转换为FASTA格式，在线BLAST检索，与GenBank中其他真菌的18SrDNA序列进行比对，分别与裂褶菌（Schizophyllumcommune），Chaunopycnisalba同源性为100%，同时通过菌株形态特征比较，确定菌株分类的正确。

实施例2

一、本发明闽浙马尾杉菌根真菌的采集

1、从福建省龙岩市连城县冠豸山采回的闽浙马尾杉根际土壤样本，采用土壤稀释分离法分离纯化菌根真菌。称取采样点采集到的闽浙马尾杉根际土壤0.5g，倒入盛有4.5ml的无菌水带玻璃珠的三角瓶中，振荡5min，静置20min，过滤上清液即为10^-1的稀释液。取4支盛有4.5ml无菌水的试管。按10^-2-10^-5编号，用灭菌过的1ml移液枪吸取0.5mL10^-1的稀释液至标有10^-2的试管中用移液枪反复吹吸三次混匀，即为10^-2的稀释液。依法制成10^-3-10^-5的稀释液。用无菌移液枪各吸取稀释液200μl到含有3%链霉素的PDA平板培养基上，用已灭菌的涂布棒，将其涂布均匀。于28℃的恒温培养箱中培养数天。定期观察内生真菌菌落形成情况，3-5天后观察到样品边缘部分有菌丝长出，挑取尖端菌丝转接于新鲜PDA平板，纯化2-3次，保藏纯化得到的菌株。

2、将纯化后的菌株用PDB液体培养基进行发酵培养。

3、PDB液体培养基的制作方法：将洗净后去皮的马铃薯200g切碎，加水至1000ml煮沸半小时，用八层纱布滤去马铃薯，然后加入20g葡萄糖，加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌（121℃高压蒸汽灭菌20min）。

二、本发明闽浙马尾杉菌根真菌菌株发酵液的制备

1、取本发明的闽浙马尾杉根际土壤内生菌根真菌，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌过的固体PDA培养基试管，于28℃活化48小时。

2、取活化后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA培养基，于28℃在140rpm摇床培养72小时，得种子液。

3、将制备好的种子液按10%的量转接入盛有100ml/250ml液体PDA培养基中，于28℃下140rpm摇床培养10天。

4、发酵完后，先取1ml的菌株发酵液，17000rpm离心15min取上清，用于ELISA初筛产石杉碱甲的菌株。剩余发酵液加入30ml的2%酒石酸，静置过夜，超声两次，每次各40min，抽滤收集上清液，用氨水调节至PH值为9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60℃回收二氯甲烷，合并有机相，减压浓缩至干，用10ml无水甲醇分三次加入回收瓶中，溶解，取出吹干，加0.2%甲酸200μl，加入活化好的C-18固相小柱，收集40%甲醇洗脱的样品3ml，吹干，加0.2%甲酸200μl，17000r/min离心10min，取上清液备用。

三、本发明的闽浙马尾杉菌根真菌产石杉碱甲特性的确定

1）ELISA初筛

根据抗原的性质和实验要求，用pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原HupA-OVA稀释成1：200浓度，以100μl/孔，4℃孵育16h。弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水纸上拍干。洗完板加入封闭液，200μl/孔，37℃孵育2h。弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水纸上拍干。在已经封闭好的96孔板内分别加入PBS处理好样品和稀释度为1:8000的石杉碱甲的单克隆抗体（HupA-McAb）各50μl，振荡混匀后，置于37℃孵育1h。弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水纸上拍干。每孔加入新鲜稀释的酶标二抗（HRP-IgG）（稀释度为1：5000）100μl/孔，37℃孵育40min，倒空液体，用PBST洗板3次，每次3min，于吸水纸上拍干。加入新鲜配制的显色液100μl/孔，振荡混匀后，室温孵育10min，密切观察，显色10min后，每孔加入50μl2MH₂SO₄溶液终止反应，振荡混匀，静置5min，使终止彻底，颜色均一。在酶标测定仪上，于波长450nm测定吸光值。

取上述本发明的两种菌株发酵液初提物50μl加入反应体系中进行检测，每个样品加两孔，其值为OD₄₅₀样品，设两个空白，六个PBS溶解的不同浓度石杉碱甲的标准品，空白孔加同体积PBS，石杉碱甲标准品的浓度依次为10⁴，5x10³，10³，5x10²，10²，50ng/ml，对各样品OD₄₅₀值取平均，根据公式抑制率=(B0-B)/B0，计算抑制率，其中B0为空白的值（最大），B为标准品的值，以抑制率为纵坐标，标准品溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线，得到一个回归方程。将样品依同法求抑制率，将其抑制率代入回归方程计算出样品的浓度对数，再求浓度，浓度=10^样品浓度对数。

2）HPLC和LC-MS分析

（1）HPLC(高效液相色谱)条件

色谱条件：色谱柱：XTerraMSC-18(2.1×50mm，5μm)流动相：甲醇︰0.2%甲酸（15:85）；流速：1.00/min；柱温：30℃；进样量：20μl；

（2）LC-MS(质谱条件)条件：离子源：ESI；检测方式：正离子检测；采集方式：MSscan；检测对象：石杉碱甲，m/z（243.2→211.5）；毛细管电压：3.0KV，锥孔电压：35V，离子源温度：110℃，脱溶剂温度：350℃，脱溶剂气流量：654L/hr。

（3）结果分析

本发明的两株菌裂褶菌（Schizophyllumcommune）MT39，ChaunopycnisalbaMT78ELISA筛选，其抑制率分别为92.1%，87.5%。

经过HPLC检测，本发明所述的闽浙马尾杉根际土壤内生菌根菌生物碱成分色谱图如图6所示，图中所示的30.843，是样品裂褶菌（Schizophyllumcommune）MT39目标峰出峰时间，图7所示31.121是样品（Chaunopycnisalba）MT78目标峰出峰时间，石杉碱甲标准品色谱图如图5，图中31.599是目标峰出峰时间，三者有一致的出峰时间。

经过LC-MS检测，图9、图10分别为本发明所述的两株闽浙马尾杉菌根真菌发酵产物目标组分质谱图，其分子离子峰分别为m/z243.51/211.55，如图8；石杉碱甲标准品质谱图分子离子峰分别为m/z243.51/211.55，两株闽浙马尾杉菌根真菌发酵产物目标组分质谱图的分子离子峰与石杉碱甲标准品质谱扫描图一致，可以认定两者是同一组分为石杉碱甲。

本发明所述的产石杉碱甲的闽浙马尾杉菌根真菌裂褶菌（Schizophyllumcommune）MT39，ChaunopycnisalbaMT78是从闽浙马尾杉根际土壤中分离纯化到的丝状真菌，液体发酵后，经ELISA，HPLC，LC-MS检测证明该两株菌能够产生与宿主闽浙马尾杉植物相同的化合物-石杉碱甲，是寻找石杉碱甲新药源的重要微生物，有较大的应用价值。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种闽浙马尾杉菌根真菌，命名为裂褶菌（Schizophyllumcommune）MT39，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCCM2013642。

2.根据权利要求1所述的闽浙马尾杉菌根真菌，其特征在于，它的显微形态为：菌丝棉花状，有隔，分枝，不产孢子。

3.根据权利要求1所述的闽浙马尾杉菌根真菌，其特征在于，它的基因组ITS特征碱基序列如SEQIDNO：1所示。

4.根据权利要求1所述的蛇足石杉菌根真菌，其特征在于，它的菌落培养特征为：PDA培养基28℃培养，转速为140rpm，培养第二天开始出现菌丝球，第五天菌丝球直径变大，发酵液变粘稠，发酵液开始变淡黄色，第九天颜色变深，发酵液变得非常粘稠，其菌落形态为：正面白色，菌丝发达，细腻，背面黄白色。

5.一种闽浙马尾杉菌根真菌，命名为(Chaunopycnisalba)MT78，其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCCM2013643。

6.根据权利要求5所述的闽浙马尾杉菌根真菌，其特征在于，它的显微形态为：菌丝分枝，无隔，孢子梨形，单胞。

7.根据权利要求5所述的闽浙马尾杉菌根真菌，其特征在于，它的基因组ITS特征碱基序列为:SEQIDNO：2.

8.根据权利要求5所述的闽浙马尾杉菌根真菌，其特征在于，它的固体培养菌落特征为：PDA培养基28℃培养，转速为140rpm，第三天明显生长大量菌丝呈颗粒状，第五天发酵液变无色粘稠状液体，第九天菌丝集结成团。其菌落形态为：正面白色，菌丝细小，呈薄膜状，有叶脉状凸起，呈放射状，背面呈脉状放射裂纹，黄白色。

9.一种闽浙马尾杉菌根真菌制备石杉碱甲的方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）取如权利要求1或5任一项所述的闽浙马尾杉菌根真菌，在无菌条件下，用接种针挑取菌丝，接入已灭菌过的固体PDA培养基试管，于28℃活化48小时；

（2）取活化后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA培养基，于28℃在140rpm摇床培养72小时，得种子液；

（3）将制备好的种子液接入液体PDA培养基中，于28℃下140rpm摇床培养10天；

（4）发酵完后，加入2%酒石酸，静置过夜，超声两次，每次各40min，抽滤收集上清液，用氨水调节至PH值为9.0，加入三倍量的二氯甲烷萃取3次，收集萃取液，60℃回收二氯甲烷，用甲醇溶解残留物得到石杉碱甲初提物。

10.根据权利要求1或5任一项所述的闽浙马尾杉菌根真菌制备石杉碱甲的应用。