CN104357365A - 一株产游离葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产游离的葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌，属于发酵技术领域。糖精葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter saccharivorans)L4，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014352。该葡萄糖酸杆菌能够以葡萄糖为底物生产葡萄醛酸，对微生物法生产葡萄糖醛酸奠定了基础。

Description

一株产游离葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌
技术领域
本发明涉及一株产游离葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌，属于发酵技术领域。
背景技术
葡萄糖醛酸(Glucuronic acid)是一种糖醛酸化合物，因其分子中同时存在高反应活性的醛基和羧基，可作为受体与多种人体内源性及外源性有毒物质结合，提高毒性物质的水溶性使其易于随尿与胆汁排出体外，发挥排毒功能，提高机体免疫功能。
葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域也有着广泛的应用，可作为中间物质合成具有防癌抗癌作用的D-葡糖二酸钙、D-葡萄糖二酸1,4-内酯和L-抗坏血酸等，也可作为食品添加剂加入到功能性饮料中。其优势作用正在不断被发掘，有巨大的潜在经济效益。
目前葡萄糖醛酸主要以淀粉为原料在酸性条件下通过硝酸氧化来实现生产。该工艺存在能耗高、选择性差、产品收率低、环境污染严重等问题。以葡萄糖为底物用发酵法生产葡萄糖醛酸成本较低，对环境污染也较小，并且发酵生产葡萄糖醛酸可以大大减轻原料来源的限制。由于缺少能够产游离葡萄糖醛酸的独立菌株，目前，还没有利用单一微生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法。
本发明筛选到以葡萄糖为底物生产游离葡萄糖醛酸的微生物菌株，对该菌株进行了鉴定，确定其为糖精葡糖酸醋杆菌，对其发酵条件进行了初步研究，为微生物发酵法产葡萄糖醛酸奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一株产葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌(Gluconacetobactersaccharivorans)L4，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M2014352。
所述糖精葡糖醋杆菌L4，用GY培养基培养时，菌落呈圆形，表面干燥光滑，边缘规则，培养时间小于5天菌落为白色，培养时间大于5天菌落逐渐变黄色，菌落直径为0.2-0.5mm。菌体革兰氏阴性，100×显微镜下观察细胞呈短杆状。
所述糖精葡糖醋杆菌L4能够发酵生产葡萄糖醛酸，所得葡萄糖醛酸游离于发酵上清液中，而不在胞外多糖中。
所述糖精葡糖醋杆菌L4的筛选是以从新疆长生堂红茶菌中分离的菌株为生产菌株，在初始的发酵培养基(糖茶水，含1.5～3％(m/v)蔗糖的茶叶水)中30℃、200rpm的条件下培养5天，通过液质联用(LC-MS)定性检测发酵上清液中葡萄糖醛酸，再通过离子色谱定量检测发酵上清液中物质的含量，筛选出能以葡萄糖为底物发酵生产游离葡萄糖醛酸的菌株。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述糖精葡糖醋杆菌L4的方法，是将菌株活化后，接种于GY培养基，28-30℃，200-220r/min摇床培养4-5天。发酵上清液中含有葡萄糖醛酸。
所述GY培养基含有葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L。
本发明提供的菌株能将较廉价的底物葡萄糖转化成具有高附加值的葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸直接分离到发酵上清液中，而不是混于胞外多糖，较化学生产法具有反应条件温和，产品工艺简单，生产过程易于控制，可用于食品和药物生产等优点，同时有利于保护环境，易于推广使用。
生物材料保藏
一株糖精葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter saccharivorans)L4，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M2014352。
附图说明
图1葡萄糖醛酸质谱图，A：葡萄糖醛酸标样一级质谱图；B：Gluconacetobactersaccharivorans L4发酵上清液中葡萄糖醛酸质谱图。
图2葡萄糖醛酸离子色谱图，A：葡萄糖醛酸标样，出峰时间10.117min；B：Gluconacetobacter saccharivorans L4发酵上清液中葡萄糖醛酸离子色谱图，出峰时间10.150min。
具体实施方式
胞外多糖中葡萄糖醛酸的检测方法：
将菌体在GY培养基中30℃、200r/min条件下培养72h，以8000rpm离心15min，取清液。将4倍上清液体积的乙醇加入到上清液中，并将混合物保持在4℃下过夜。以8000r/min离心15分钟收集沉淀。将沉淀干燥，加入5倍上清液体积的0.5mol/L的H2SO4溶液，在70℃反应3h。将水解液通过0.45μm滤膜过滤，LCMS检测产物。
葡萄糖醛酸检测方法的确定：
葡萄糖醛酸的标样在Shimadzu Shim-Pack VP-ODS(150mm×2.0mm,5μm)柱上通过离子阱-飞行时间液质联用仪(LCMS-IT-TOF)进行分析，保留时间为1.85-2.48min。所用的液质联用仪为日本岛津(Shimaduz)公司制造，确定的色谱条件为：流动相：含0.01％甲酸和1mmol/L甲酸铵的75％的甲醇水溶液；流速：0.75mL/min；平衡温度：40℃；进样量：5μL；质谱条件：干燥气流速10L/min，喷雾器1.5L/min，气体温度200℃，电离方式为ESI负极模式，单反应监测离子150-300m/z，累积时间30ms，ESI电压170kV，碎裂能量60％。
产物的定性检测：采用LCMS-IT-TOF液质联用鉴定产物中是否有葡萄糖醛酸，将发酵液在10000g离心5min后，取上清液，用超纯水稀释10倍，0.22μm孔径的微滤膜过滤，进样检测。液相色谱条件：流动相为含0.01％甲酸、1mM甲酸铵的75％的甲醇水溶液，流速0.75mL/min，柱温40℃，进样量5μL。质谱条件：干燥气流速10L/min，喷雾器1.5L/min，气体温度200℃，电离方式为ESI负极模式，单反应监测离子150-300m/z，累积时间30ms，ESI电压170kV，碎裂能量60％。
产物的定量检测：用离子色谱法(IC)检测发酵液中产葡萄糖醛酸的生成量。将发酵液在10000g离心5min后，取上清液，用超纯水稀释10倍，0.22μm孔径的微滤膜过滤。离子色谱条件：采用戴安ICS-5000离子色谱仪，脉冲安培检测器，CarboPac PA200分析柱(3mm×250mm)，流动相为250mmol/L氢氧化钠-水；流速：0.5mL/min。葡萄糖醛酸在离子色谱上保留时间为1.85-2.48min。
GYC培养基：葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L，碳酸钙20g/L。添加琼脂20g/L得到GYC固体培养基。
GY培养基：葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L，去离子水1L。
实施例1 糖精葡糖醋杆菌的筛选
取少量红茶菌菌膜在GYC培养基中富集，30℃，200r/min摇床培养48h，依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10-75个梯度，分别取稀释后的样品各200μL涂布于加入100mg/mL纳他霉素的GYC固体培养基，每个稀释梯度重复2次。挑单菌落在30℃培养72h。挑选有透明圈的单菌落接种于GY培养基，30℃，200r/min摇床培养至对数期取样保藏，收集培养72h发酵液，离心，取上清液以备检测。从筛选得到的诸多菌中筛选得到一株产量最高的葡糖醋杆菌进行下一步的菌株鉴定。
实施例2 目的菌株的鉴定：
(1)16S rDNA比对鉴定
提取出发菌株的基因组DNA，以出发菌株的基因组DNA为模板，使用细菌16S rDNAPCR通用引物27F、1492R进行扩增。
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mol/L的引物27F和1492R各1.5μL,2×SuperPfu Mixture25μL,模板1μL，加双蒸水补齐至50μL:；PCR条件为：94℃,3min,94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1.5min,30循环，68℃延伸8min.
用胶回收试剂盒纯化PCR产物，核酸电泳验证。16S rDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在NCBI中与已有序列进行Blast比对分析，结果表明其与Gluconacetobacter saccharivorans的16S rDNA序列相似性最高，将其命名为：Gluconacetobacter saccharivorans L4。
(2)形态生理生化分析
该菌株的形态学特征为菌落圆形，表面干燥光滑，边缘规则，培养时间小于5天菌落为白色，培养时间大于5天菌落逐渐变黄色，菌落大小0.2-0.5mm,用GY培养基培养。菌体革兰氏阴性，100×显微镜下观察细胞呈短杆状。
实施例3 胞外多糖中葡萄糖醛酸检测方法的确定：
将菌体在GY培养基中30℃、200r/min条件下培养72h，以8000rpm离心15min，取上清液。用4倍上清液体积的乙醇加入到上清液中，并将混合物保持在4℃下过夜。以8000r/min离心15分钟收集沉淀。将沉淀干燥，加入5倍上清液体积的0.5mol/L的H2SO4溶液，在70℃反应3h。将水解液通过0.45μm滤膜过滤，LCMS检测产物，检测结果显示胞外多糖中不含有葡萄糖醛酸。
实施例4 产物的定性检测：
测定葡萄糖醛酸标样LC-MS图谱，并将实施例1中得到的G.saccharivorans L4的发酵液上清稀释10倍后用于LC-MS检测，与标样图谱进行对比分析，如图1所示，在2min处质谱扫描图中葡萄糖醛酸标样的分子量大小为193.0369，样品在同一时间处检测到相同分子量(193.0370)的物质，确定发酵液中含有葡萄糖醛酸。
实施例5 用离子色谱法(IC)检测发酵液中产葡萄糖醛酸的生成量。
实施例1中得到的G.saccharivorans L4的发酵液上清用超纯水稀释10倍，0.22μm孔径的微滤膜过滤。如图2所示，定量检测显示发酵液中葡萄糖醛酸含量为15.88mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一株产葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter saccharivorans)L4，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M2014352。
2.权利要求1所述的糖精葡糖醋杆菌L4在葡萄糖醛酸生产中的应用方法。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，是将菌株活化后，接种于GY培养基，28-30℃，200-220r/min摇床培养4-5天。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述GY培养基含有葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L。
5.权利要求1所述的糖精葡糖醋杆菌L4的应用。
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