CN105543250B - 亮菌漆酶基因及其重组毕赤酵母工程菌和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亮菌漆酶及其基因，发明人据此构建了重组毕赤酵母工程菌，使用该工程菌可实现高效发酵获取重组亮菌漆酶。在毕赤酵母异源表达的基础上，发明人对这个酶蛋白进行纯化和酶学活性研究，结果表明，本发明的漆酶具有漆酶活性，亮菌漆酶或重组亮菌漆酶能有效催化2，4‑二氯苯酚降解，金属铜离子对该漆酶活性有促进作用，而锰离子、锌离子、镁离子、钙离子、银离子和SDS对其活性具有抑制作用。对制备的重组漆酶的稳定性分析显示，该重组漆酶的稳定性很好，而且对酸性环境有较高的耐受性，应用价值巨大。

Description

亮菌漆酶基因及其重组毕赤酵母工程菌和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域和环境生物领域，尤其涉及一种亮菌漆酶基因及其重组毕赤酵母工程菌和应用，具体涉及来源于亮菌的真菌漆酶基因。
背景技术
改革开放30年来，我国的经济和工业得到了前所未有的发展，然而工业发展造成环境的严重污染已是不争的事实。环境污染已成为经济发展的瓶颈、人类生存的威胁，同时也成为当前国际关系、经贸合作中一个极为重要的问题，日益严重地影响着我国国民经济的可持续发展。目前，我国工业尤其是造纸和纺织印染工业的废水对环境的污染十分严重。研究显示，我国造纸行业年排放废水量达40亿吨，占全国工业废水排放量的1/6，其中有机污染物(以BOD计)达170万吨，约占全国工业废水中有机污染物总量的1/4。在用植物原料进行化学制浆与化学漂白过程中，含有大量木质素、半纤维素和有毒有害物质的废液被排入江、河及湖泊中，造成了严重的环境污染和生态破坏。
造纸工业是广西的特色产业之一。广西是产糖大户，2010年，广西糖料蔗种植面积达1600万亩，甘蔗总产量达7119.6万吨，食糖总产量710万吨，糖料蔗种植面积和食糖产量均占全国总量的一半以上，高居全国首位，拥有非常丰富的甘蔗渣原料。研究表明，甘蔗渣中纤维素为32％～48％、半纤维素约为19％～24％、木质素约为23％～32％、其它约为4％，是一种良好的制浆造纸原料。目前，甘蔗渣已成为广西造纸的主要原料之一。造纸工业已被列入广西千亿元产业规划，预计2020年产值达到1200亿。因此，造纸业产生的污染不能忽视。造纸工业过程中排放的污水中经常含有二噁英，呋喃和有毒化学物质(如丹宁酸、苯酚、树脂、脂肪酸等)。据2009年广西污普数据统计，全区工业废水COD排放量约123.6万吨，其中制浆造纸行业COD排放量约为30.7万吨，占全区工业废水COD排放量的24.8％，是广西主要的工业污染行业。
能源短缺、环境污染等危机频临，绿色可再生资源利用迫在眉睫。木质纤维素是地球上含量最丰富的可再生碳水化合物，充分地有效利用木质纤维素降解酶和生物化工将其转化为液体燃料和化工原料(如乙醇，丁醇等)，对缓解以上危机具有重大意义。目前，广泛用于产木质纤维素降解酶的微生物菌株来自木霉属(Trichoderma sp.)，主要包括外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase，CBH，EC 3.2.1.91)、内切葡聚糖酶(endoglucanase，EG，EC3.2.1.4)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL，EC 3.2.1.21)。纳米级植物显微技术显示纤维素和半纤维素被坚不可摧的木质素包围，很难直接被纤维素降解酶水解，需要进行预处理去除或分解木质素。工业上大规模利用化学预处理木质纤维素，既耗能也污染环境。用木质素降解酶生物预处理是良好的选择。木质素降解酶主要包括木质素过氧化物酶(ligninperoxidases，LiP，EC 1.11.1.14)、锰过氧化酶(manganese peroxidases，MnP，EC1.11.1.13)、漆酶(LacAT，Lac，EC 1.10.3.2)，广泛来源于白腐真菌、褐腐真菌和软腐真菌(Wong，2009)。研究显示，木质纤维素降解酶和木质素降解酶成本高，产量低，不能满足工业需求。因此，开发新型高效的产纤维素降解酶和木质素降解酶的微生物资源极为重要。
漆酶是单电子氧化还原酶，具有广泛的底物专一性，可氧化的底物包括：酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，主要应用于工业和化学反应。目前漆酶的研究内容涉及到发酵工程、生物化学、分子生物学及遗传学等多领域，包括菌株的生长特征、合成调控、分离纯化、催化机制、条件优化、基因克隆表达等方面。研究表明，漆酶可以使苯氧基类除草剂和石油工业的废水除去毒性，在制浆造纸应用方面已应用于漂白、制浆、脱墨、废水处理、纤维改性等，如用云芝的粗漆酶液(2474.2IU/mL)对50mg/L的靛蓝溶液进行脱色，作用40min，脱色率达到94.8％。随着研究的深入，漆酶的应用愈加广泛，可用于生物、化学、物理、医学、食品、环境保护等多个领域，特别是在多种有毒化合物和木质素的降解、纸浆的生物漂白等多方面发挥着重要作用，能节约设备和能耗，缩短纸浆生产周期，降低生产成本，将会给造纸工业带来良好的经济效益和社会效益。研究显示，一些白腐真菌漆酶可以降解木质素，但是需要相应的化合物(称为中介)作为漆酶的作用底物，如黎芦醇、愈创木酚、ABTS、二甲苯胺、阿魏酸、丁香醛、单宁酸、香草酸、香豆酸等，它们在结构上的共同特征是芳环上通常连有-OH或-NH2基团。近年来，大约20多种不同来源的漆酶得到纯化，并对其性质进行了研究，为漆酶的工业化生产和应用奠定了基础。显然，漆酶是一种具有广阔应用领域和巨大市场价值的生物酶。
大量的实验研究证明，不同发酵方法对真菌分泌漆酶有很大影响，而且多种漆酶自身的表达量很低，例如中科院微生物所得到的漆酶高产血红密孔菌菌株P.sanguineusMK528，其摇瓶发酵漆酶单位体积产酶能力为63U/mL，达到国内领先水平。因此，只有在异源宿主上表达重组漆酶蛋白才是解决这一问题的关键，如白腐菌Polyporus grammocephalusTRl6漆酶基因异源表达，其产酶能力达到893.3U/ml。
亮菌(Armillariella tabescens)，学名假密环菌[Armillariella tabescens(Scop.ex.Fr.)Sing]，属白蘑科蜜环菌属，因其在黑暗的夜晚可以发出淡蓝色荧光，故得名亮菌。近年的研究证明亮菌是我国拥有自主知识产权的重要药用真菌，其提取物具有抗辐射、抗乙肝病毒等作用，可治疗肝炎、胆囊炎、胃炎、新生儿高胆红素血症等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种亮菌漆酶基因及其重组毕赤酵母工程菌和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：亮菌漆酶基因，具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列或者具有编码序列表SEQ.ID.NO.2氨基酸序列的碱基序列。
亮菌漆酶为亮菌漆酶基因编码的蛋白质，它具有序列表SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。
重组毕赤酵母工程菌，携带含亮菌漆酶基因的表达载体。
上述重组毕赤酵母工程菌的构建方法，将亮菌漆酶基因编码的cDNA连入到毕赤酵母表达载体pPIC9K，得到重组表达载体pPIC9K-LacAT；再将重组表达载体pPIC9K-LacAT质粒线性化后电转化至GS115菌株，得到异源重组酵母工程菌GS115-PIC9K-LacAT。
上述重组毕赤酵母工程菌的构建方法，按以下操作进行：取20μl线性化的单拷贝质粒分别加入80μl GS115感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击，电压：1500V，电击时间5.2ms，电击完成后，立即加入1ml 1M预冷的山梨醇，混匀后转移到1.5ml离心管中，30℃，静止1-2h，每200μl涂一块含0.5mg/ml G418的MD平板，30℃，培养2d，形成分散，饱满的单克隆。
上述重组毕赤酵母工程菌用于发酵获取重组亮菌漆酶。
上述亮菌漆酶或重组亮菌漆酶在催化氯酚降解中的应用。
氯酚为2，4-二氯苯酚。
亮菌漆酶或重组亮菌漆酶在55℃、pH 3.5的条件下催化氯酚降解。
为充分利用我国所特有药用真菌——亮菌，发明人在前期亮菌固体发酵产生漆酶的初步探索后又进行了深入研究，获得了亮菌漆酶及其基因，并据此构建了重组毕赤酵母工程菌，使用该工程菌可实现高效发酵获取重组亮菌漆酶。在毕赤酵母异源表达的基础上，发明人对这个酶蛋白进行纯化和酶学活性研究，结果表明，本发明的漆酶具有漆酶活性，亮菌漆酶或重组亮菌漆酶能有效催化2，4-二氯苯酚降解，金属铜离子对该漆酶活性有促进作用，而锰离子、锌离子、镁离子、钙离子、银离子和SDS对其活性具有抑制作用。对制备的重组漆酶的稳定性分析(最适作用pH/温度)显示，该重组漆酶的稳定性很好，而且对酸性环境有较高的耐受性，在pH的偏酸性环境中，酶活力较高，活性较稳定，最适反应pH为3.5，最适反应温度为55℃，酶动力学常数Km＝0.1097mM；Vmax＝21.51mmol/min，这预示着亮菌漆酶——这一新型来源的漆酶可能有巨大的应用价值。
附图说明
图1是PCR扩增LacAT基因ORF电泳图谱，图中：M是SMO311maker；1-3为空白对照；4为目的片段。
图2是纯化漆酶的SDS-PAGE分析图谱(GS115/pPIC9K-Laccase gene转化子分别记为：GS115/pPIC9K-L1-L11)图中：M是标准蛋白质分子量；阴性对照：GS115/pPIC9K，L-1至L-11分别为：L-1、L-2、L-3：BMMY；L-4、L-6、L-7：BMMY+0.3mM CuSO4；L-8、L-9、L-10、L-11：BMMY+0.3M CuSO4+0.01％丙氨酸。
图3是纯化漆酶的western blot分析图谱(GS115/pPIC9K-Laccase gene转化子分别记为：GS115/pPIC9K-L1-L11)，图中：M是标准蛋白质分子量；阴性对照：GS115/pPIC9K，L-4、L-8、L-9、L-10分别是为：L-4：BMMY+0.3mM CuSO4；L-8、L-9、L-10：BMMY+0.3M CuSO4+0.01％丙氨酸。
图4是纯化重组漆酶的最适pH曲线。
图5是纯化重组漆酶的pH稳定性柱状图。
图6是纯化重组漆酶的最适温度曲线。
图7是纯化重组漆酶的不同金属离子耐受性曲线。
图8是纯化重组漆酶对2，4-氯酚降解率柱状图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下通过实例具体说明。其中，如无特殊说明，所用方法均为常规方法；所用的材料均购自常规生化试剂商店；实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量，定量试验均设置三次重复实验，结果取平均值。
一、材料准备
1、所用亮菌品种
亮菌(A.tabescens)菌株由浙江医药高等专科学校生物药物研究所保藏。本发明试验中的亮菌为浙江医药高等专科学校凌庆枝教授惠赠。
实验用甘蔗渣来自于广西农业科学院农产品质量安全与检测技术研究所，60℃烘干粉碎，过60目筛，备用。
2、培养基：
基础PDA固体培养基(1L)：马铃薯200g、葡萄糖20g、MgSO4·7H2O 1.5g、KH2PO4 3g、VB10.05g、琼脂粉18g。
种子培养基(1L)：玉米粉20g、(NH4)2SO4 25g、CuSO4 0.2g、CaCl2 4.8g、KH2PO4 5g，MgSO4·7H2O 5g，VB10.05g、琼脂粉18g。
甘蔗渣培养基(1L)：(1)：甘蔗渣250g、葡萄糖5g、(NH4)2SO4 25g、CuSO4 0.2g、CaCl24.8g、KH2PO4 5g，MgSO4·7H2O 5g，VBl 0.05g、琼脂粉18g；(2)：5.0g甘蔗渣，65％无菌水。
3、固体发酵培养
发明人前期已经研究得出亮菌在固体发酵时可以产生漆酶，产酶条件为：固体发酵培养基中，150r/min、25℃恒温振荡培养。
亮菌菌株在种子培养基25℃活化7d，转接直径相等大小(5mm)的菌丝块到甘蔗渣培养基，25℃固体发酵培养10周，培养过程中观测亮菌菌丝生长情况。
4、亮菌菌丝RNA小量提取
用Trizol法，操作步骤如下：
(1)准备专用枪头和离心管，研钵、研钵棒和铁勺等器具，高温高压灭菌4h。
(2)在研钵中倒入液氮预冷，将-80℃保存备用的菌丝约0.2g倒入研钵中，倒入足量液氮，同时用钵棒轻轻挤压样品，待液氮还有少量剩余时，立刻迅速有力的研磨样品至白色细粉末状，重复3-4次，液氮研磨时，不要让液氮挥发干净，以防止造成内源RNase对RNA的降解。
(3)用预冷的离心管刮取样品，立刻加入1mL预冷的Trizol试剂，上下剧烈振荡混匀，室温静置15min，直至明显分层为止。注意要选择合适的裂解液，并且量要多，裂解要充分。
(4)12,000rpm，离心5min，吸取上清，移至新1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，上下振荡，室温放置5min，12,000rpm，离心10min，小心吸取上层水相至新1.5mL离心管中。
(5)加入等体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置30min，12,000rpm，4℃离心15min，弃上清。
(6)75％乙醇荡洗沉淀2-3次，温和振荡，悬浮沉淀，12,000rpm，离心5min，用枪头小心移去上清，晾干至透明状。
(7)用30μL DEPC-H2O溶解沉淀，取2μL 1％进行琼脂糖电泳。检测合格的RNA样品可直接进行下步试验，或保存于-80℃中。
5、各步骤中所用到的引物(见表1)。
表1本研究所用的引物
二、RACE法获得LacAT完整ORF
1、cDNA的合成
根据不同的需要，进行反转录，得到不同的cDNA，见表2。
表2中间片断、3’端和5’端cDNA的合成
2、中间片断、3’端和5’端cDNA片段PCR扩增
(1)中间片断
采用冰上操作，反应体系及具体操作条件见表3和表4。
表3反应体系
反应系统 体积
10×Buffer(含Mg<sup>2+</sup>) 2μL
dNTP(2.5mM) 1.6μL
P1：LacAT上(10μM) 1μL
P2：LacAT下(10μM) 1μL
OligoT18反转录产物稀释5倍 1μL
Ex-Taq 0.3μL
ddH<sub>2</sub>O 13.1μL
total 20μL
表4反应操作条件
检测：1％琼脂糖电泳，有1176bp目的片断，阴性对照无带。
(2)3’Race(3’端)
采用冰上操作，反应体系及具体操作条件见表5和表6。
表5反应体系
反应系统 体积
2×ES 5μL
P1：LacAT 3’上游(10μM) 0.4μL
P2：M(10μM) 0.4μL
3’race反转录产物 0.4μL
Ex-Taq 0.25μL
ddH<sub>2</sub>O 3.8μL
total 10μL
表6反应操作条件
检测：1.2％琼脂糖电泳，有200bp目的片断出现，阴性对照无带。
(3)5’Race
使用快速扩增cDNA 5’末端试剂盒(SMARTerTM RACE cDNA)，具体操作按说明书进行。
检测：1.2％琼脂糖电泳，出现900bp目的片断，阴性对照无带。
(4)测序
将DNA片断的回收，连接、转化、质粒小提、酶切验证、穿刺、测序，使用生物信息Vector NTI 8.0软件、NCBI进行序列分析。
3、LacAT全长基因ORF PCR扩增验证
将LacAT基因的中间片断、3’和5’片断的测序结果进行分析，根据重叠区拼接全长cDNA。NCBI获得ORF，设计引物，用高保真酶再次扩增，所用模板应来自同一个转录本，保证序列的可靠性。
(1)RT-PCR(50μL体系)
采用冰上操作，反应体系及具体操作条件见表7和表8。
表7反应体系
反应系统 体积
10×Buffer(含Mg<sup>2+</sup>) 5μL
dNTP(2.5mM) 4μL
P1：LacAT ORF上(10μM) 2μL
P2：LacAT ORF下(10μM) 2μL
OligoT18反转录产物原液 1μL
Ex-Taq 0.25μL
ddH<sub>2</sub>O 35.75μL
total 50μL
表8反应操作条件
检测：1％琼脂糖电泳，有约1600bp目的片断出现，阴性对照均无带(如图1所示)。
(2)测序
将DNA片断的回收，连接、转化、质粒小提、酶切验证、穿刺、上海生工测序，使用生物信息Vector NTI 8.0软件、NCBI进行序列分析。
结果：本发明获得亮菌漆酶的全长ORF序列，如SEQ.ID.NO.1所示，其ORF编码序列为1560bp的cDNA序列；漆酶基因LacAT编码519aa氨基酸，序列如SEQ.ID.NO.2所示。
三、LacAT毕赤酵母表达
1、将LacAT基因在毕赤酵母中电转化并PCR检测，获得阳性克隆菌株。
(1)质粒SacI线性化
(2)毕赤酵母GS115感受态细胞的制备和转化
A.感受态制备
挑取YPD平板上GS115菌株分别接种进入20ml YPD培养基，29℃，220rpm培养至OD＝1.3-1.5，然后冰浴30min。4℃，1500rpm，离心5min沉淀细胞，于10ml冰冷的无菌去离子水悬浮。4℃，1500rpm，离心5min沉淀细胞，于5ml冰冷的无菌去离子水悬浮。4℃，1500rpm，离心5min沉淀细胞，于2ml冰冷的无菌1M山梨醇悬浮。4℃，1500rpm，离心5min沉淀细胞，于200μl冰冷的无菌1M山梨醇悬浮。
B.转化
取20μl线性化的单拷贝质粒分别加入80μl GS115感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击，电压：1500V，电击时间5.2ms，电击完成后，立即加入1ml 1M预冷的山梨醇，混匀后转移到1.5ml离心管中，30℃，静止1-2h，每200μl涂一块含0.5mg/ml G418(遗传霉素)的MD平板。30℃，培养2d，形成分散，饱满的单克隆。转化子名为GS115/pPIC9K-LacAT。
(3)PCR鉴定
以pPIC9K-LacAT gene质粒为模板，55℃退火，30个循环，使用载体通用引物5’AOX(5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)/3’AOX(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)，采用标准PCR体系扩增，各15μl体系。
2、GS115/pPIC9K-LacAT分泌表达小试
培养基BMMY，甲醇诱导浓度0.5％，诱导温度20℃，220rpm诱导表达3天。摇瓶发酵结束后取样进行SDS-PAGE。样品制备如下：取600μl菌悬液离心收获上清，取200μl上清，采用生TCA沉淀试剂盒沉淀蛋白(BSPO12)。最终蛋白重悬液体积为20μl。
SDS-PAGE：目标LacAT gene蛋白，理论大小约为56KD，60KD上方有明显条带(如图2所示)，疑似目的蛋白，Western Blot鉴定为阳性(如图3所示)，跟小试表达相符。
3、表达纯化检测
根据小试表达结果，培养基BMMY(含0.3mM CuSO4和0.01％丙氨酸)，甲醇诱导浓度0.5％，发酵温度20℃，接种量为4％，220rpm诱导表达4天。摇瓶培养1.6L进行纯化，12000rpm，离心20min离心，收集上清进行做镍柱亲和层析，如下：
a.取10mLNi-NTA，用10倍柱床体积的Binding Buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。将上清与柱料混匀，4℃孵育3h。
b.样品上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。
c.10倍柱床体积的Binding Buffer清洗柱子，流速10mL/min。
d.Wash Buffer洗杂，流速5ml/min，收集洗脱液。
e.Elution Buffer洗脱，流速2ml/min，收集洗脱液。
通过SDS-PAGE电泳分析后，将500mM咪唑洗脱组分透析到20mMTris，5μM CuS04，pH7.4的透析buffer中。过滤分装，-80℃保存。
融合蛋白经过镍琼脂糖亲和层析法进行纯化，SDS-PAGE检测为阳性。
四、纯化的重组漆酶的酶学特性分析
1、重组漆酶酶活的测定
以ABTS(ε420＝36,000M-1cm-1)为底物，4mL反应混合液中，含50mM ABTS(2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)，4μL漆酶酶液和100Mm乙酸-乙酸钠(pH3.5)，55℃水浴保温反应5min后，420nm处测定吸光度。
漆酶酶活力定义：以1min内催化氧化1μmol底物的量为1个酶活单位(U)。
漆酶活力计算公式：酶活(U/L)＝ΔOD×n×4ml×106/(4×10-3×ε×4×Δt×1cm)；
其中：n：酶液稀释倍数；ΔOD：吸光度的变化；\ε：摩尔吸光系数(3.6×104L/cm·mol)。
2、最适pH和pH稳定性的测定(如图4和图5所示)
以ABTS为底物，在55℃下测定pH 2.5-6.5(乙酸-乙酸钠缓冲液)酶活的变化。将重组漆酶置于缓冲液中，4℃处理24h，pH6.0，45℃条件下测定被处理后的酶活力，同时以等量未经处理的酶液作为正对照，活力设为100％。以ABTS为底物，测定在pH2.5-6.5范围下的酶活力。
结果显示重组漆酶作用于ABTS的最适pH是3.5，而且在酸性pH环境下比较稳定，在经过24h处理后酶活力仍然可以保持90％以上，显示出该酶对酸性环境有较高的耐受性。
3、最适温度和温度稳定性的测定(如图6所示)
将重组漆酶在pH3.5条件下，以1mM ABTS为底物，测定其在25℃-65℃范围内的酶活力变化。
4、不同金属离子对纯化漆酶影响的测定(如图7所示)
在不同浓度CuCl2、MnCl2、MnCl2、ZnCl2、MgCl2.6H2O、CaCl2、EDTA.Na2、AgNO3和SDS，以I mM ABTS为底物，测定重组漆酶在pH3.5，55℃条件下酶活力的变化。
结果显示，金属铜离子对该漆酶活性具有有促进作用，而锰离子、锌离子、镁离子、钙离子、银离子和SDS对其活性具有抑制作用。
五、纯化的重组漆酶对2，4-二氯苯酚的降解作用分析(如图8所示)
在10Mm体系中，含有20mM 2，4-二氯苯酚，20mL重组漆酶和100mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.5)。该反应体系在30℃/40℃反应1h，对前后氯酚浓度进行测定。结果显示，重组亮菌漆酶可以作用于2，4-二氯苯酚，1h内的降解率为56％。

Claims (9)

1.一种亮菌漆酶基因，其特征在于为序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。
2.一种亮菌漆酶，其特征在于为序列表SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。
3.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于携带含权利要求1所述亮菌漆酶基因的表达载体。
4.权利要求3所述重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：将权利要求1所述亮菌漆酶基因连入到毕赤酵母表达载体pPIC9K，得到重组表达载体pPIC9K-LacAT；再将重组表达载体pPIC9K-LacAT质粒线性化后电转化至GS115菌株，得到异源重组酵母工程菌GS115-PIC9K-LacAT。
5.根据权利要求4所述重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于按以下操作进行：取20μl线性化的单拷贝质粒加入80μl GS115感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击，电压：1500V，电击时间5.2ms，电击完成后，立即加入1ml1M预冷的山梨醇，混匀后转移到1.5ml离心管中，30℃，静止1-2h，每200μl涂一块含0.5mg/ml G418的酵母MD平板，30℃，培养2d，形成分散，饱满的单克隆。
6.权利要求3所述重组毕赤酵母工程菌在发酵获取重组亮菌漆酶中的应用。
7.权利要求2所述亮菌漆酶在催化氯酚降解中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述氯酚为2,4-二氯苯酚。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述亮菌漆酶在55℃、pH 3.5的条件下催化氯酚降解。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109337877B (zh) * 2018-10-31 2021-11-12 安徽农业大学 二氯苯酚降解酶TcpA及其编码基因与生产菌的应用
CN113462701B (zh) * 2021-09-03 2021-11-26 佛山市玉凰生态环境科技有限公司 一种高温多酚氧化酶及其在含酚废水处理中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1807644A (zh) * 2006-01-25 2006-07-26 暨南大学 一种β－甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法
RU2007103735A (ru) * 2004-08-17 2008-09-27 Гуанчжоу Ко-Уин Байоэнджиниринг Ко., Лтд. (Cn) Детоксифизим с активностью преобразования афлатоксина и ген, кодирующий детоксифизим
CN103736241A (zh) * 2013-12-23 2014-04-23 丽水学院 一种生物降解氯酚类化合物的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2007103735A (ru) * 2004-08-17 2008-09-27 Гуанчжоу Ко-Уин Байоэнджиниринг Ко., Лтд. (Cn) Детоксифизим с активностью преобразования афлатоксина и ген, кодирующий детоксифизим
CN1807644A (zh) * 2006-01-25 2006-07-26 暨南大学 一种β－甘露聚糖酶基因及其编码产物的氨基酸序列和制备方法
CN103736241A (zh) * 2013-12-23 2014-04-23 丽水学院 一种生物降解氯酚类化合物的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The furofuran-ring selectivity, hydrogen peroxide-production and low Km valur are the three elements for highly effective detoxification of aflatoxin oxidase;Yuan-Zhen Wu等;《FOOD and Chemical Toxicology》;20151231;第76卷;第125-131页 *
亮菌漆酶的初步研究;凌庆枝等;《食品科学》;20091231;第30卷(第19期);第190-193页 *
亮菌的临床应用与研究进展;杨丽红等;《北方药学》;20131231;第10卷(第3期);第66-67页 *

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