CN103736241A - 一种生物降解氯酚类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物降解氯酚类化合物的方法，所述方法包括：以亮菌（Armillariella tabescens）经发酵获得的亮菌漆酶为生物催化剂，在50～60℃、pH3.6～4.5下对废水中的氯酚类化合物进行降解，所述氯酚类化合物为下列之一或其中两种以上的混合物：2，4-二氯苯酚、2-氯苯酚、4-氯苯酚。氯酚类化合物是环境污染中危害最严重的有机物，采用本发明方法可有效地予以降解，反应快速，作用14h，对氯酚类化合物的降解率可达到50%～90%。

Description

一种生物降解氯酚类化合物的方法

（一）技术领域

本发明涉及一种生物降解氯酚类化合物的方法。

（二）背景技术

随着工业的飞速发展，经济得到了发展，但环境污染也越来越严重。氯酚类化合物是一类难降解化合物，长期以来被广泛应用于木材防腐、杀虫剂以及除草剂的生产中；其中2,4-二氯苯酚（DCP）是一种有毒、难降解的污物，广泛存在于农药、燃料和增塑剂等的生产废水中。美国、中国等国家已把其列入水中有害物质或优先污染物“黑名单”。因此，如何消除环境中氯酚类化合物的污染成为受到广泛重视的课题。目前常见的控制氯酚污染的方法有超滤法、化学沉降法、活性污泥法、好氧/厌氧法等。近年来，随着生物技术的日益成熟，生物降解法去除氯酚类污染物逐渐占据了主导地位。

目前，人们对于酶在环境领域中的应用开展了广泛的研究。漆酶（laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜离子的多酚氧化酶。它最早在日本紫胶漆树的渗出液中发现，随后在许多昆虫和各种真菌，甚至细菌中也发现。现将漆酶按其来源主要分为漆树漆酶（rhus laccase）和真菌漆酶（fungallaccase）。漆酶的作用底物比较广泛，不同漆酶的作用范围也不尽相同。

亮菌（Armillariella tabescens），学名假密环菌[Armillariella tabescens（Scop.ex.Fr.）Sing]，属白蘑科蜜环菌属，最早于20世纪60年代在江苏省丹徒县民间用来治疗当地俗称的“膈食病”，近年的研究证明亮菌具有抗辐射、抗乙肝病毒等作用，可治疗肝炎、胆囊炎、胃炎、新生儿高胆红素血症等。亮菌主产于安徽、江苏、浙江等地，是重要的药用真菌。目前还未有亮菌漆酶用于氯酚类化合物降解的报道。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种利用亮菌漆酶生物降解氯酚类化合物的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种生物降解氯酚类化合物的方法，所述方法包括：以亮菌（Armillariella tabescens）经发酵获得的亮菌漆酶为生物催化剂，在50～60℃、pH3.6～4.5下对废水中的氯酚类化合物进行降解，所述氯酚类化合物为下列之一或其中两种以上的混合物：2，4-二氯苯酚、2-氯苯酚、4-氯苯酚。在上述条件下降解14h，氯酚类化合物的降解率可达到60%～90%。亮菌漆酶为耐高温型漆酶，性质稳定，分子量约为50～60kD。

所述生物催化剂可为亮菌经发酵获得的发酵液经细胞破碎、分离所得粗酶液，由如下方法获得：将亮菌接种至发酵培养基，24℃～29℃、100～160r/min避光培养5～10天，发酵液经细胞破碎后过滤，取上清液即为所述粗酶液；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～30g/L，蛋白胨10～20g/L，KH₂PO₄1～10g/L，MgSO₄·7H₂O0.5～2.0g/L，(NH₄)₂SO₄1～5g/L，玉米粉10～30g/L，溶剂为水，pH5.5～6.5。

通常，所述菌株在发酵培养之前还需进行常规活化培养和种子扩大培养，具体方法可如下：

活化培养：无菌条件下接种于斜面或平皿培养基，26℃避光培养7d；培养基组成：葡萄糖20g/L，琼脂粉18g/L，土豆汁200g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，KH₂PO₄3g/L，VB₁0.05g/L，溶剂为水。

种子扩大培养：无菌条件下用打孔器（直径0.5cm）量取2块平皿培养基的菌丝块，捣碎，接种至种子培养基中（250mL三角瓶装液100mL），置27℃摇床，120r/min，避光培养4～7d，得种子液，种子液再以5～10%体积比接种至发酵培养基即可；种子培养基组成如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，KH₂PO₄5g/L，MgSO₄·7H₂O1g/L，(NH₄)₂SO45g/L，玉米粉20g/L，溶剂为水，pH6.0；

所述生物催化剂也可为上述粗酶液经盐析或透析、柱层析获得的纯化的亮菌漆酶。

具体的，废水中的氯酚类化合物初始浓度为60～120mg/L，粗酶液添加量以亮菌漆酶酶活计为20～70U/L。

本发明的有益效果主要体现在：氯酚类化合物是环境污染中危害最严重的有机物，采用本发明方法可有效地予以降解，反应快速，作用14h，对氯酚类化合物的降解率可达到50%～90%。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.菌种

亮菌（Armillariella tabescens）菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC No.5.0013，分离号AS3.2624），27℃培养于PDA斜面。

2.培养基

综合PDA固体培养基：葡萄糖20g，琼脂粉18g，土豆汁200g，MgSO₄·7H₂O1.5g，KH₂PO₄3g，VB₁0.05g，蒸馏水补足至1L；

液体种子培养基：葡萄糖20g，蛋白胨15g，KH₂PO₄5g，MgSO₄·7H₂O1g，(NH₄)₂SO₄5g，玉米粉20g，蒸馏水补足至1L，pH6.0；液体发酵培养基组成同液体种子培养基。

3.发酵培养

3.1菌种培养

在无菌条件下接种于斜面或平皿培养基，26℃避光培养7d。

3.2液体种子

无菌条件下用打孔器（直径0.5cm）量取2块平皿培养基的菌丝块，捣碎，接种至种子液中（250mL三角瓶装液100mL），置27℃摇床，120r/min，避光培养6d，得到种子液。

3.3液体发酵培养

将种子液按6%体积比，接入液体发酵培养基中，置24℃～29℃摇床，100～160r/min，避光培养8d，得到发酵液。

4.亮菌漆酶的分离提取

液体发酵后对发酵液直接进行细胞破碎和过滤，取上清液即为粗酶液。

5.亮菌漆酶的酶活力测定

4mL反应体系中含：0.5mmol/L的ABTS(2'-连氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)作为反应底物，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.0），1mL前述所得粗酶液。35℃反应5min，于波长420nm处测吸光度，取吸光度变化的线性部分。

定义：每分钟催化1μmolABTS氧化所需的酶量为一个酶活力单位，单位以U/g或u/mL表示。

酶活力=△OD×稀释倍数×4mL×10⁶／（1mL×△t×ε×1cm）

ε为消光系数，ε=3.6×10⁴L/cm·mol

按照上述方法，测得粗酶液中亮菌漆酶活力约为0.25U/mL。

6.漆酶催化降解氯酚类化合物（2，4-二氯苯酚、2-氯苯酚、4-氯苯酚）试验

6.1漆酶催化降解2，4-二氯苯酚（2，4-DCP）试验

取7mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH6.0），加入1mL2，4-DCP水溶液（1g/L）和2mL前述所得漆酶粗酶液（即反应体系中2，4-DCP浓度为100mg/L，酶用量为50U/L）。在恒温下反应14h后加入1.25mL浓度为0.5mol/L的NH₃·H₂O，用磷酸缓冲液（pH6.7）调至7.9±0.02，依次加入0.5mL2%的4-氨基安替比林水溶液和0.5mL8%的铁氰化钾水溶液，搅拌约30s后静置15min，用紫外-可见分光光度计度计测定体系中氯酚的浓度。

氯酚降解率（%）=（初始浓度-降解后浓度）/初始浓度×100%

按照上述方法，测得2，4-DCP降解率为78.5%。

6.2漆酶催化降解2-氯苯酚、4-氯苯酚试验

步骤与方法同6.1。

按照上述方法，测得2-CP降解率为87.6%，4-CP降解率为79.7%。

Claims (3)

1.一种生物降解氯酚类化合物的方法，所述方法包括：以亮菌（Armillariella tabescens）经发酵获得的亮菌漆酶为生物催化剂，在50～60℃、pH3.6～4.5下对废水中的氯酚类化合物进行降解，所述氯酚类化合物为下列之一或其中两种以上的混合物：2，4-二氯苯酚、2-氯苯酚、4-氯苯酚。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述生物催化剂为亮菌经发酵获得的发酵液经细胞破碎、分离所得粗酶液，由如下方法获得：将亮菌接种至发酵培养基，24℃～29℃、100～160r/min避光培养5～10天，发酵液经细胞破碎后过滤，取上清液即为所述粗酶液；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～30g/L，蛋白胨10～20g/L，KH₂PO₄1～10g/L，MgSO₄·7H₂O0.5～2.0g/L，(NH₄)₂SO₄1～5g/L，玉米粉10～30g/L，溶剂为水，pH5.5～6.5。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于废水中的氯酚类化合物初始浓度为60～120mg/L，粗酶液添加量以亮菌漆酶酶活计为20～70U/L。