CN108949851B - 一种通过鲁氏接合酵母发酵产葡萄糖醛酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过鲁氏接合酵母发酵产葡萄糖醛酸的方法，属于发酵技术领域。鲁氏接合酵母能够以葡萄糖或蔗糖为底物生产葡萄糖醛酸，为微生物法生产葡萄糖醛酸奠定了基础。优化其发酵培养基和培养条件，可使发酵产葡萄糖醛酸产量达到14.68g/L，较目前国内外微生物发酵法产量(国内2.03g/L，国外3.94g/L)高出3倍以上。较化学生产法具有反应条件温和、产品工艺简单、生产过程易于控制、可用于食品和药物生产、环保等优点。

Description

一种通过鲁氏接合酵母发酵产葡萄糖醛酸的方法
技术领域
本发明涉及一种通过鲁氏接合酵母发酵产葡萄糖醛酸的方法，属于发酵技术领域。
背景技术
葡萄糖醛酸(Glucuronic acid)是一种糖醛酸化合物，因其分子中同时存在高反应活性的醛基和羧基，可作为受体与多种人体内源性及外源性有毒物质结合，提高毒性物质的水溶性使其易于随尿与胆汁排出体外，发挥排毒功能，提高机体免疫功能。
葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域也有着广泛的应用，可作为中间物质合成具有防癌抗癌作用的D-葡糖二酸钙、D-葡萄糖二酸1，4-内酯和L-抗坏血酸等，也可作为食品添加剂加入到功能性饮料中。其优势作用正在不断被发掘，有巨大的潜在经济效益。
目前葡萄糖醛酸主要以淀粉为原料在酸性条件下通过硝酸氧化来实现生产。该工艺存在能耗高、选择性差、产品收率低、环境污染严重等问题。以葡萄糖为底物用发酵法生产葡萄糖醛酸成本较低，对环境污染也较小，并且发酵生产葡萄糖醛酸可以大大减轻原料来源的限制。由于缺少能够产游离葡萄糖醛酸的独立菌株，目前，利用微生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法还未得到广泛应用，且产量最高也只有3.94g/L。
因此，通过微生物发酵的方法生产葡萄糖醛酸，并对培养条件进行优化以获得更高产量的葡萄糖醛酸，对工业微生物发酵生产葡萄糖醛酸具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸的方法，包含以下步骤：(1)活化鲁氏接合酵母菌；(2)将活化后的菌体转接于发酵培养基中；(3)发酵。
所述鲁氏接合酵母，能以蔗糖为底物，发酵生产葡萄糖醛酸。用YPD固体平板培养鲁氏接合酵母时，菌落呈圆形，表面干燥光滑，呈乳白色，菌落大小0.1-0.5cm。
所述方法是将鲁氏接合酵母活化后，接种于培养基中，25-30℃，200-220r/min摇床培养10-12h。
本发明的另一个目的是提供鲁氏接合酵母发酵产葡萄糖醛酸的培养基配方和培养条件。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含葡萄糖20-30g/L，蛋白胨10-15g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，pH 4.5-6.0，种龄8-10h，接种量1％-10％。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有蔗糖70-90g/L，大豆蛋白胨30-40g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，初始pH 4.8-5.5，种龄8-9h，接种量1-5％，发酵时间15-20h，优选蔗糖85g/L，大豆蛋白胨32g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，初始pH 4.8，种龄8.5h，接种量4％，发酵时间18h。
本发明提供的菌株能将较廉价的底物蔗糖转化成具有高附加值的葡萄糖醛酸，提供的培养基和培养条件最终发酵产葡萄糖醛酸产量能达到14.68g/L，较目前国内外微生物发酵法产量(国内2.03g/L，国外3.94g/L)高出3倍以上，较化学生产法具有反应条件温和、产品工艺简单、生产过程易于控制、可用于制备食品药品或保健品等优点，同时有利于保护环境，易于推广使用。
附图说明
图1鲁氏接合酵母在初始培养基中发酵过程曲线；
图2碳源种类(A)、氮源种类(B)、蔗糖含量(C)、大豆蛋白胨含量(D)、初始pH(E)、种龄(F)、接种量(G)对产量的影响；
图3鲁氏接合酵母在培养基2中发酵过程曲线；
图4葡萄糖醛酸离子色谱图，A：葡萄糖醛酸标准样品，出峰时间26.147min；B：鲁氏接合酵母发酵上清液中葡萄糖醛酸离子色谱图，出峰时间26.343min。
具体实施方式
1.葡萄糖醛酸检测方法
用离子色谱法(IC)检测发酵液中产葡萄糖醛酸的生成量。
标准样品：准确配置葡萄糖醛酸标准品1.000g/L，用超纯水稀释10倍，配置成终浓度为0.1000g/L的葡萄糖醛酸标准溶液。
将发酵液在10000g离心5min后，取上清液，用超纯水稀释100倍，0.22μm孔径的微孔滤膜过滤。
色谱方法：分离柱IonPacAS11-HC(4×250mm)，保护柱IonPacAG11-HC(4×50mm)；淋洗液发生器(EG产生)：0-15min，0.8mmol/L；15-27min，0.8-12mmol/L；27.1-31min，45mmol/L；31.1-35min，0.8mmol/L；流速：1.00mL/min；柱箱温度：30℃；进样体积：25μL；
检测方式：抑制型电导，AERS 500 4mm。
2.培养基配方
YPD培养基：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L。添加琼脂20g/L得到YPD固体培养基。
培养基1：葡萄糖20-30g/L，蛋白胨10-15g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，pH 4.5-6.0，种龄8-10h，接种量1％-10％。
培养基2：蔗糖70-90g/L，大豆蛋白胨30-40g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，初始pH4.8-5.5，种龄8-9h，接种量1-5％，发酵时间15-20h。
实施例1鲁氏接合酵母在葡萄糖醛酸生产中的应用方法
取保藏于-80℃的鲁氏接合酵母菌体甘油管，在YPD培养基中活化后，转接于发酵培养基1中，30℃，220r/min摇床培养10h发酵，检测发酵过程曲线，结果见图1。鲁氏接合酵母在YPD培养基中活化后葡萄糖醛酸的初始产量为1.13g/L，菌体在对数期结束时(10h)发酵液中葡萄糖醛酸产量最高，达到3.87g/L。
实施例2优化鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸的发酵培养基和培养条件
取保藏于-80℃的菌体甘油管，在YPD培养基中活化后，转接于不同配方的发酵培养基，于30℃，220rpm发酵10h。检测发酵液中葡萄糖醛酸含量。
(1)关于碳源种类对葡萄糖醛酸产量的影响
分别以蔗糖，麦芽糖，山梨醇，乳糖，果糖，甘露醇以等碳摩尔数代替初始培养基中的葡萄糖。所用发酵培养基的配方是碳源含量为20g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾1g/L，培养基pH为6.0，种龄为8h，接种量为1％，于30℃，220rpm发酵10h，检测发酵液中葡萄糖醛酸的含量。
(2)关于氮源种类对葡萄糖醛酸产量的影响
分别以牛肉膏，酵母粉，大豆蛋白胨，尿素，硫酸铵，柠檬酸铵以等氮摩尔数代替初始培养基中的蛋白胨。其中蛋白胨，酵母粉中氮含量以12.5％计，大豆蛋白胨，牛肉膏中氮含量以8％计，无机碳源根据其分子式计算。所用发酵培养基的配方是氮源含量为10g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L，培养基pH为6.0，种龄为8h，接种量为1％，发酵10h，检测发酵液中葡萄糖醛酸的含量。
(3)关于碳源用量对葡萄糖醛酸产量的影响
碳源含量优化在确定最优碳源为蔗糖后，考察蔗糖浓度对葡萄糖醛酸产量影响。蔗糖浓度分别为20，40，60，80，100，120g/L，大豆蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾1g/L，培养基pH为6.0，种龄为8h，接种量为1％，于30℃，220rpm发酵10h，检测发酵液中葡萄糖醛酸的含量。
(4)关于氮源含量对葡萄糖醛酸产量的影响
氮源含量优化在确定最优氮源为大豆蛋白胨后，考察蛋白胨浓度对葡萄糖醛酸产量影响。大豆蛋白胨浓度分别为10，15，20，25，30，35，40g/L，蔗糖80g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，培养基pH为6.0，种龄为8h，接种量为1％，于30℃，220rpm发酵10h，检测发酵液中葡萄糖醛酸的含量。
(5)关于培养基初始pH对葡萄糖醛酸产量的影响
培养基初始pH优化，用稀盐酸调节培养基pH为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，蔗糖80g/L，大豆蛋白胨30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，种龄为8h，接种量为1％，于30℃，220rpm发酵10h，检测发酵液中葡萄糖醛酸的含量。
(6)关于发酵种龄对葡萄糖醛酸产量的影响
种龄优化，发酵种龄分别为6，7，8，9，10h，蔗糖80g/L，大豆蛋白胨30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，培养基为pH为6.0，接种量为1％，于30℃，220rpm发酵10h，检测发酵液中葡萄糖醛酸的含量。
(7)关于接种量对葡萄糖醛酸产量的影响
接种量优化，接种量分别为1％，3％，5％，7％，10％，蔗糖80g/L，大豆蛋白胨30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，初始pH 5.0，种龄9h，于30℃，220rpm发酵10h，检测发酵液中葡萄糖醛酸的含量。
结果如图2所示，最终确定优化培养基2含有蔗糖70-90g/L，大豆蛋白胨30-40g/L，磷酸二氢钾1-1.5g/L，初始pH 5.0，种龄6-8h，接种量1-5％，发酵时间10-15h。
优选蔗糖85g/L，大豆蛋白胨32g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，初始pH 4.8，优化培养条件为种龄8.5h，接种量4％。
确定所有优化结果后，检测鲁氏接合酵母在培养基2中的发酵过程曲线，结果见图3。菌体在优选的培养基和培养条件下中发酵18h左右，产量(14.68g/L)比初始产量(1.13g/L)提高了13倍。
实施例3用离子色谱法检测发酵液中所产葡萄糖醛酸的生成量
取优选的培养基和培养条件下发酵20h后的菌液，10000g离心5min，取上清，用超纯水稀释100倍，0.22μm孔径的微孔滤膜过滤。用离子色谱法检测葡萄糖醛酸的生成量。结果见图4。经计算，葡萄糖醛酸的生成量为14.68g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种通过鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）发酵产葡萄糖醛酸的方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）活化鲁氏接合酵母菌；（2）将活化后的菌体转接于发酵培养基中；（3）发酵；以蔗糖为底物，利用鲁氏接合酵母发酵生产葡萄糖醛酸；发酵培养基的初始pH为4.8，发酵培养基中含有蔗糖85 g/L，大豆蛋白胨32 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L；将种龄8.5h的鲁氏接合酵母以4%的量加入发酵培养基中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中活化所用的培养基是YPD培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中发酵的条件为25-30 ℃，200-220 r/min摇床培养10-12 h。
4.权利要求1-3所述的方法在制备葡萄糖醛酸中的应用。
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