CN101928734A - 一种制备α-酮基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，包括(1)含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液的制备，(2)完整细胞转化α-羟基丁酸生成α-酮基丁酸，(3)转化液预处理，(4)转化液的脱色与浓缩，(5)α-酮基丁酸钠的结晶等步骤。本发明具有培养基简单、生长周期短，成本低，后续分离提取费用低廉，可耐底物浓度高，产物α-酮基丁酸钠纯度高等特点，为α-酮基丁酸钠的高效生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备α-酮基丁酸的方法，具体地说，涉及一种利用微生物完整细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸的方法。
背景技术
α-酮基丁酸(α-ketobutyric acid)，又称2-羰基丁酸(2-Oxobutyric acid)、2-氧代丁酸(2-Oxobutanoic acid)、2-酮基丁酸(2-Ketobutyric acid)。α-酮基丁酸是多种有用化合物的前体，在医药、食品合成工业具有广泛的应用，如合成异亮氨酸、保洛霉素及呋喃酮等《Production of 2-ketobutyric acid from 1，2-butanediol by resting cells of Rhodococcusequi IFO 3730.Biotechnol.Lett.1994，16：263-268.》。
α-酮基丁酸的生产方法包括化学合成法和生物技术法。化学合成α-酮基丁酸可以由草酸二乙酯和丙酸乙酯混合水解进行。生物技术法包括发酵法和酶法。
Furuyoshi Setsuo等人报道利用恶臭假单胞菌催化巴豆酸生产α-酮基丁酸的方法《Microbial production of 2-oxobutyric acid from crotonic acid.Agric.Biol.Chem.1991，55：123-128.》。首先在N-甲基氧化吗啉存在的条件下，锇催化巴豆酸生成2，3-二羟基丁酸，此步产率约为53％。然后恶臭假单胞菌催化2，3-二羟丁酸生成α-酮基丁酸，在最适反应条件下，该步摩尔转化率为47％，α-酮基丁酸产量为4.8克/升。该方法需经两步催化过程，由巴豆酸到α-酮基丁酸的总体产率仅为25％，造成了底物的浪费。
美国专利(US Patent 7144715)报道应用一株粗糙脉胞菌的ilv-3突变体，以苏氨酸为底物发酵生产α-酮基丁酸，通过优化培养基配比，α-酮基丁酸产量可以达到8克/升，产率为90％《Production ofα-ketobutyrate.U.S.patent 7144715.》。
美国专利(US Patent 7015020)报道了一种利用丙酮酸脱羧酶催化的加成反应，以CO2和丙醛为底物生产α-酮基丁酸的方法。浓度为0.1毫摩尔/升的底物丙醛经反相液谱分离后，α-酮基丁酸产率为52％《Preparation of2-keto carboxylic acid from carbon dioxide.U.S.patent 7015020.》。
Nakahara Tadaatsu等人报道在以硫胺素为限制因素的培养基上，筛选得到的马红球菌IF0 3730可以以1，2-丁二醇为碳源生产α-酮基丁酸《Production of2-ketobutyric acid from1，2-butanediol by resting cells of Rhodococcus equi IFO 3730.Biotechnol.Lett.1994，16：263-268.》。经过32小时培养，马红球菌IF0 3730可将20克/升的1，2-丁二醇转变成15.7克/升的α-酮基丁酸，底物摩尔转化率约为68％。
以上报道虽已实现α-酮基丁酸的生物法合成，但其产量较低，难以产业化。α-羟基丁酸仅经一步氧化反应即可生成α-酮基丁酸，是生物法生产α-酮基丁酸的极佳底物。经检索利用含α-羟酸氧化酶的微生物细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸的方法未见报道。
发明内容
针对上述α-酮基丁酸制备方法的不足，本发明提供了一种生物法制备α-酮基丁酸的方法。该方法具有底物转化率高、产物浓度高、后提取简便等特点。
本发明的利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，其步骤顺序如下：
(1)含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液的制备：选取含α-羟酸氧化酶的假单胞菌或不动杆菌，常规培养，期间以2，4-二硝基苯肼(DNP)与α-酮基丁酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞α-羟酸氧化酶活力，至α-羟酸氧化酶活力达到120～200单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.2～7.5磷酸钾缓冲液洗涤菌体2～4次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；
其中：在上述步骤中，α-羟酸氧化酶活单位U定义为：37℃，每分钟催化底物α-羟基丁酸钠转化生成1微摩尔α-酮基丁酸钠所需的酶量；
(2)转化：将步骤(1)中制得的完整细胞悬液与α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为100～800毫摩尔/升、完整细胞浓度为5～120克湿细胞/升；在5～37℃，pH 6.0～10.0条件下，以50～180转/分钟振荡5～30小时，使底物α-羟基丁酸钠、完整细胞与氧气充分混合，得含α-酮基丁酸钠的转化液；
(3)转化液预处理：以步骤(2)转化液体积量计，加入其0.1～0.5％体积量的1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝0.5～2小时，以5,000～10,000转/分离心5～25分钟，或者用200～400目滤布过滤，去除步骤(2)中加入的完整细胞，所得清液中即含α-酮基丁酸钠；
(4)样品检测：按常规方法制作α-羟基丁酸钠和α-酮基丁酸钠在高效液相色谱条件下标准曲线；取1～5微升步骤(3)获得的含α-酮基丁酸钠清液进样，测定产物α-酮基丁酸钠的含量，计算底物转化率；
(5)转化液的脱色：按常规方法将122(II型)弱酸性阳离子交换树脂或732强酸性阳离子树脂处理为H型，取步骤(3)获得的含α-酮基丁酸钠清液以每小时0.5～3.0倍柱体积流速过柱，至流出液pH为1～2开始收集，流出液pH为3～4时停止进样，收集流出液，静置0.5～2小时，以5,000～10,000转/分离心5～20分钟，收集上清液；
(6)浓缩：取步骤(5)收集的上清液以1摩尔/升的NaOH调pH至中性，以0.06～0.1兆帕，40～80℃条件减压浓缩，待α-酮基丁酸钠的浓度为1～2.5摩尔/升时停止浓缩，得α-酮基丁酸钠的浓缩液；
(7)α-酮基丁酸钠的结晶：取步骤(6)获得的浓缩液，加入其2～10倍体积量的无水乙醇，4～15℃下静置、结晶1～6小时，收集结晶，用其2～5倍体积的无水乙醇洗涤，然后在50±5℃温度下烘干，对所得α-酮基丁酸钠称重，计算分离过程收率；
(8)α-酮基丁酸钠检测：步骤(7)所得的α-酮基丁酸钠产品，用HPLC检测纯度；其中，HPLC采用Agilent1100系统，层析柱为AminexHPX-87H(美国)，流动相为10毫摩尔/升硫酸，柱温为55℃。
上述步骤(1)所述的假单胞菌或不动杆菌优选恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440ATCC 47054、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 15442、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501CGMCC NO：0351或不动杆菌(Acinetobacter sp.)WLISCCTCC NO：M205102。
上述步骤(2)所述α-羟基丁酸钠的浓度优选200～500毫摩尔/升、完整细胞浓度优选20～80克湿细胞/升。
上述步骤(2)所述温度优选20～37℃；所述pH范围优选6.0～9.0。
上述步骤(3)所述1％的壳聚糖溶液加入量优选转化液体积的0.2～0.5％。
上述步骤(5)所述含α-酮基丁酸钠清液优选以每小时1～2.5倍柱体积流速过柱，至流出液pH为1.5开始收集，流出液pH为4时停止进样。
上述步骤(6)所述减压浓缩条件优选是：压力为0.08～0.1兆帕，温度为50～80℃。
上述步骤(7)所述结晶温度优选为4～10℃。
本发明选用了具有α-羟酸氧化酶活性，能够催化α-羟基丁酸生成α-酮基丁酸的假单胞菌(Pseudomonas sp.)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)或其他类似功能的微生物制备成具有α-羟酸氧化酶活性的完整细胞催化剂，并成功使α-羟基丁酸钠与氧气反应制备出α-酮基丁酸钠。本发明方法具有以下特点：
(1)菌体培养及反应周期均较短。
(2)底物α-羟基丁酸钠生成α-酮基丁酸钠的转化率高，可达90％以上。
(3)产物α-酮基丁酸钠可积累到较高浓度。
(4)所用菌株不需破碎，可直接用完整细胞进行转化，操作方便。
(5)利用完整细胞催化，无需添加价格昂贵的辅因子。
(6)生物催化剂可以通过过滤或离心去除，后续分离提取简易。
附图说明
图1α-酮基丁酸钠产品的HPLC检测结果。
图2α-酮基丁酸钠产品的质谱检测结果。
图3α-酮基丁酸钠产品的红外光谱检测结果。
其中：a：α-酮基丁酸钠标准品，b：制备α-酮基丁酸钠产品。
具体实施方式
实施例1：
(1)含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液制备：选取恶臭假单胞菌KT2440(ATCC 47054)，常规培养，期间以2，4-二硝基苯肼(DNP)与α-酮基丁酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞α-羟酸氧化酶活力，至α-羟酸氧化酶活力达到150单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.2磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)转化：将步骤(1)中制得的完整细胞悬液与α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为400毫摩尔/升、完整细胞浓度为80克湿细胞/升；在30℃，pH6.0条件下，以180转/分钟振荡20小时，使底物α-羟基丁酸钠、完整细胞与氧气充分混合，得到含α-酮基丁酸钠的转化液；
(3)转化液预处理：取400毫升转化液加入2毫升1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝1小时，以5,000转/分离心20分钟，去除步骤(2)中加入的完整细胞，得到含α-酮基丁酸钠清液；
(4)样品检测：按常规方法制作α-羟基丁酸钠和α-酮基丁酸钠在高效液相色谱条件下的标准曲线。取5微升步骤(3)中获得的含α-酮基丁酸钠清液进样，测定产物α-酮基丁酸钠的含量，计算底物α-羟基丁酸钠转化率为91.4％。
(5)转化液的脱色：按常规方法将122(II型)弱酸性阳离子交换树脂处理为H型，取步骤(3)中含α-酮基丁酸钠清液以每小时2.5倍柱体积流速过柱，至流出液pH为2开始收集，流出液pH为3时停止进样，去离子水淋洗至pH6左右，收集流出液，静置1小时，以10,000转/分离心5分钟，收集上清液。
(6)浓缩：取步骤(5)收集的上清液以1摩尔/升的NaOH调pH至中性。以0.1兆帕，80℃条件减压浓缩，待α-酮基丁酸钠的浓度为2.0摩尔/升时停止浓缩，得α-酮基丁酸钠浓缩液。
(7)α-酮基丁酸钠的结晶：取步骤(6)获得的浓缩液，加入其5倍体积量的无水乙醇，在4℃静置结晶3小时，收集结晶，用其3倍体积的无水乙醇洗涤，然后在50℃烘箱烘干，对所得α-酮基丁酸钠称重，计算分离过程收率为76.1％。
(8)α-酮基丁酸钠检测：将步骤(7)所得的α-酮基丁酸钠产品，用HPLC检测纯度为99.6％。该样品的HPLC图谱见图1，保留时间18.573的峰即为α-酮基丁酸的色谱峰。
实施例2：
(1)含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液制备：选取铜绿假单胞菌(ATCC15442)，常规培养，期间以2，4-二硝基苯肼(DNP)与α-酮基丁酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞α-羟酸氧化酶活力，至α-羟酸氧化酶活力达到160单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.2磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)转化：将步骤(1)中制得的完整细胞悬液与α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为200毫摩尔/升、完整细胞浓度为20克湿细胞/升；在30℃，pH 7.0条件下，以180转/分钟振荡30小时，使底物α-羟基丁酸钠、完整细胞与氧气充分混合，得到含α-酮基丁酸钠的转化液；
(3)转化液预处理：取400毫升转化液加入0.8毫升1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝1小时，以5,000转/分离心20分钟，去除步骤(2)中加入的完整细胞，得到含α-酮基丁酸钠清液；
(4)样品检测：按常规方法制作α-羟基丁酸钠和α-酮基丁酸钠在高效液相色谱条件下的标准曲线。取5微升步骤(3)中获得的含α-酮基丁酸钠清液进样，测定产物α-酮基丁酸钠的含量，计算底物α-羟基丁酸钠转化率为89.6％。
(5)转化液的脱色：按常规方法将732强酸性阳离子树脂处理为H型，取步骤(3)获得的含α-酮基丁酸钠的清液以每小时1.5倍柱体积流速过柱，至流出液pH为2开始收集，流出液pH为3时停止进样，去离子水淋洗至pH7左右，收集流出液，静置1小时，以10,000转/分离心5分钟，收集上清液。。
(6)浓缩：取步骤(5)收集的上清液以1摩尔/升的NaOH调pH至中性。以0.1兆帕，70℃条件减压浓缩，待α-酮基丁酸钠的浓度为1.5摩尔/升时停止浓缩，得到α-酮基丁酸钠浓缩液。
(7)α-酮基丁酸钠的结晶：取步骤(6)获得的浓缩液，加入其8倍体积量的无水乙醇，在10℃静置结晶3小时，收集结晶，用其3倍体积的无水乙醇洗涤，然后在50℃烘箱烘干，对所得α-酮基丁酸钠称重，计算分离过程收率87.2％。
(8)α-酮基丁酸钠检测：将步骤(7)所得的α-酮基丁酸钠产品，用HPLC检测纯度为96.3％。
实施例3：
(1)含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液制备：选取施氏假单胞菌A1501(CGMCC0351)，常规培养，期间以2，4-二硝基苯肼(DNP)与α-酮基丁酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞α-羟酸氧化酶活力，至α-羟酸氧化酶活力达到160单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.2磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)转化：将步骤(1)中制得的完整细胞悬液与α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为500毫摩尔/升、完整细胞浓度为60克湿细胞/升；在37℃，pH 8.0条件下，以180转/分钟振荡30小时，使底物α-羟基丁酸钠、完整细胞与氧气充分混合，得到含α-酮基丁酸钠的转化液；
(3)转化液预处理：取400毫升转化液加入1.5毫升1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝1小时，以5,000转/分离心20分钟，去除步骤(2)中加入的完整细胞，得到含α-酮基丁酸钠清液；
(4)样品检测：按常规方法制作α-羟基丁酸钠和α-酮基丁酸钠在高效液相色谱条件下的标准曲线。取5微升步骤(3)中获得的含α-酮基丁酸钠清液进样，测定产物α-酮基丁酸钠的含量，计算底物α-羟基丁酸钠转化率为90.6％。
(5)转化液的脱色：按常规方法将122(II型)弱酸性阳离子交换树脂处理为H型，取步骤(3)获得的含α-酮基丁酸钠清液以每小时2.0倍柱体积流速过柱，至流出液pH为2开始收集，流出液pH为3时停止进样，去离子水淋洗至pH约为5左右，收集流出液，静置1小时，以10,000转/分离心5分钟，收集上清液。
(6)浓缩：取步骤(5)收集的上清液以1摩尔/升的NaOH调pH至中性。以0.08兆帕，65℃条件减压浓缩，待α-酮基丁酸钠的浓度为2.5摩尔/升时停止浓缩，得到α-酮基丁酸钠的浓缩液。
(7)α-酮基丁酸钠的结晶：取步骤(6)获得的浓缩液，加入其5倍体积量的无水乙醇，在8℃静置结晶3小时，收集结晶，用3倍体积量的无水乙醇洗涤，然后在50℃烘箱烘干，对所得α-酮基丁酸钠称重，计算分离过程收率85.1％。
(8)α-酮基丁酸钠检测：将步骤(7)所得的α-酮基丁酸钠产品，用HPLC检测纯度为98.4％。
实施例4：
(1)含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液制备：选取不动杆菌WLIS(CCTCC NO：M205102)，常规培养，期间以2，4-二硝基苯肼(DNP)与α-酮基丁酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞α-羟酸氧化酶活力，至α-羟酸氧化酶活力达到160单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.2磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)转化：将步骤(1)制得的完整细胞悬液与α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为400毫摩尔/升、完整细胞浓度为60克湿细胞/升；在20℃，pH 9.0条件下，以180转/分钟振荡40小时，使底物α-羟基丁酸钠、完整细胞与氧气充分混合，得到含α-酮基丁酸钠的转化液；
(3)转化液预处理：取400毫升转化液加入2毫升1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝1小时，以5,000转/分离心20分钟，去除步骤(2)中加入的完整细胞，得到含α-酮基丁酸钠清液；
(4)样品检测：按常规方法制作α-羟基丁酸钠和α-酮基丁酸钠在高效液相色谱条件下的标准曲线。取5微升步骤(3)中获得的含α-酮基丁酸钠清液进样，测定产物α-酮基丁酸钠的含量，计算底物α-羟基丁酸钠转化率为93.5％。
(5)转化液的脱色：按常规方法将732强酸性阳离子树脂处理为H型，取步骤(3)获得的含α-酮基丁酸钠清液以每小时1倍柱体积流速过柱，至流出液pH为2开始收集，流出液pH为3时停止进样，去离子水淋洗至pH约5左右，收集流出液静置1小时，以10,000转/分离心5分钟，收集上清液。
(6)浓缩：取步骤(5)收集的上清液以1摩尔/升的NaOH调pH至中性。以0.06兆帕，60℃条件减压浓缩，待α-酮基丁酸钠的浓度为2.0摩尔/升时停止浓缩，得到α-酮基丁酸钠浓缩液。
(7)α-酮基丁酸钠的结晶：取步骤(6)获得的浓缩液，直接倾倒加入其7倍体积量的无水乙醇，在10℃静置结晶3小时，收集结晶，用2倍体积的无水乙醇洗涤，然后在50℃烘箱烘干，对所得α-酮基丁酸钠称重，计算分离过程收率80.8％。
(8)α-酮基丁酸钠检测：将步骤(7)所得的α-酮基丁酸钠产品，用HPLC检测纯度为97.8％。
本发明实施例中所用菌株均为菌种目录中登载的市售菌株，公众均可获得。
Claims (8)
1.一种利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，其步骤顺序如下：
(1)含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液的制备：选取含α-羟酸氧化酶的假单胞菌或不动杆菌，常规培养，期间以2，4-二硝基苯肼与α-酮基丁酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞α-羟酸氧化酶活力，至α-羟酸氧化酶活力达到120～200单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.2～7.5磷酸钾缓冲液洗涤菌体2～4次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；
其中：在上述步骤中，α-羟酸氧化酶活单位U定义为：37℃，每分钟催化底物α-羟基丁酸钠转化生成1微摩尔α-酮基丁酸钠所需的酶量；
(2)转化：将步骤(1)中制得的完整细胞悬液与α-羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α-羟基丁酸钠的浓度为100～800毫摩尔/升、完整细胞浓度为5～120克湿细胞/升；在5～37℃，pH 6.0～10.0条件下，以50～180转/分钟振荡5～30小时，使底物α-羟基丁酸钠、完整细胞与氧气充分混合，得含α-酮基丁酸钠的转化液；
(3)转化液预处理：以步骤(2)转化液体积量计，加入其0.1～0.5％体积量的1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝0.5～2小时，以5,000～10,000转/分离心5～25分钟，或者用200～400目滤布过滤，去除步骤(2)中加入的完整细胞，所得清液中即含α-酮基丁酸钠；
(4)样品检测：按常规方法制作α-羟基丁酸钠和α-酮基丁酸钠在高效液相色谱条件下标准曲线；取1～5微升步骤(3)获得的含α-酮基丁酸钠清液进样，测定产物α-酮基丁酸钠的含量，计算底物转化率；
(5)转化液的脱色：按常规方法将122弱酸性阳离子交换树脂或732强酸性阳离子树脂处理为H型，取步骤(3)获得的含α-酮基丁酸钠清液以每小时0.5～3.0倍柱体积流速过柱，至流出液pH为1～2开始收集，流出液pH为3～4时停止进样，收集流出液，静置0.5～2小时，以5,000～10,000转/分离心5～20分钟，收集上清液；
(6)浓缩：取步骤(5)收集的上清液以1摩尔/升的NaOH调pH至中性，以0.06～0.1兆帕，40～80℃条件减压浓缩，待α-酮基丁酸钠的浓度为1～2.5摩尔/升时停止浓缩，得α-酮基丁酸钠的浓缩液；
(7)α-酮基丁酸钠的结晶：取步骤(6)获得的浓缩液，加入其2～10倍体积量的无水乙醇，4～15℃下静置、结晶1～6小时，收集结晶，用其2～5倍体积的无水乙醇洗涤，然后在50±5℃温度下烘干，对所得α-酮基丁酸钠称重，计算分离过程收率；
(8)α-酮基丁酸钠检测：步骤(7)所得的α-酮基丁酸钠产品，用HPLC检测纯度；其中，HPLC采用Agilent1100系统，层析柱为AminexHPX-87H，流动相为10毫摩尔/升硫酸，柱温为55℃。
2.如权利要求1所述利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，其特征在于，步骤(1)所述假单胞菌或不动杆菌是恶臭假单胞菌KT2440ATCC47054、铜绿假单胞菌ATCC 15442、施氏假单胞菌A1501CGMCC NO：0351或不动杆菌WLIS CCTCC NO：M205102。
3.如权利要求1所述利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，其特征在于，步骤(2)所述α-羟基丁酸钠的浓度为200～500毫摩尔/升、完整细胞浓度为20～80克湿细胞/升。
4.如权利要求1所述利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，其特征在于，步骤(2)所述温度为20～37℃；所述pH范围为6.0～9.0。
5.如权利要求1所述利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，其特征在于，步骤(3)所述1％的壳聚糖溶液加入量为转化液体积的0.2～0.5％。
6.如权利要求1所述利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，其特征在于，步骤(5)所述含α-酮基丁酸钠清液以每小时1～2.5倍柱体积流速过柱，至流出液pH为1.5开始收集，流出液pH为4时停止进样。
7.如权利要求1所述利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，其特征在于，步骤(6)所述减压浓缩条件是：压力为0.08～0.1兆帕，温度为50～80℃。
8.如权利要求1所述利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，其特征在于，步骤(7)所述结晶温度为4～10℃。
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Cited By (6)
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|---|---|---|---|---|
| CN103103222A (zh) * | 2011-11-10 | 2013-05-15 | 山东大学 | 一种以1,2-丁二醇为底物生产R-α-羟基丁酸的方法 |
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| CN102433360A (zh) * | 2011-11-23 | 2012-05-02 | 山东大学 | 一种以L-苏氨酸为底物生产α-酮基丁酸的方法 |
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