CN102994575A

CN102994575A - 季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法

Info

Publication number: CN102994575A
Application number: CN2012105519580A
Authority: CN
Inventors: 张丽媛; 姚笛; 王颖; 李秀波; 胡亚光
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2012-12-18
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明涉及一种季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法。主要解决了现有木糖醇生产成本高、污染严重的问题。包括以下步骤：（1）制备酒糟水解液；（2）培养基配制；（3）木糖醇发酵：摇瓶发酵：将液体种子接种至发酵培养基中，摇瓶培养的最优工艺为：装液量为1/5；接种量5%，温度为28℃，转速为180r/min，发酵48h结束，制得含木糖醇的发酵液；用高效液相色谱仪测定，木糖醇发酵液中木糖醇的浓度为9.016g/L，色谱分离纯化后含量可达95%。该季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法，工艺条件温和、能耗低、环境污染低、产品质量更加安全可靠，提高了农副产品废弃物酒糟的使用效率。

Description

季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵法生产木糖醇的工艺，尤其是一种季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法。

背景技术

木糖醇（Xylitol）也叫戊五醇，是一种五碳糖醇。它的分子式为C₅H₁₂O₅，是木糖代谢的正常中间产物，外形为结晶性白色粉末，它可用作甜味剂、营养剂和药剂在化工、食品、医药等工业中广泛应用。同时木糖醇是一种无致龋性的甜味剂，已广泛应用于食品、医药等领域；在体内代谢不需胰岛素参与，因此适合作为糖尿病患者的甜味替代品。生产木糖醇的原料多来源于富含多缩戊糖的玉米芯、棉子壳、甘蔗渣、桦木片等农副产品，这些原料经过高温水解后成为含大量木糖的水解液。工业上一般采用加氢催化经过高度纯化的木糖溶液生产木糖醇。该方法产率低、成本高、污染较严重。

酒糟成分复杂，但主要是以稻壳等半纤维素物质为主，而稻壳中多缩戊糖的含量占16%~22%。近几年，我国酒糟的年产量约为1000万t，数量相当可观。以酒糟为原料，利用季也蒙毕赤酵母发酵生产木糖醇的研究还未见报道。

发明内容

本发明在于克服背景技术中存在的现有木糖醇生产工艺成本高、污染较严重的问题，而提供一种季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法。该季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法，选择以酒糟为原料，工艺条件温和、能耗低、环境污染低、产品质量更加安全可靠，大大降低了生产成本。

本发明解决其问题可通过如下技术方案来达到：一种季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法，包括以下步骤：

（1）制备酒糟水解液

将烘干后的酒糟粉碎至粒径40目，按1:5的比例（w/v）与0.1%的NaOH溶液混合，搅拌下加热煮沸l h，冷却后用滤布过滤，弃去滤液，用清水洗涤滤渣，再将滤渣与1000 mL水共煮l h，过滤，除去灰分后的滤渣留待下步水解；采用由1%HCl和1% H₃PO₄所组成的混合酸水解酒糟，水解温度100℃，固液比1:10（w/v），水解2 h；水解液85℃浓缩至木糖含量约40 g/L，再以1:10的比例（w/v）加入活性炭脱色；用石灰乳中和至pH 5.0，抽滤去除Ca₃(PO₄)₂沉淀后，所得水解液于4℃冷藏备用；

（2）培养基

YPD培养基：配制YPD斜面培养基，用于菌种的活化；

种子培养基：含木糖约20g/ L的原始酒糟水解液100mL，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，KH₂PO₄ 5g/L， pH5.5，110℃灭菌20 min；

发酵培养基：含木糖约40g/L 90mL的浓缩的酒糟水解液中，补加10 mL有机氮源溶液，有机氮源溶液为酵母膏10g/L及蛋白胨20g/L；起始pH5.0，110℃灭菌20 min；

（3）木糖醇发酵

斜面培养：将季也蒙毕赤酵母菌种接种于YPD试管斜面上；

液体种子培养：取斜面菌种1环，接入液体种子培养基中， 250mL三角瓶装种子培养基液量50 mL，于28℃，摇床200 r /min培养24 h；

摇瓶发酵：将液体种子接种至发酵培养基中，摇瓶内种子培养的最优工艺为：装液量为1/5；接种量5% ，温度为28 ℃，转速为180 r/min，发酵48 h结束，制得含木糖醇的发酵液；用高效液相色谱仪测定，得出保留时间和色谱峰面积，测得木糖醇的含量。

所述的采用高效液相色谱仪测定时色谱条件为：Thermo-NH₂柱；柱温：常温；流动相：乙腈：水=85：15；流速：1mL/min；示差折光检测器检测，进样量为20μL。

季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇机理为: 酒糟水解液作为木糖原料(基质)，在木糖还原酶的作用下还原成木糖醇，在此反应中的催化剂主要利用了辅酶NADPH，季也蒙毕赤酵母细胞内NADP主要通过戊糖磷酸的代谢路线转化成NADPH。另一方面，细胞内的NADH在好气条件下经过呼吸反应链的反应后再生成NAD⁺。木糖还原酶利用NADPH和NADH两者而存在，催化木糖反应生成木糖醇。

发酵过程中，起始pH对木糖醇转化影响较大的原因是：在较低pH（<4.0）的条件下，酒糟水解液中含有浓度较高的有机酸，这些物质会强烈抑制酵母生长及阻遏木糖还原酶的诱导合成力和比活力。在pH 5.0~6.0的微酸环境下，木糖还原酶与木糖脱氢酶的酶活力达到最大，木糖醇生成率大幅提高，而pH值过高不利于木糖醇的积累，并且容易染菌，不利于发酵。

接种量必须适中，接种量过小，季也蒙毕赤酵母发酵时间会延长，木糖醇的得率下降；接种量过大，则在发酵初期会消耗过多的底物，不利于木糖醇的积累。

转速的提高则是大大加大了菌液中各种有机物质及季也蒙毕赤酵母菌和空气的接触机会，从而最大程度的保证了木糖醇的最大生成量。

温度可以使还原酶和木糖脱氢酶等酶保持在最大的活力，从而促使季也蒙毕赤酵母能够最大程度的发酵酒糟水解液生产木糖醇，温度在整个实验过程中都是非常重要的，是不可忽略的重要因素。

在测定时，采用高效液相色谱法示差折光检测器检测无紫外吸收的糖类化合物，样品无需衍生处理，过滤后，便可以直接进样检测。采用Thermo-NH₂分析柱分离发酵液中的木糖醇，一次进样，10min左右即完成色谱分离过程，有分离效果好，分析速度快，操作简便的优点，最适合检测分离木糖醇的样品。

本发明与上述背景技术相比较可具有如下有益效果：该季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法，采用季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液，得到较高产量的木糖醇，对利用酒糟这种生物废弃物成为生产木糖醇的原料的可能性提供理论依据；工艺条件温和、能耗低、环境污染低、产品质量更加安全可靠大大降低了生产成本。采用季也蒙毕赤酵母进行发酵生产木糖醇具有菌体密度高，反应快，抗干扰能力强的优点，可缩短发酵周期，提高转化率，节省人力、物力以及产物分离方便，菌体可重复连续使用

附图说明：

附图1是本发明木糖醇标准品高效液相色谱图；

附图2是本发明最佳条件下发酵液的高效液相色谱图。

具体实施方式：

下面将结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

（1）制备酒糟水解液

将烘干后的酒糟粉碎至粒径40目，按1:5的比例（w/v）与0.1%的NaOH溶液混合，搅拌下加热煮沸l h，冷却后用滤布过滤，弃去滤液，用清水洗涤滤渣，再将滤渣与1000 mL水共煮l h，过滤，除去灰分后的滤渣留待下步水解；采用由1%HCl和1% H₃PO₄所组成的混合酸水解酒糟，水解温度100℃，固液比1:10（w/v），水解2 h；水解液85℃浓缩至木糖含量约40 g/L，再以1:10的比例（w/v）加入活性炭脱色，浓缩和脱色可提高水解液中的初始木糖浓度，同时也除去水解液中的有机酸、糠醛和色素等有害物质；用石灰乳中和至pH 5.0，抽滤去除Ca₃(PO₄)₂沉淀后，所得水解液于4℃冷藏备用；

（2）培养基

YPD培养基：配制YPD斜面培养基，用于菌种的活化；

种子培养基：含木糖20g/ L的原始酒糟水解液100mL，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，KH₂PO₄ 5g/L， pH5.5，110℃灭菌20 min；

发酵培养基：含木糖40g/L 90mL的浓缩的酒糟水解液中，补加10mL有机氮源溶液，有机氮源溶液为酵母膏10g/L及蛋白胨20g/L；起始pH5.0，110℃灭菌20 min；

（3）木糖醇发酵

斜面培养：将季也蒙毕赤酵母菌种接种于YPD试管斜面上；

液体种子培养：取斜面菌种1环，接入液体种子培养基中， 250mL三角瓶装种子培养基液量100 mL，于28℃，摇床200 r /min培养24 h，以使毕赤酵母适应酒糟水解液环境；

摇瓶发酵：将液体种子接种至发酵培养基中，摇瓶内种子培养的最优工艺为：装液量为1/5；接种量5% ，温度为28 ℃，转速为180 r/min，发酵48 h结束，制得含木糖醇的发酵液；

分别准确称取木糖醇标准品0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1 g加入100 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至100 ml，制成木糖醇标准溶液，浓度分别为0.5、2、4、6、8、10 g/L，同时设空白对照。上高效液相色谱仪测定，得出保留时间和色谱峰面积，计算木糖醇的含量。

取最佳条件下所获得的发酵液以及木糖醇标准品进行高效液相色谱分析，色谱条件：Thermo-NH₂柱；柱温：常温；流动相：乙腈：水=85：15；流速：1mL/min；示差折光检测器检测，进样量为20μL。

图1、图2分别是木糖醇标准品和最佳发酵条件下的发酵液的高效液相色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为色谱峰信号，图1中标记的a峰就是在高效液相色谱所检测到木糖醇标准品的色谱峰，保留时间在8 min左右。通过保留时间定性确定图2中标记的b峰为最佳发酵条件下发酵液中所含木糖醇色谱峰。根据标准曲线计算出最佳发酵条件下所含木糖醇含量。表1为最佳条件的测定结果。

表1最佳条件的测定结果

温度（℃）	pH	接种量（%）	转速（r/min）	色谱峰面积（μV·s）	木糖醇含量/g/L
						28	5	5	180	2148465	9.016

根据最佳色谱条件进行色谱测定之后，从8min开始收集洗脱液，一直到保留时间为8.680min的木糖醇全部流出色谱柱，即可得到木糖醇的乙腈水溶液，将多次收集的洗脱液合并，旋转蒸发浓缩，得到的即为木糖醇纯品，纯度可达95%。

实施例所采用的药品皆为市售，木糖醇标准品购自上海柯丰生物试剂有限公司；实验所用水为超纯水；PC-2025型高效液相色谱仪购自美国SSI有限公司；Thermo-NH2柱购自美国热电公司；0.22 μm水性、油性过滤膜购自天津兰博有限公司；季也蒙毕赤酵母菌购自吉林省泰祥科技有限公司。

Claims

1.一种季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）制备酒糟水解液

将烘干后的酒糟粉碎至粒径40目，按1:5的比例（w/v）与0.1%的NaOH溶液混合，搅拌下加热煮沸l h，冷却后用滤布过滤，弃去滤液，用清水洗涤滤渣，再将滤渣与1000 mL水共煮l h，过滤，除去灰分后的滤渣留待下步水解；采用由1%HCl和1% H₃PO₄所组成的混合酸水解酒糟，水解温度100℃，固液比1:10（w/v），水解2 h；水解液85℃浓缩至木糖含量40 g/L，再以1:10的比例（w/v）加入活性炭脱色；用石灰乳中和至pH 5.0，抽滤去除Ca₃(PO₄)₂沉淀后，所得水解液于4℃冷藏备用；

（2）培养基配制

YPD培养基：配制YPD斜面培养基，用于菌种的活化；

发酵培养基：含木糖40g/L 的90mL浓缩酒糟水解液中，补加10 mL有机氮源溶液，有机氮源溶液为酵母膏10g/L及蛋白胨20g/L；起始pH5.0，110℃灭菌20 min；

（3）木糖醇发酵

斜面培养：将季也蒙毕赤酵母菌种接种于YPD试管斜面上；

液体种子培养：取斜面菌种1环，接入液体种子培养基中， 250mL三角瓶装种子培养基液量50 mL，于28℃，摇床200 r /min培养24 h，以使毕赤酵母适应酒糟水解液环境；

摇瓶发酵：将液体种子接种至发酵培养基中，摇瓶培养的最优工艺为：装液量为1/5；接种量5% ，温度为28 ℃，转速为180 r/min，发酵48 h结束，制得含木糖醇的发酵液;

用高效液相色谱仪测定，得出保留时间和色谱峰面积，测得木糖醇的含量。

2.根据权利要求1所述的季也蒙毕赤酵母发酵酒糟水解液生产木糖醇的方法，其特征在于：所述的采用高效液相色谱仪测定时色谱条件为：Thermo-NH₂柱；柱温：常温；流动相：乙腈：水=85：15；流速：1mL/min；示差折光检测器检测，进样量为20μL。