CN102260715A

CN102260715A - 一种利用酒糟原料发酵生产丁二酸的方法

Info

Publication number: CN102260715A
Application number: CN2011102099997A
Authority: CN
Inventors: 郑璞; 孔德诚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2011-07-26
Filing date: 2011-07-26
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2031-07-26
Also published as: CN102260715B

Abstract

一种利用酒糟原料发酵生产丁二酸的方法，属生物工程技术领域。本发明方法为新鲜酒糟经脱水、粉碎预处理后，配制成发酵培养基，再经酶预水解，及酶与琥珀酸放线杆菌的边糖化边发酵，产丁二酸浓度达25-40g/L，丁二酸对酒糟产率可达到0.033-0.050g/g干酒糟。本发明突出的优点是利用工业废弃物酒糟为原料发酵生产丁二酸，用酒糟替代葡萄糖作为碳源，并且发酵培养基中不需外加氮源，既缓解了化学合成丁二酸的石化资源紧张问题，又防止酒糟污染环境，提升了酒糟的使用价值。

Description

一种利用酒糟原料发酵生产丁二酸的方法

技术领域

本发明涉及一种以工业废弃物酒糟为原料，通过微生物发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

丁二酸又称琥珀酸，分子式为C₄H₆0₄，分子量为118.09，是工业上一种重要的化合物。在食品行业中，丁二酸的主要用途是作为食品的调味剂、酸化剂、中和剂、pH改良剂、风味物质和抗菌剂。丁二酸已被美国FDA认定为GRAS (一般认为安全)；在医药行业中，它作为一种重要的医药合成中间体，是许多抗生素、氨基酸和维生素的生产原料；在化学工业中，丁二酸的主要用途是作为离子螯和剂用于电镀行业中防止金属的溶蚀和点蚀；它在纸张制造、纺织行业中也有一定范围的用途，是作润滑剂、照相化学品和表面活性剂的原料；丁二酸潜在的应用领域是作为大宗基本化学品的原料，例如：N-甲基吡咯烷酮、1,4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃、γ-丁内酯、乙二胺二琥珀酸、丁二酸二乙酯、己二酸等，它可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品，从而可减少由超过250种苯基化学制品的生产和消费过程中所产生的污染，它还是合成生物降解塑料，如聚丁二醇丁二酸酯的基本原料。目前，商品丁二酸的生产方法主要是马来酸酐催化加氢的化学方法，在原料上依赖于不可再生的化石原料，存在原料日益减少与易污染环境等的弊端。利用微生物发酵生产丁二酸，因具有环境友好和摆脱对石化原料依赖的优点，已成为国内外研究的热点（Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 76:727-740）。发酵法生产丁二酸的优势是以可再生的生物质作为发酵的初始原料。廉价的生物质原料如糖类、淀粉类、菊粉类、木质纤维素、乳清等都可用于丁二酸的发酵生产。

酒糟是酿酒过程中，发酵酒醪经压榨、分离去除酒液后留下的固形物。我国酒精及白酒生产厂家众多，酒糟的产量很大。就白酒糟而言，近年来我国白酒年产量维持在500万吨左右，产生的废弃酒糟每年就超过2100万吨。酒糟中含有大量水，部分淀粉、粗纤维、粗蛋白和维生素、氨基酸、有机酸、低碳糖、杂醇等有机成分。酒糟如不及时处理极易腐败变质，既浪费了宝贵资源又造成环境污染。当前酒糟的主要处理方式是直接用来做饲料，但是酒糟中蛋白质含量相对少，酒精、醛与杂醇油等对家畜的生长发育和繁殖有一定的毒性，作为饲料消化率低，口适性差，因此其用量有限。有效开发利用酒糟，不仅能减少和防止酒糟对环境的污染，而且还能带来巨大的经济效益。目前报道的开发利用酒糟的技术主要有：烘干去稻壳直接生产饲料；经微生物发酵后生产菌体蛋白饲料；进行固态发酵，生产酶类饲料添加剂；用于养殖蝇蛆和蚯蚓间接生产饲料；厌氧发酵生产沼气；用于培养食用菌等。也有从酒糟中提取复合氨基酸及微量元素、制取甘油（CN1183401A）、提取植酸与植酸钙、生产微生物农药（如CN 1481688A）等研究。酒糟中主要成分是淀粉10%左右，纤维素20%左右，蛋白质7~10%，具有作为发酵原料来进行发酵的潜质，但还未见对于利用酒糟为原料发酵生产丁二酸的报道。

本发明提供了一种以酒糟为原料微生物发酵生产丁二酸的方法。即先将酒糟进行脱水、粉碎等的预处理，以及进行淀粉酶、糖化酶与复合纤维素酶等的预水解；然后接入琥珀酸放线杆菌进行边糖化边发酵生产丁二酸。本发明在生产丁二酸的原料来源上，采用酿造业的废弃酒糟，具有不与人争粮、不与粮争地的特点。同时将酒糟转化为重要的C4平台化合物丁二酸，既提升了酒糟的使用价值，增加经济效益，又减少了环境污染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用工业废弃物酒糟发酵生产丁二酸的方法。

本发明的技术方案：一种利用工业废弃物酒糟发酵生产丁二酸的方法。包括：新鲜酒糟经脱水、粉碎预处理，酒糟发酵培养基的配制，再经α-淀粉酶预水解、及糖化酶和复合纤维素酶等的两级预水解，然后与琥珀酸放线杆菌厌氧发酵边糖化边发酵生成丁二酸，并从发酵液中提取丁二酸。

以下是本发明方法的详细描述：

新鲜酒糟预处理：将新鲜的酒糟放入105℃烘箱内，烘6~12 h，使其水份含量20%以下，酒精的含量在0.005 g酒精/g酒糟以下；并粉碎，得到40~80目的干酒糟颗粒。

配制酒糟发酵培养基：丁二酸发酵培养基组成质量浓度为：干酒糟400~1000 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2~3 g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 2~3 g/L，MgCl₂ ·6H₂O 与CaCl₂ 1~3 g/L，乙酸钠1~3 g/L，pH为6.0~7.0，120℃灭菌20分钟。

水解酶两级预水解：在灭菌后的发酵培养基中，加入α-淀粉酶，其添加量为20~50 U/g干酒糟，酶解温度80~100℃，作用时间0.5~1.0 h；待培养基温度降为50~60℃后，再调pH为4.0~5.0，并同时加入糖化酶和复合纤维素酶（由市售的纤维素酶、纤维二糖酶和木聚糖酶组成），其添加量之比为每克干酒糟加入10~40 U糖化酶：1~20 FPU纤维素酶：1~10 U纤维二糖酶：10~50 U木聚糖酶，在温度50~60℃继续水解0.5~5 h；

酒糟原料的同步糖化发酵：

菌株：琥珀酸放线杆菌CGMCC No.1593，为从牛的瘤胃中分离获得，保藏在中国北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国专利 ZL 200610038113.6已公开，或采用羟胺、亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯等化学诱变剂诱变的方法，或者采用重组DNA技术、或基因组改组技术等分子工程育种手段，选育的减少副产物乙酸产量、或耐低 pH、或耐温性能改进的、丁二酸产率提高的琥珀酸放线杆菌突变菌株。

琥珀酸放线杆菌的种子培养基的组成为：葡萄糖5~15 g/L，酵母膏1~10 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5~2 g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 0.2~20 g/L，混合维生素1~10mL/ L，pH 6.0~7.5。维生素等热敏性材料配制后用0.2 μm微孔滤膜过滤除菌，接种前加入。

混合维生素组成为：B₁₂ 5 mg，B₆ 100 mg，叶酸20 mg，核黄素20 mg，硫胺素20 mg，烟酸20 mg，泛酸50 mg，对氨基苯甲酸50 mg，1000 mL水。

按5%~15%接入量将琥珀酸放线杆菌CGMCC No.1593或其突变株种子，接入酒糟经两级预水解后的发酵培养基中，于30~45℃在充满CO₂的环境中，静止或震荡培养20~72 h；并用碳酸盐或碱溶液调节维持发酵液pH 6.0~7.5。

从发酵液中提取丁二酸：酒糟发酵结束后的发酵液，通过离心或板框压滤得到发酵清液，调节pH为1~3，加入以发酵清液计0.5%~3.0%(W/V)活性炭进行脱色，用732阳离子交换树脂脱盐，用萃取法提取其中的丁二酸。

萃取方法为：发酵液:萃取剂的体积比为1:0.8-1:1.5，萃取剂为三辛胺和正辛醇的混合溶剂，三辛胺:正辛醇的体积比为2:1~5:1，萃取温度为25~40℃，萃取时间30~60 min，分液后取萃取相；然后在25~40℃下，按照萃取相: 碳酸钠溶液体积比4:1~2:1的比例加入1~2mol/L的碳酸钠溶液，反萃取45~60 min，反萃取后分液；最后将得到的反萃取溶液调pH至1~2.5，浓缩结晶，得到丁二酸晶体。

分析方法：

有机酸分析：将发酵培养液离心，采用高效液相色谱法分析上清液中的琥珀酸等代谢产物及糖类物质。采用美国Waters高效液相色谱仪，Waters RI检测器，Breeze色谱工作站。其中，琥珀酸，乙酸，乳酸和甲酸等有机酸的测定使用Aminex HPX-87H离子色谱柱（300 mm×7.8 mm, 9 μm; Bio-Rad Chemical Division, Richmond, Calif.），流动相8 mM硫酸；柱温55℃；流速0.5 mL/min；进样量10 μL。

葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖等糖类含量的测定采用Zobax NH₂氨基柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm; Agilent, USA)，流动相：75％乙腈；流速1 mL/min；进样量10 μL。

α-淀粉酶活力测定：参照国家行业标准QB /T2306-97进行。1个酶活单位定义为在90℃、pH 6.0的条件下，1 min液化1 mg淀粉成为糊精所需的酶量。用U/mL 表示。

糖化酶活力测定：参照GB 8276-2006 食品添加剂糖化酶制剂进行。1mL酶液在40℃、pH4.6的条件下，1 min水解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖，为一个酶活力单位，符号为：U/mL。

纤维素酶活力测定：以滤纸酶活(FPU)表示纤维素酶的总活力，按照国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定 (Pure Appl Chem, 1987,59(2):257-268)。取适当稀释的酶液0.5 mL，加入1mL 0.1M的pH 4.8 的醋酸缓冲液和一条16 cm Whatman NO.1 滤纸(约50mg)，在50 ℃下恒温水浴中振荡反应1 h，反应完后加入3 mL DNS试剂，沸水浴5min，迅速冷却后定容到25 mL，于540 nm处测定OD值。滤纸酶活定义：在酶促反应中每min生成1.0 μmol 葡萄糖所需的酶量为一个国际酶活单位(IU/mL)。

纤维二糖酶活力测定：纤维二糖酶活力 (CBA) 按照IUPAC推荐的标准方法测定(Pure Appl Chem, 1987,59(2):257-268)。取1.0 mL的纤维二糖底物(15 mmol/L、pH 4.8)于比色管中，加入1 mL适当稀释的酶液，在50℃下恒温反应30 min。反应结束后使用SBA生物传感分析仪测定葡萄糖含量。定义一个纤维二糖酶活力国际单位 (CBIU) 等于标准酶促反应条件下每分钟生成2.0 μmol葡萄糖的酶量。

木聚糖酶活力测定：取0.05 mL适当稀释的粗酶液，加入0.45 mL 0.05 M柠檬酸缓冲溶液（pH 4.8）及1.0 mL 1.2%木聚糖底物，在50℃条件下反应30 min。反应结束后用DNS法测定所得的还原糖含量。每分钟分解木聚糖底物释放出1.0 μmol还原糖（以木糖计）所需要的木聚糖酶量为一个木聚糖酶活力。

酒糟成分测定：

采用GBT 5009.9-2008 食品中淀粉的测定酶法测定酒糟原料中的淀粉。

Van Soest凡氏法分析测定酒糟原料中的纤维素和半纤维素（《饲料分析及饲料质量检测技术》，P70，北京农业大学出版社）。

本发明的有益效果：本发明以酒糟作为原料发酵生产丁二酸，具有以下的特点和优点：（1）发酵培养基中不需要添加外加氮源，大大减少了丁二酸发酵的碳、氮原料成本。（2）发酵前添加酶进行两级预水解，有效地将酒糟中的淀粉与部分纤维素酶水解，产生可供菌种利用的水解糖，缩短发酵周期，提高发酵效率。（3）采用边糖化边发酵的方法产丁二酸，增加了反应器利用效率，增加反应速度，减少产物抑制，增加生产强度。本发明丁二酸对酒糟产率可达到0.033-0.05 g/g酒糟，表明了良好的应用价值。

具体实施方式

实施例1-2 黄酒糟发酵产丁二酸

将新鲜黄酒糟放入105℃烘箱内，烘8 h左右，取出后粉碎，得到60目酒糟颗粒。测得其淀粉含量13.5%，粗纤维6.2%，蛋白质13.8%，其水份含量20%以下，酒精的含量在0.005 g酒精/g酒糟以下。

在各取50 mL培养基，分别加入20 g与25 g黄酒糟，磷酸缓冲体系为K₂HPO₄·3H₂O 2 g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 2 g/L，MgCl₂ ·6H₂O 与CaCl₂ 1 g/L，乙酸钠1-3 g/L，pH为7.0，120℃灭菌。

先加入市售α-淀粉酶（山东杰诺）50 U/g酒糟，90℃水解1.0 h，降温至50-60℃，然后调节pH为4.8，加入市售糖化酶（杰能科）40 U/g酒糟，市售纤维素酶（康地恩）10 FPU/g酒糟，市售纤维二糖酶（诺维信）5 U/g酒糟，市售木聚糖酶（康地恩）40 U/g酒糟，50℃水解4.5 h。

按5%~10%接入琥珀酸放线杆菌CGMCC No.1593，充入CO₂，37℃培养72 h。调节维持发酵液pH 6.0~7.5。测得发酵液中有机酸含量如表1。

表1 黄酒糟摇瓶发酵结果

	黄酒糟（g/L）	丁二酸（g/L）	乳酸（g/L）	甲酸（g/L）	乙酸（g/L）
						实施例1	400	16.29	8.15	19.03	7.17
实施例2	500	20.72	6.73	19.87	9.62

实施例3-4白酒糟发酵产丁二酸

将新鲜白酒糟放入105℃烘箱内，烘干8 h左右，取出后粉碎，得到40-60目酒糟颗粒。测得其淀粉含量10.2%，粗纤维26.8%，蛋白质8.2%，其水份含量20%以下，酒精的含量在0.005 g酒精/g酒糟以下。

按实施例1的方法，在各50 mL摇瓶中，分别加入20g或25 g白酒糟，配制发酵培养基，添加酶两级预水解，按5%~10%接入琥珀酸放线杆菌CGMCC No.1593，充入CO₂，37℃培养72 h。调节维持发酵液pH 6.0~7.5。测得摇瓶发酵液中有机酸含量如表2。

表2 白酒糟摇瓶发酵结果

	白酒糟（g/L）	丁二酸（g/L）	乳酸（g/L）	甲酸（g/L）	乙酸（g/L）
						实施例3	400	22.32	34.14	4.66	7.27
实施例4	500	28.44	31.84	24.65	6.77

实施例5酒糟发酵液中丁二酸的提取

酒糟发酵结束后的发酵液，通过离心或板框压滤得到发酵清液，其丁二酸浓度为30.4 g/L。取200 mL发酵清液，调节pH为2，加入1.5%（w/v）活性炭进行脱色，用732阳离子交换树脂脱盐，得到体积约为290 mL的脱盐液, 其丁二酸浓度为20.5 g/L。用290 mL萃取剂（三辛胺:正辛醇=7:3，v/v）于40℃下萃取，萃取时间50 min，萃取相含17 g/L的丁二酸；分液后取萃取相，然后在40℃下，按照萃取相: 碳酸钠溶液体积比2:1的比例加入1.5 mol/L的碳酸钠溶液，进行反萃取60 min，反萃取后分液，测得反萃取溶液中丁二酸浓度为31g/L；然后将反萃取溶液调pH至2左右，浓缩得到4.1 g丁二酸晶体。

Claims

1.一种以酒糟为原料发酵生产丁二酸的方法，其特征是新鲜酒糟经脱水、粉碎预处理，配制成酒糟发酵培养基，再经α-淀粉酶预水解、及糖化酶和复合纤维素酶两级预水解，然后与琥珀酸放线杆菌边糖化边发酵生产丁二酸，并从发酵液中提取丁二酸，步骤为：

（1）新鲜酒糟预处理：

将新鲜的酒糟放入105℃烘箱内，烘6~12 h，使其水份含量20%以下，酒精含量在0.005 g酒精/g酒糟以下；并粉碎，得到40~80目的干酒糟颗粒；

（2）配制酒糟发酵培养基：

发酵培养基组成质量浓度为：干酒糟400~1000 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2~3 g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 2~3 g/L，MgCl₂·6H₂O 与CaCl₂ 1~3 g/L，NaAc 1~3 g/L，pH为6.0~7.0，120℃灭菌20分钟；

（3）水解酶两级预水解：

在灭菌后的发酵培养基中，加入α-淀粉酶，其添加量为20~50 U/g干酒糟，酶解温度80~100℃，作用时间0.5~1.0 h；待培养基温度降为50~60℃后，再调pH为4.0~5.0，并同时加入糖化酶和复合纤维素酶，复合纤维素酶由市售的纤维素酶、纤维二糖酶和木聚糖酶组成，其添加量之比为每克干酒糟加入10~40 U糖化酶，1~20 FPU纤维素酶，1~10 U纤维二糖酶，10~50 U木聚糖酶，在温度50~60℃继续水解0.5~5 h；

（4）同步糖化发酵：

经两级预水解后的发酵培养基，冷却到35~40℃，接入琥珀酸放线杆菌CGMCC No.1593或其突变株，于30~45℃在充满CO₂的环境中，静止或震荡培养20~72 h；并用碳酸盐或碱溶液调节维持发酵液pH 6.0~7.5；

（5）从发酵液中提取丁二酸：

酒糟发酵结束后的发酵液，通过离心或板框压滤得到发酵清液，调节pH为1~3，加入w/v发酵清液计0.5%~3.0%活性炭进行脱色，用732阳离子交换树脂脱盐，再通过萃取剂萃取，提取其中的丁二酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于酒糟原料为酿造废弃的黄酒酒糟或白酒酒糟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于从发酵液中提取丁二酸的萃取方法为：发酵液:萃取剂的体积比为1:0.8-1:1.5，萃取剂为三辛胺和正辛醇的混合溶剂，三辛胺:正辛醇的体积比为2:1~5:1，萃取温度为25~40℃，萃取时间30~60 min，分液后取萃取相；然后在25~40℃下，按照萃取相: 碳酸钠溶液体积比4:1~2:1的比例加入1~2mol/L的碳酸钠溶液，反萃取45~60 min，反萃取后分液；最后将得到的反萃取溶液调pH至1~2.5，浓缩结晶，得到丁二酸晶体。