CN117187309A - 利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法，属于生物发酵技术领域，所述利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法包括稀酸水解、脱毒、菌种活化培养、发酵、后处理5个步骤；本发明利用蔗渣发酵制备了丁二酸，所得发酵成熟醪液中残糖含量为0.85~1.36g/L，丁二酸含量为52.03~56.64 g/L，丁二酸产率为62.3~66.8%。
Description
技术领域
本发明涉及利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法，属于生物发酵技术领域。
背景技术
丁二酸，又称琥珀酸，是一种重要的“C4平台化合物”，广泛应用于食品、医药、农业领域，可作为合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮及可降解生物高分子材料聚丁二酸丁二醇酯等的原料，具有广泛的应用前景。近年来，随着丁二酸新的应用领域的不断开拓，国内外市场对于丁二酸的需求量猛增。传统的丁二酸生产方法主要为石化合成法，这种化学合成法生产丁二酸是以不可再生的战略资源石油作为原料，成本高，环境污染严重，对于石油依赖性强，无法实现可持续发展，严重阻碍了丁二酸的发展潜力。在石油资源日益枯竭的今天，发展环境友好的绿色生物技术已经成为一种趋势，因此，微生物发酵制备丁二酸越来越引起人们的兴趣。
微生物发酵制备丁二酸多直接以葡萄糖为原料，这很大程度上增大了发酵法制备丁二酸的成本。据报道，一些废弃的廉价可再生纤维素资源如秸秆、玉米皮、甘蔗渣等经过处理后得到的水解液可作为微生物发酵制备丁二酸的原料。我国甘蔗产量很大，每年都会产生数百万吨的甘蔗渣，因此以蔗渣为原料，用发酵法制备丁二酸是低成本得到丁二酸的可行路径。
目前丁二酸发酵菌种分为两大类，第一类是天然产琥珀酸菌株， 如放线杆菌、厌氧螺菌、曼海姆菌，第二类是通过代谢过程改造的工程菌，主要是大肠杆菌和酵母菌。天然产琥珀酸菌株虽然能高产琥珀酸但有明显的缺点，如不耐酸、不耐氧，只利用葡萄糖为碳源，高昂的培养成本，限制了其大规模工业化生产。大肠杆菌工程菌发酵生产效率较低、不耐酸、发酵过程中有乳酸、甲酸、乙酸、乙醇等副产物产生，同时发酵过程辅因子代谢不平衡、不能耐受高浓度的产物浓度以及底物葡萄糖浓度、高浓度渗透压和葡萄糖吸收利用速度过快等导致代谢失衡的问题。酵母作为真核模式微生物，具有遗传背景清晰、易操作、耐低pH、耐受高浓度底物、营养需求简单、成本低廉、兼性厌氧等特性。目前已有多种酵母菌可用于丁二酸的发酵生产，但以蔗渣为原料，利用酵母菌来发酵制备丁二酸未见报道。
中国专利CN102352383A公开了一种利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法。本发明所述的方法包括丁二酸生产菌的菌种活化、种子培养及发酵培养产丁二酸的步骤，其技术要点在于发酵培养产丁二酸的步骤包括超声处理蔗渣、用稀酸水解方法制备多组分糖液、将备用碳源直接添加至不含碳源的发酵培养基中、节省氮源用量、接种产酸的步骤。采用该方法发酵制备丁二酸能进一步降低蔗渣纤维水解糖液的制备成本，还能用蔗渣替代部分昂贵的氮源，解决了传统发酵产丁二酸原料成本高的技术问题，又实现了高效利用可再生资源、对环境友好等优点，展现出其美好的工业应用前景。该专利使用放线杆菌NJ113发酵，该菌种不耐低pH，因此需要大量碱性物质来维持相对较高的pH值，这既增加了工艺操作的复杂性，又增加了丁二酸从反应体系中分离的成本。
中国专利CN104894174A公开了一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明方法是以榨糖工业的主要副产物甘蔗渣为原料，经过粉碎，稀碱预处理，以及纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶的共同水解，得到水解糖液；利用琥珀酸放线杆菌发酵水解糖液生产丁二酸，同时在发酵液中添加甘蔗渣水解的残渣，使得发酵可以反复运行，节省种子培养，而且可以用有机溶剂萃取稀碱预处理后的残液中的糠醛。本发明方法，实现了甘蔗渣水解残渣的合理使用，减少常规发酵的种子培养环节，节约了发酵成本、提高了发酵效率，同时对发酵设备要求低，不需要对已有的发酵罐做出额外改进，适合工业化生产。该专利发酵菌种仍然是放线杆菌，这会增加工艺操作的复杂性，分离丁二酸的成本也相对比较高。
以上可以看到，目前利用蔗渣发酵制备丁二酸多采用放线杆菌，这一菌种的发酵过程存在工艺操作复杂，丁二酸分离成本高等缺点，因此以蔗渣为原料，开发一种利用酵母菌发酵来制备丁二酸的方法具有非常重要的现实意义。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明提供利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法，实现以下发明目的：以蔗渣为原料，利用酵母菌，在低pH条件下，用较为简单的工艺制备出丁二酸发酵成熟醪液，该丁二酸发酵成熟醪液以相对简单的工艺过程就可以分离得到纯度比较高的丁二酸。
为实现上述发明目的，本发明采取以下技术方案：
利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法，所述利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法包括稀酸水解、脱毒、菌种活化培养、发酵、后处理5个步骤；
以下是对上述技术方案的进一步改进：
步骤1、稀酸水解
将蔗渣烘干至水分含量0.2~1.0wt%后粉碎成30~80目的蔗渣颗粒，把蔗渣颗粒和稀硫酸水溶液按质量比10~30:100加到反应釜中，然后将反应釜温度升至120~150℃、釜内压力升至1.2~3.0×105Pa，控制搅拌速率150~350转/分条件下，恒温恒压水解3~5小时后，降至室温常压后，抽滤，滤出的固态物用去离子水洗涤2~3次，每次洗涤所用去离子水的质量为蔗渣颗粒质量的3~9%，收集滤液和洗涤液即为稀酸水解液；
所述稀硫酸水溶液中硫酸的质量分数为0.7~1.1wt%，该溶液配制用水为去离子水。
步骤2、脱毒
将乙酸仲丁酯、乙二酰二胺、十二胺、氯仿按质量比70~95:4~9:1~5:10~20混合溶解成均一稳定的萃取液后，加到萃取反应釜中，然后加入稀酸水解液，稀酸水解液与萃取液的质量比为2:2~5，控制转速250~500转/分，搅拌萃取2~4小时后停止搅拌，静置分层5~10小时后分离出有机相和水相，得到的水相即为脱毒水解液。
步骤3、菌种活化培养
将酵母菌种子菌株解冻后，划线于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基上，26~30℃条件下活化培养30~40小时后得到活化好的菌种，再将活化好的菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基内，然后放于摇床上，控制温度28~31℃、摇床转速150~200转/分，连续培养20~36小时后，将菌种和液体培养基一块放入离心机内，10000~16000转/分下离心10~25分钟后，弃去上清液，得到的固态菌体用无菌水洗涤2~4次后即为活化培养出的酵母菌；
所述酵母菌种子菌株为库德里阿兹威毕赤酵母，是从云南野生水果表皮分离得到的耐酸酵母库德里阿兹威毕赤酵母CY902菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20885，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述将活化好的菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基内，活化好的菌种的接种量为酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基体积的6~11%；
所述酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成以重量份计为：葡萄糖20~26份，酵母浸粉10~15份，蛋白胨20~28份，琼脂粉32~39份，蒸馏水150~210份，115~130℃灭菌15~35min；
所述酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，其组成以重量份计为：葡萄糖20~26份，酵母浸粉10~15份，蛋白胨20~28份，蒸馏水150~210份，115~130℃灭菌15~35min；
所述无菌水洗涤，每次洗涤所用无菌水的用量为固态菌体质量的50~80%。
步骤4、发酵
往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，控制温度28~32℃，在搅拌速率200~400转/分下，发酵60~85小时，发酵过程中，持续添加水滑石，控制发酵液的pH值为2.0~4.0，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；
所述往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，活化培养出的酵母菌的接种量为发酵培养基体积的8~13%；
所述发酵培养基的组成，以重量份计，为：50~82份脱毒水解液、5~12份酵母浸粉、3~9份蛋白胨，培养基在115~130℃下灭菌15~30分钟；
所述水滑石的粒径为1~30μm。
步骤5、后处理
将发酵成熟醪液过滤，滤液经离心后，收集上清液，然后将上清液减压蒸发浓缩，浓缩至原体积的三分之一后，得到浓缩液，将浓缩液冷却至0~4℃，在0~4℃温度下静置35~58小时后，丁二酸结晶析出，过滤分离晶体和母液，收集晶体后干燥，得到丁二酸成品。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
1、本发明以蔗渣为原料，利用酵母菌，在低pH条件下，用较为简单的工艺制备出丁二酸发酵成熟醪液，并用相对简单的工艺过程从丁二酸发酵成熟醪液分离得到了丁二酸；
2、本发明用乙酸仲丁酯、乙二酰二胺、十二胺、氯仿配成了高效的萃取液，成功的从蔗渣的稀酸水解液中萃取去除了对酵母菌发酵的有害物质，保证了酵母菌的在整个发酵过程中的高活性，进而能够得到较高产率的丁二酸；
3、本发明用水滑石来控制发酵体系的pH值，水滑石是弱碱性物质，同时还具有一定的离子交换能力和吸附作用，水滑石的引入不仅有效控制了发酵体系的pH，使pH不至于过低，影响酵母菌的活性，另外还能交换发酵体系中产生的一些杂质离子，这样后续无需再用离子交换树脂进行离子交换来去除杂质离子，简化了后处理步骤，水滑石还能吸附蔗渣水解液中的一些深色物质，这能提高丁二酸产品的纯度和产率，另外水滑石为不溶于水的固体，非常容易从发酵液体系中分离出来；
4、本发明利用蔗渣发酵制备了丁二酸，所得发酵成熟醪液中残糖含量为0.85~1.36g/L，丁二酸含量为52.03~56.64 g/L，丁二酸产率为62.3~66.8%。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
以下所有实施例和对比例所涉及的耐酸酵母库德里阿兹威毕赤酵母（Pichiakudriavzevii）CY902菌株来源于中国科学院天津工业生物技术研究所。
实施例1： 利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法
步骤1、稀酸水解
将蔗渣烘干至水分含量0.8wt%后粉碎成60目的蔗渣颗粒，把蔗渣颗粒和稀硫酸水溶液按质量比23:100加到反应釜中，然后将反应釜温度升至130℃、釜内压力升至2.3×105Pa，控制搅拌速率230转/分条件下，恒温恒压水解4小时后，降至室温常压后，抽滤，滤出的固态物用去离子水洗涤2次，每次洗涤所用去离子水的质量为蔗渣颗粒质量的5%，收集滤液和洗涤液即为稀酸水解液；
所述稀硫酸水溶液中硫酸的质量分数为0.9wt%，该溶液配制用水为去离子水。
步骤2、脱毒
将乙酸仲丁酯、乙二酰二胺、十二胺、氯仿按质量比85:7:4:15混合溶解成均一稳定的萃取液后，加到萃取反应釜中，然后加入稀酸水解液，稀酸水解液与萃取液的质量比为2:3，控制转速350转/分，搅拌萃取3小时后停止搅拌，静置分层8小时后分离出有机相和水相，得到的水相即为脱毒水解液。
步骤3、菌种活化培养
将酵母菌种子菌株解冻后，划线于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基上，29℃条件下活化培养36小时后得到活化好的菌种，再将活化好的菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基内，然后放于摇床上，控制温度29℃、摇床转速180转/分，连续培养32小时后，将菌种和液体培养基一块放入离心机内，14000转/分下离心15分钟后，弃去上清液，得到的固态菌体用无菌水洗涤3次后即为活化培养出的酵母菌；
所述酵母菌种子菌株为库德里阿兹威毕赤酵母，是从云南野生水果表皮分离得到的耐酸酵母库德里阿兹威毕赤酵母CY902菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20885，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述将活化好的菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基内，活化好的菌种的接种量为酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基体积的9%；
所述酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成以重量份计为：葡萄糖24份，酵母浸粉14份，蛋白胨26份，琼脂粉35份，蒸馏水190份，125℃灭菌28min；
所述酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，其组成以重量份计为：葡萄糖24份，酵母浸粉12份，蛋白胨23份，蒸馏水180份，125℃灭菌30min；
所述无菌水洗涤，每次洗涤所用无菌水的用量为固态菌体质量的65%。
步骤4、发酵
往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，控制温度31℃，在搅拌速率350转/分下，发酵80小时，发酵过程中，持续添加水滑石，控制发酵液的pH值为3.5，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；
所述往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，活化培养出的酵母菌的接种量为发酵培养基体积的11%；
所述发酵培养基的组成，以重量份计，为：62份脱毒水解液、10份酵母浸粉、7份蛋白胨，培养基在125℃下灭菌19分钟；
所述水滑石的粒径为10μm。
步骤5、后处理
将发酵成熟醪液过滤，滤液经离心后，收集上清液，然后将上清液减压蒸发浓缩，浓缩至原体积的三分之一后，得到浓缩液，将浓缩液冷却至1℃，在1℃温度下静置49小时后，丁二酸结晶析出，过滤分离晶体和母液，收集晶体后干燥，得到丁二酸成品。
实施例2： 利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法
步骤1、稀酸水解
将蔗渣烘干至水分含量0.2wt%后粉碎成30目的蔗渣颗粒，把蔗渣颗粒和稀硫酸水溶液按质量比10:100加到反应釜中，然后将反应釜温度升至120℃、釜内压力升至1.2×105Pa，控制搅拌速率150转/分条件下，恒温恒压水解3小时后，降至室温常压后，抽滤，滤出的固态物用去离子水洗涤2次，每次洗涤所用去离子水的质量为蔗渣颗粒质量的3%，收集滤液和洗涤液即为稀酸水解液；
所述稀硫酸水溶液中硫酸的质量分数为0.7wt%，该溶液配制用水为去离子水。
步骤2、脱毒
将乙酸仲丁酯、乙二酰二胺、十二胺、氯仿按质量比70:4:1:10混合溶解成均一稳定的萃取液后，加到萃取反应釜中，然后加入稀酸水解液，稀酸水解液与萃取液的质量比为2:2，控制转速250转/分，搅拌萃取2小时后停止搅拌，静置分层5小时后分离出有机相和水相，得到的水相即为脱毒水解液。
步骤3、菌种活化培养
将酵母菌种子菌株解冻后，划线于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基上，26℃条件下活化培养30小时后得到活化好的菌种，再将活化好的菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基内，然后放于摇床上，控制温度28℃、摇床转速150转/分，连续培养20小时后，将菌种和液体培养基一块放入离心机内，10000转/分下离心10分钟后，弃去上清液，得到的固态菌体用无菌水洗涤2次后即为活化培养出的酵母菌；
所述酵母菌种子菌株为库德里阿兹威毕赤酵母，是从云南野生水果表皮分离得到的耐酸酵母库德里阿兹威毕赤酵母CY902菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20885，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述将活化好的菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基内，活化好的菌种的接种量为酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基体积的6%；
所述酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成以重量份计为：葡萄糖20份，酵母浸粉10份，蛋白胨20份，琼脂粉32份，蒸馏水150份，115℃灭菌15min；
所述酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，其组成以重量份计为：葡萄糖20份，酵母浸粉10份，蛋白胨20份，蒸馏水150份，115℃灭菌15min；
所述无菌水洗涤，每次洗涤所用无菌水的用量为固态菌体质量的50%。
步骤4、发酵
往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，控制温度28℃，在搅拌速率200转/分下，发酵60小时，发酵过程中，持续添加水滑石，控制发酵液的pH值为2.0，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；
所述往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，活化培养出的酵母菌的接种量为发酵培养基体积的8%；
所述发酵培养基的组成，以重量份计，为：50份脱毒水解液、5份酵母浸粉、3份蛋白胨，培养基在115℃下灭菌15分钟；
所述水滑石的粒径为1μm。
步骤5、后处理
将发酵成熟醪液过滤，滤液经离心后，收集上清液，然后将上清液减压蒸发浓缩，浓缩至原体积的三分之一后，得到浓缩液，将浓缩液冷却至0℃，在0℃温度下静置35小时后，丁二酸结晶析出，过滤分离晶体和母液，收集晶体后干燥，得到丁二酸成品。
实施例3： 利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法
步骤1、稀酸水解
将蔗渣烘干至水分含量1.0wt%后粉碎成80目的蔗渣颗粒，把蔗渣颗粒和稀硫酸水溶液按质量比30:100加到反应釜中，然后将反应釜温度升至150℃、釜内压力升至3.0×105Pa，控制搅拌速率350转/分条件下，恒温恒压水解5小时后，降至室温常压后，抽滤，滤出的固态物用去离子水洗涤3次，每次洗涤所用去离子水的质量为蔗渣颗粒质量的9%，收集滤液和洗涤液即为稀酸水解液；
所述稀硫酸水溶液中硫酸的质量分数为1.1wt%，该溶液配制用水为去离子水。
步骤2、脱毒
将乙酸仲丁酯、乙二酰二胺、十二胺、氯仿按质量比95:9:5:20混合溶解成均一稳定的萃取液后，加到萃取反应釜中，然后加入稀酸水解液，稀酸水解液与萃取液的质量比为2:5，控制转速500转/分，搅拌萃取4小时后停止搅拌，静置分层10小时后分离出有机相和水相，得到的水相即为脱毒水解液。
步骤3、菌种活化培养
将酵母菌种子菌株解冻后，划线于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基上，30℃条件下活化培养40小时后得到活化好的菌种，再将活化好的菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基内，然后放于摇床上，控制温度31℃、摇床转速200转/分，连续培养36小时后，将菌种和液体培养基一块放入离心机内，16000转/分下离心25分钟后，弃去上清液，得到的固态菌体用无菌水洗涤4次后即为活化培养出的酵母菌；
所述酵母菌种子菌株为库德里阿兹威毕赤酵母，是从云南野生水果表皮分离得到的耐酸酵母库德里阿兹威毕赤酵母CY902菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20885，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述将活化好的菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基内，活化好的菌种的接种量为酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基体积的11%；
所述酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成以重量份计为：葡萄糖26份，酵母浸粉15份，蛋白胨28份，琼脂粉39份，蒸馏水210份，130℃灭菌35min；
所述酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，其组成以重量份计为：葡萄糖26份，酵母浸粉15份，蛋白胨28份，蒸馏水210份，130℃灭菌35min；
所述无菌水洗涤，每次洗涤所用无菌水的用量为固态菌体质量的80%。
步骤4、发酵
往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，控制温度32℃，在搅拌速率400转/分下，发酵85小时，发酵过程中，持续添加水滑石，控制发酵液的pH值为4.0，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；
所述往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，活化培养出的酵母菌的接种量为发酵培养基体积的13%；
所述发酵培养基的组成，以重量份计，为：82份脱毒水解液、12份酵母浸粉、9份蛋白胨，培养基在130℃下灭菌30分钟；
所述水滑石的粒径为30μm。
步骤5、后处理
将发酵成熟醪液过滤，滤液经离心后，收集上清液，然后将上清液减压蒸发浓缩，浓缩至原体积的三分之一后，得到浓缩液，将浓缩液冷却至4℃，在4℃温度下静置58小时后，丁二酸结晶析出，过滤分离晶体和母液，收集晶体后干燥，得到丁二酸成品。
对比例1：实施例1基础上，不进行步骤2、脱毒，具体操作如下：
步骤1操作同于实施例1；
不进行步骤2；
步骤3操作同于实施例1；
步骤4、发酵
往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，控制温度31℃，在搅拌速率350转/分下，发酵80小时，发酵过程中，持续添加水滑石，控制发酵液的pH值为3.5，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；
所述往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，活化培养出的酵母菌的接种量为发酵培养基体积的11%；
所述发酵培养基的组成，以重量份计，为：62份稀酸水解液、10份酵母浸粉、7份蛋白胨，培养基在125℃下灭菌19分钟；
所述水滑石的粒径为10μm；
步骤5操作同于实施例1。
对比例2：实施例1基础上，步骤4、发酵中，不加入水滑石，具体操作如下：
步骤1、2、3操作同于实施例1；
步骤4、发酵
往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，控制温度31℃，在搅拌速率350转/分下，发酵80小时，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；
所述往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，活化培养出的酵母菌的接种量为发酵培养基体积的11%；
所述发酵培养基的组成，以重量份计，为：62份脱毒水解液、10份酵母浸粉、7份蛋白胨，培养基在125℃下灭菌19分钟；
步骤5操作同于实施例1。
发酵结果对比：
对实施例1、2、3和对比例1、2得到发酵成熟醪液，测试其中的残糖量和丁二酸含量，并依据最终得到的丁二酸成品量来计算丁二酸的产率，具体结果见下面表1；
从表1中的数据可以看到，对比例1残糖含量大幅增加，丁二酸含量和产率大幅降低，这表明脱毒步骤能够有效去除对酵母菌有毒害作用的物质，进而促进酵母菌发酵的效率，使丁二酸的产量和产率大幅上升；对比例2，不加入水滑石调控反应体系的pH，这会导致反应体系的pH过低，影响酵母菌的活性，导致丁二酸的产量下降，但与对比例1相比，对比例2的残糖量小于对比例1，丁二酸含量大于对比例1，但丁二酸的产率反而小于对比例1，这说明水滑石的加入，不仅起到调控pH，维持酵母菌活性的作用，同时还能提高丁二酸的产率。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法，其特征在于：
所述利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法包括稀酸水解、脱毒、菌种活化培养、发酵、后处理5个步骤；
所述稀酸水解，其方法为：将蔗渣烘干至水分含量0.2~1.0wt%后粉碎成30~80目的蔗渣颗粒，把蔗渣颗粒和稀硫酸水溶液按质量比10~30:100加到反应釜中，然后将反应釜温度升至120~150℃、釜内压力升至1.2~3.0×105Pa，控制搅拌速率150~350转/分条件下，恒温恒压水解3~5小时后，降至室温常压后，抽滤，滤出的固态物用去离子水洗涤2~3次，每次洗涤所用去离子水的质量为蔗渣颗粒质量的3~9%，收集滤液和洗涤液即为稀酸水解液；
所述脱毒，其方法为：将乙酸仲丁酯、乙二酰二胺、十二胺、氯仿按质量比70~95:4~9:1~5:10~20混合溶解成均一稳定的萃取液后，加到萃取反应釜中，然后加入稀酸水解液，稀酸水解液与萃取液的质量比为2:2~5，控制转速250~500转/分，搅拌萃取2~4小时后停止搅拌，静置分层5~10小时后分离出有机相和水相，得到的水相即为脱毒水解液；
所述菌种活化培养，其方法为：将酵母菌种子菌株解冻后，划线于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基上，26~30℃条件下活化培养30~40小时后得到活化好的菌种，再将活化好的菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基内，然后放于摇床上，控制温度28~31℃、摇床转速150~200转/分，连续培养20~36小时后，将菌种和液体培养基一块放入离心机内，10000~16000转/分下离心10~25分钟后，弃去上清液，得到的固态菌体用无菌水洗涤2~4次后即为活化培养出的酵母菌；
所述发酵，其方法为：往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，控制温度28~32℃，在搅拌速率200~400转/分下，发酵60~85小时，发酵过程中，持续添加水滑石，控制发酵液的pH值为2.0~4.0，发酵结束后，出料得到发酵成熟醪液；
所述后处理，其方法为：将发酵成熟醪液过滤，滤液经离心后，收集上清液，然后将上清液减压蒸发浓缩，浓缩至原体积的三分之一后，得到浓缩液，将浓缩液冷却至0~4℃，在0~4℃温度下静置35~58小时后，丁二酸结晶析出，过滤分离晶体和母液，收集晶体后干燥，得到丁二酸成品。
2.根据权利要求1所述的利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法，其特征在于：
所述稀硫酸水溶液中硫酸的质量分数为0.7~1.1wt%，该溶液配制用水为去离子水。
3.根据权利要求1所述的利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法，其特征在于：
所述酵母菌种子菌株为库德里阿兹威毕赤酵母，是从云南野生水果表皮分离得到的耐酸酵母库德里阿兹威毕赤酵母CY902菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20885，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述将活化好的菌种接种于酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基内，活化好的菌种的接种量为酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基体积的6~11%；
所述酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成以重量份计为：葡萄糖20~26份，酵母浸粉10~15份，蛋白胨20~28份，琼脂粉32~39份，蒸馏水150~210份，115~130℃灭菌15~35min；
所述酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，其组成以重量份计为：葡萄糖20~26份，酵母浸粉10~15份，蛋白胨20~28份，蒸馏水150~210份，115~130℃灭菌15~35min；
所述无菌水洗涤，每次洗涤所用无菌水的用量为固态菌体质量的50~80%。
4.根据权利要求1所述的利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法，其特征在于：
所述往发酵罐中的发酵培养基上接种活化培养出的酵母菌，活化培养出的酵母菌的接种量为发酵培养基体积的8~13%；
所述发酵培养基的组成，以重量份计，为：50~82份脱毒水解液、5~12份酵母浸粉、3~9份蛋白胨，培养基在115~130℃下灭菌15~30分钟；
所述水滑石的粒径为1~30μm。
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-
2023
- 2023-11-06 CN CN202311460711.2A patent/CN117187309B/zh active Active
Patent Citations (5)
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
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| 姚嘉旻;姜岷;吴昊;陈可泉;: "稀酸水解玉米芯制备丁二酸", 生物加工过程, no. 03, pages 69 - 75 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117187309B (zh) | 2024-03-08 |
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