CN102876731A - 一种稻壳生产生物丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稻壳生产生物丁醇的方法，包括以下步骤：（1）稻壳收集和预处理；（2）稻壳水解：按过筛物稻壳粉末质量:稀硫酸体积=1:5-10的比例向过筛物稻壳粉末中加入质量浓度为1-15%的稀硫酸，在100-180℃水解1-5小时，得桐壳水解液，控制水解液中总糖浓度为30-40g/L；（3）稻壳水解液发酵培养基的配制；（4）稻壳水解液发酵：将步骤(3)中配制好的培养基转入发酵罐中，然后接种预先培养好的菌种，菌种的接种量为发酵水解液培养基体积的6%-12%，在35-40℃厌氧发酵72-120小时，即成。利用本发明，可提高稻米加工副产物稻壳的利用率，减少资源浪费和环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种稻壳生产生物丁醇的方法。
背景技术
稻壳（干重）中纤维素约为40%，木质素大约占20%，五碳糖聚合物（其中主要为半纤维素）有20%左右，还有少量粗蛋白、粗脂肪等有机化合物及一些灰分（大部分是作为骨架结构的二氧化硅）约占20%[Lin L,Ying D,Chaitep S，et al.Biodiesel production from crude rice bran oil and properties as fuel.AppliedEnergy，2009,86，(5),681-688]。稻壳是碾米工业的主要副产品之一，约占稻谷质量的20%。全世界每年产稻谷约为4亿吨，产生稻壳超过8000万吨。我国稻谷的产量为1.8亿吨，副产的稻壳近3800万吨[田娟娟，王哲，王丹.稻壳综合利用研究进展与经济效益对比分析.粮油加工，2011,(12),147-149]。有效利用稻壳等大米加工副产品，对我国农副产品深加工、将农业纤维废弃物变废为宝、减少环境污染等问题都有着深远的意义。
丁醇是一种重要的平台化学品，主要用于制造增塑剂或用作溶剂、萃取剂等；近年来，研究人员发现丁醇的热值、辛烷值与汽油相当；其含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道、不易吸水，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合。所以，丁醇已成为被世界各国企业和研究机构强烈关注的一种极具潜力的新型生物燃料[Durre,P.,Biobutanol：anattractive biofuel.Biotechnol.J.2007,2,(12),1525-34.]。
发酵法生产丙酮丁醇曾经是仅次于乙醇的全球第二大发酵工业。近年来随着石油价格的不断上涨，丁醇发酵工业已迎来复苏产业的大好时机。第一代生物燃料主要以玉米、小麦等粮食作物作为生产原料，日趋严峻的世界粮食安全形势让其渐失优势，而以非粮作物燃料和纤维素燃料等为代表的第二代生物燃料，遵循“不与粮争地、不与人争食”的路线，成为未来生物质能源产业发展的方向。
目前，已经有国内外研究者报道了利用各种生物质来生产丁醇的尝试，报道的生物质大多是农业废弃物，如大麦秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、玉米皮、玉米芯等。然而，利用稻米加工副产物稻壳来生产生物丁醇未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稻壳生产生物丁醇的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种稻壳生产生物丁醇的方法，包括以下步骤：
（1）稻壳收集和预处理：将稻壳收集后，晒干或烘干，经粉碎机粉碎后，过100目筛，得过筛物稻壳粉末；
（2）稻壳水解：按过筛物稻壳粉末质量(Kg):稀硫酸体积(L)=1:5-10的比例向过筛物稻壳粉末中加入质量浓度为1-15%的稀硫酸，100-180℃水解1-5小时，得稻壳水解液，控制稻壳水解液中总糖浓度为30-40g/L；
（3）稻壳水解液发酵培养基的配制：将稻壳水解液冷却至室温，过滤，去除固形物，然后加入乙酸钠直至乙酸钠浓度为4.0-6.0g/L，加入磷酸二氢钾直至磷酸二氢钾浓度为1.0-1.4g/L，加入磷酸氢二钾直至磷酸氢二钾浓度为1.0-1.4g/L，加入硫酸镁直至硫酸镁浓度为0.20-0.40g/L，加入硫酸锰直至硫酸锰浓度为0.01-0.04g/L，加入硫酸铁直至硫酸铁浓度为0.01-0.04g/L，用氨水调节pH值为6.5-7.0，在110-121℃灭菌15-25分钟；
（4）稻壳水解液发酵：将步骤(3)中配制好的培养基转入发酵罐中，培养基的装量为发酵罐体积的55-65%；然后接种预先培养好的菌种种子液，接种量为发酵培养基体积的6%-12%，在35-40℃厌氧发酵72-120小时；
发酵所用菌种为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum DSM 1731）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052），或丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum DSM 1731）和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052）的等体积混合物。
步骤（1）中稻壳晒干或烘干至含水量不超过5%。
步骤（2）中优选按过筛物稻壳粉末质量:稀硫酸体积=1:7的比例向过筛物稻壳粉末中加入质量浓度为10%的稀硫酸。
步骤（3）中发酵培养基的优选配制：
向稻壳水解液中加入乙酸钠直至乙酸钠浓度为5.0g/L，加入磷酸二氢钾直至磷酸二氢钾浓度为1.2g/L，加入磷酸氢二钾直至磷酸氢二钾浓度为1.2g/L，加入硫酸镁直至硫酸镁浓度为0.3g/L，加入硫酸锰直至硫酸锰浓度为0.03g/L，加入硫酸铁直至硫酸铁浓度为0.03g/L,用氨水调节pH值为6.8，在121℃灭菌20分钟。
步骤（4）中预先培养好的菌种种子液的具体制作过程：首先在平板上挑取单个菌落接种到50mL液体RCM培养基[Hirsch,A,Grinsted，E.Methods for thegrowth and enumeration of anaerobic spore-formers from cheese,with observationson the effect of nisin[J].J.Dairy Res.,1954,21:101-110.]中，并在75℃水浴中热激10分钟，然后37℃厌氧培养；当菌体生长至OD600=0.8时，将菌液转接至液体CGM培养基[Wiesenborn,D P，Rudolph,F B,Papoutsakis,E T.Thiolase fromClostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in the synthesis of acids andsolvents[J].Appl.Environ.Microbiol.,1988,54(11):2717-2722.]中37℃厌氧培养；菌液的接种量为培养基体积的1%；当菌体生长至OD600=0.2时，种子液即成。
本发明发酵所用菌种丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum DSM 1731），购自德国微生物菌种保存中心、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052），购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心。
对本发明所得稻壳水解液中的糖类（木糖、葡萄糖和阿拉伯糖）和发酵后的代谢产物（乙酸、丁酸、丙酮、丁醇、乙醇等）使用高效液相色谱(Highperformance Liquid Chromatography,HPLC)分离鉴定，采用外标法进行定量分析。具体方法如下：取出发酵过程中的样品，进行离心取上清液；上清液用MilliporeMillex-GP PES(SLGP033RB)0.22μm针头式过滤器过滤；过滤后的上清液全自动进样，进入Agilent1200 HPLC(Agilent Technologies公司)系统，用0.05mM稀H2SO4作为流动相，流速0.5mL/min，使用Bio-Rad Aminex HPX-87H离子交换柱(7.8×300mm，Bio-Rad公司)，上样量5μL，柱温控制在15℃，在30℃下使用示差折光检测器(Refractive index(RI)detector)进行信号检测。
本发明利用大米加工副产品稻壳生产纤维素丁醇的方法，为丁醇微生物发酵提供一条新的途径，不但可解决我国能源短缺的问题，还可避免因粮食发酵生产丁醇所带来的与人争粮的问题。我国每年稻谷产量约1.8亿吨，其中副产物稻壳近3800万吨，利用本发明，可充分开发和利用这些稻壳资源，在提高稻米加工副产物利用率的同时，减少资源浪费和环境污染。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，而不会限制本发明。
实施例1
本实施例包括以下步骤：
（1）稻壳的收集和预处理：将稻壳收集后，晒干（含水量低于5%），经粉碎机粉碎后，过100目筛，称取过筛稻壳粉末1.0kg；
（2）稻壳的水解：向稻壳粉末中加入7L质量浓度为10%的稀硫酸，混匀后装入带有冷却装置的高压反应釜中，在150℃水解3小时，得稻壳水解液；经检测，稻壳水解液中总糖含量为32.7g/L；
（3）水解液发酵培养基的配制：待步骤(2)中稻壳水解液冷却至室温后，过滤去除固形物，再向水解液中加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为5.0g/L，加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二氢钾含量为1.2g/L，加入磷酸氢二钾直至水解液中磷酸氢二钾含量为1.2g/L，加入硫酸镁直至水解液中硫酸镁含量为0.3g/L，加入硫酸锰直至水解液中硫酸锰含量为0.03g/L，加入硫酸铁直至水解液中硫酸铁含量为0.03g/L，用氨水调节pH值为6.8，在121℃灭菌20分钟，制成发酵培养基；
（4）稻壳水解液发酵：将步骤(3)中配制好的6L培养基转入10L发酵罐中，无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum DSM1731，购自德国微生物菌种保存中心）种子液（种子液的制作过程：首先在平板上挑取Clostridium acetobutylicum DSM 1731（购自德国微生物菌种保存中心）的单菌落接种到50mL液体RCM培养基[Hirsch,A,Grinsted，E.Methods for thegrowth and enumeration of anaerobic spore-formers from cheese,with observationson the effect of nisin[J].J.Dairy Res.,1954,21:101-110.]中，并在75℃水浴中热激10分钟，然后37℃厌氧培养；当菌体生长至OD600=0.8时，将10mL菌液转接至1L液体CGM培养基[Wiesenborn,D P，Rudolph,F B,Papoutsakis,E T.Thiolase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in the synthesis ofacids and solven ts[J].Appl.Environ.Microbiol.,1988,54(11):2717-2722.]中37℃厌氧培养作为种子液；当种子液菌体生长至OD600=0.2时，种子液即成），种子液的接种量为发酵水解液培养基体积的10%，在37℃厌氧发酵120小时，即成。
本实施例所得发酵产物中溶剂（丁醇、乙醇和丙酮）的含量测定：取出发酵过程中的样品，进行离心取上清液；上清液用Millipore Millex-GP PES(SLGP033RB)0.22μm针头式过滤器过滤；过滤后的上清液全自动进样，进入Agilent 1200 HPLC(Agilent Technologies公司)系统，用0.05mM稀H2SO4作为流动相，流速0.5mL/min，使用Bio-Rad Aminex HPX-87H离子交换柱(7.8×300mm，Bio-Rad公司)，上样量5μL，柱温控制在15℃，在30℃使用示差折光检测器(Refractive index(RI)detector)进行信号检测，采用外标法进行定量分析。
发酵结果：经120小时发酵后，产生丁醇4.8g/L，乙醇0.8g/L，丙酮2.3g/L，总溶剂7.9g/L；其中丁醇的比例达到60.8%。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：步骤（4），所用发酵菌种为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心）。
发酵结果：经120小时发酵后，产生丁醇6.3g/L，乙醇1.0g/L，丙酮2.6g/L，总溶剂9.9g/L；其中丁醇的比例达到63.6%。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：步骤（4），所用发酵菌种为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum DSM 1731，购自德国微生物菌种保存中心）和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心）等体积混合物。
发酵结果：经120小时发酵后，产生丁醇8.2g/L，乙醇1.2g/L，丙酮2.9g/L，总溶剂12.3g/L；其中丁醇的比例达到66.7%。
实施例4
本实施例包括以下步骤：
（1）稻壳的收集和预处理：将稻壳收集后，晒干（含水量低于5%），经粉碎机粉碎后，过100目筛，称取过筛稻壳粉末1.0kg；
（2）稻壳的水解：向稻壳粉末中加入5L质量浓度为5%的稀硫酸，混匀后装入带有冷却装置的高压反应釜中，在120℃水解3小时，得稻壳水解液；经检测，稻壳水解液中总糖含量为31.6g/L；
（3）水解液发酵培养基的配制：待步骤(2)中稻壳水解液冷却至室温后，过滤去除固形物，再向水解液中加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为4.0g/L，加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二氢钾含量为1.0g/L，加入磷酸氢二钾直至水解液中磷酸氢二钾含量为1.0g/L，加入硫酸镁直至水解液中硫酸镁含量为0.2g/L，加入硫酸锰直至水解液中硫酸锰含量为0.02g/L，加入硫酸铁直至水解液中硫酸铁含量为0.02g/L，用氨水调节pH值为6.8，在121℃灭菌20分钟，制成发酵培养基；
（4）稻壳水解液发酵：将步骤(3)中配制好的6L培养基转入10L发酵罐中，无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum DSM1731，购自德国微生物菌种保存中心）种子液（种子液的制作过程：首先在平板上挑取Clostridium acetobutylicum DSM 1731（购自德国微生物菌种保存中心）的单菌落接种到50mL液体RCM培养基[Hirsch,A,Grinsted，E.Methods for thegrowth and enumeration of anaerobic spore-formers from cheese,with observationson the effect of nisin[J].J.Dairy Res.,1954,21:101-110.]中，并在75℃水浴中热激10分钟，然后37℃厌氧培养；当菌体生长至OD600=0.8时，将10mL菌液转接至1L液体CGM培养基[Wiesenborn,D P，Rudolph,F B,Papoutsakis,E T.Thiolase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in the synthesis ofacids and solvents[J].Appl.Environ.Microbiol.,1988,54(11):2717-2722.]中37℃厌氧培养作为种子液；当种子液菌体生长至OD600=0.2时，种子液即成），种子液的接种量为发酵水解液培养基体积的10%，在37℃厌氧发酵120小时，即成。
本实施例所得发酵产物中溶剂（丁醇、乙醇和丙酮）的含量测定：取出发酵过程中的样品，进行离心取上清液；上清液用Millipore Millex-GP PES(SLGP033RB)0.22μm针头式过滤器过滤；过滤后的上清液全自动进样，进入Agilent 1200 HPLC(Agilent Technologies公司)系统，用0.05mM稀H2SO4作为流动相，流速0.5mL/min，使用Bio-Rad Aminex HPX-87H离子交换柱(7.8×300mm，Bio-Rad公司)，上样量5μL，柱温控制在15℃，在30℃使用示差折光检测器(Refractive index(RI)detector)进行信号检测，采用外标法进行定量分析。
发酵结果：经120小时发酵后，产生丁醇4.1g/L，乙醇0.8g/L，丙酮2.2g/L，总溶剂7.1g/L；其中丁醇的比例达到57.7%。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于：步骤（4），所用发酵菌种为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心）。
发酵结果：经120小时发酵后，产生丁醇5.8g/L，乙醇1.1g/L，丙酮2.7g/L，总溶剂9.6g/L；其中丁醇的比例达到60.4%。
实施例6
本实施例与实施例4的区别在于：步骤（4），所用发酵菌种为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum DSM 1731，购自德国微生物菌种保存中心）和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心）等体积混合物。
发酵结果：经120小时发酵后，产生丁醇7.5g/L，乙醇1.2g/L，丙酮2.8g/L，总溶剂11.5g/L；其中丁醇的比例达到65.2%。
实施例7
本实施例包括以下步骤：
（1）稻壳的收集和预处理：将稻壳收集后，晒干（含水量低于5%），经粉碎机粉碎后，过100目筛，称取过筛稻壳粉末1.0kg；
（2）稻壳的水解：向稻壳粉末中加入10L质量浓度为15%的稀硫酸，混匀后装入带有冷却装置的高压反应釜中，在180℃水解3小时，得稻壳水解液；经检测，稻壳水解液中总糖含量为31.6g/L；
（3）水解液发酵培养基的配制：待步骤(2)中稻壳水解液冷却至室温后，过滤去除固形物，再向水解液中加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为6.0g/L，加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二氢钾含量为1.2g/L，加入磷酸氢二钾直至水解液中磷酸氢二钾含量为1.2g/L，加入硫酸镁直至水解液中硫酸镁含量为0.4g/L，加入硫酸锰直至水解液中硫酸锰含量为0.04g/L，加入硫酸铁直至水解液中硫酸铁含量为0.04g/L，用氨水调节pH值为6.8，在121℃灭菌20分钟，制成发酵培养基；
（4）稻壳水解液发酵：将步骤(3)中配制好的6L培养基转入10L发酵罐中，无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum DSM1731，购自德国微生物菌种保存中心）种子液（种子液的制作过程：首先在平板上挑取Clostridium acetobutylicum DSM 1731（购自德国微生物菌种保存中心）的单菌落接种到50mL液体RCM培养基[Hirsch,A,Grinsted，E.Methods for thegrowth and enumeration of anaerobic spore-formers from cheese,with observationson the effect of nisin[J].J.Dairy Res.,1954,21:101-110.]中，并在75℃水浴中热激10分钟，然后37℃厌氧培养；当菌体生长至OD600=0.8时，将10mL菌液转接至1L液体CGM培养基[Wiesenborn,D P，Rudolph,F B,Papoutsakis,E T.Thiolase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in the synthesis ofacids and solvents[J].Appl.Environ.Microbiol.,1988,54(11):2717-2722.]中37℃厌氧培养作为种子液；当种子液菌体生长至OD600=0.2时，种子液即成），种子液的接种量为发酵水解液培养基体积的10%，在37℃厌氧发酵120小时，即成。
本实施例所得发酵产物中溶剂（丁醇、乙醇和丙酮）的含量测定：取出发酵过程中的样品，进行离心取上清液；上清液用Millipore Millex-GP PES(SLGP033RB)0.22μm针头式过滤器过滤；过滤后的上清液全自动进样，进入Agilent 1200 HPLC(Agilent Technologies公司)系统，用0.05mM稀H2SO4作为流动相，流速0.5mL/min，使用Bio-Rad Aminex HPX-87H离子交换柱(7.8×300mm，Bio-Rad公司)，上样量5μL，柱温控制在15℃，在30℃使用示差折光检测器(Refractive index(RI)detector)进行信号检测，采用外标法进行定量分析。
发酵结果：经120小时发酵后，产生丁醇4.3g/L，乙醇0.9g/L，丙酮2.1g/L，总溶剂7.3g/L；其中丁醇的比例达到58.9%。
实施例8
本实施例与实施例7的区别在于：步骤（4），所用发酵菌种为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心）。
发酵结果：经120小时发酵后，产生丁醇6.2g/L，乙醇1.1g/L，丙酮2.9g/L，总溶剂10.2g/L；其中丁醇的比例达到60.7%。
实施例9
本实施例与实施例7的区别在于：步骤（4），所用发酵菌种为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum DSM 1731，购自德国微生物菌种保存中心）和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052，购自英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心）等体积混合物。
发酵结果：经120小时发酵后，产生丁醇7.8g/L，乙醇1.3g/L，丙酮2.9g/L，总溶剂12.0g/L；其中丁醇的比例达到65.0%。
Claims (5)
1.一种稻壳生产生物丁醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）稻壳收集和预处理：将稻壳收集后，晒干或烘干，经粉碎机粉碎后，过100目筛，得过筛物稻壳粉末；
（2）稻壳水解：按过筛物稻壳粉末质量:稀硫酸体积=1:5-10的比例向过筛物稻壳粉末中加入质量浓度为1-15%的稀硫酸，100-180℃水解1-5小时，得稻壳水解液，控制稻壳水解液中总糖浓度为30-40g/L；
（3）稻壳水解液发酵培养基的配制：将稻壳水解液冷却至室温，过滤，去除固形物，然后加入乙酸钠直至乙酸钠浓度为4.0-6.0g/L，加入磷酸二氢钾直至磷酸二氢钾浓度为1.0-1.4g/L，加入磷酸氢二钾直至磷酸氢二钾浓度为1.0-1.4g/L，加入硫酸镁直至硫酸镁浓度为0.20-0.40g/L，加入硫酸锰直至硫酸锰浓度为0.01-0.04g/L，加入硫酸铁直至硫酸铁浓度为0.01-0.04g/L，用氨水调节pH值为6.5-7.0，在110-121℃灭菌15-25分钟；
（4）稻壳水解液发酵：将步骤(3)中配制好的培养基转入发酵罐中，培养基的装量为发酵罐体积的55-65%；然后接种预先培养好的菌种种子液，接种量为发酵培养基体积的6%-12%，在35-40℃厌氧发酵72-120小时；
发酵所用菌种为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum DSM 1731）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052），或丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum DSM 1731）和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052）的等体积混合物。
2.根据权利要求1所述的稻壳生产生物丁醇的方法，其特征在于：步骤（1）中稻壳晒干或烘干至含水量不超过5%。
3.根据权利要求1所述的稻壳生产生物丁醇的方法，其特征在于：步骤（2）中按过筛物稻壳粉末质量:稀硫酸体积=1:7的比例向过筛物稻壳粉末中加入质量浓度为10%的稀硫酸。
4.根据权利要求1所述的稻壳生产生物丁醇的方法，其特征在于：步骤（3）所述发酵培养基的配制：
向稻壳水解液中加入乙酸钠直至乙酸钠浓度为5.0g/L，加入磷酸二氢钾直至磷酸二氢钾浓度为1.2g/L，加入磷酸氢二钾直至磷酸氢二钾浓度为1.2g/L，加入硫酸镁直至硫酸镁浓度为0.3g/L，加入硫酸锰直至硫酸锰浓度为0.03g/L，加入硫酸铁直至硫酸铁浓度为0.03g/L,用氨水调节pH值为6.8，在121℃灭菌20分钟。
5.根据权利要求1所述的稻壳生产生物丁醇的方法，其特征在于：步骤（4）中预先培养好的菌种种子液的具体制作过程：首先在平板上挑取单个菌落接种到50mL液体RCM培养基中，并在75℃水浴中热激10分钟，然后37℃厌氧培养；当菌体生长至OD600=0.8时，将菌液转接至液体CGM培养基中37℃厌氧培养；菌液的接种量为培养基体积的1%；当菌体生长至OD600=0.2时，种子液即成。
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2012
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