CN102399734B - 一株嗜热厌氧菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株嗜热厌氧菌株Thermoanaerobacterium sp.Rx1，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M 2011109，本发明提供了该菌株的形态学及其生理生化特征，根据形态学、生理生化、G+C%含量和DNA-DNA杂交结果分析，Thermoanaerobacterium sp.Rx1是Thermoanaerobacterium属的一株新种，该菌株可以直接利用木聚糖、淀粉、果胶等多糖，以及葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、阿拉伯糖等来源于木质纤维素生物质的糖类及其甘露醇等醇类物质，同时将其转化为乙醇。其中，Rx1以40g/l的木聚糖为碳源进行发酵时，发酵液中乙醇产率最高，为66.61mM。

Description

一株嗜热厌氧菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种嗜热厌氧菌株及其应用，属于应用微生物领域。
背景技术
木质纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，包括纤维素、半纤维素和木质素。一般木材中，纤维素占 40～50％，半纤维素占 10～30％，木质素占20～30％。 目前，这些可再生的木质纤维素绝大部分尚未得到有效的利用，而且因焚烧，丢弃等不合理的处理造成了严重的环境污染。以木质纤维素生产乙醇在可持续发展战略中拥有相当大的优势，即可以减少环境的污染和CO2的排放量，又可以降低生产成本。与目前巴西，美国等普遍采用的以玉米等粮食作物为主的乙醇生产相比，以木质纤维素生产乙醇还具有“不与人争粮、不与粮争地”的优点。
木质纤维素乙醇实现工业化生产的最大障碍是其生产成本高，而使成本过高的原因除预处理成本过高之外，还有以下三个主要原因：（1）纤维素酶成本过高。与粮食乙醇相比，木质纤维素生产乙醇中纤维素酶的成本占到了30%-50%，而粮食生产乙醇中的淀粉酶成本只有8%；（2）缺乏能够高效利用戊糖（C5糖）的发酵菌株。同纤维素相比，半纤维素更容易被水解，而其含量仅次于纤维素。而半纤维素水解产生的木糖、阿拉伯糖等戊糖不仅不能被传统的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)所利用，而且抑制它们的生长，从而降低了原料的乙醇转化率。因此，选育高效利用戊糖生产乙醇的发酵菌株也是实现木质纤维素乙醇产业化的技术关键。（3）到目前为止，所有用于工业生产乙醇的代谢工程菌仅限于革兰氏阳性，中温专性厌氧菌，而利用中温厌氧菌发酵生产乙醇，发酵属于放热过程，造成发酵体系温度升高，影响细胞本身正常生理活动。因此，为了保持发酵菌的活性，需要给发酵罐配备冷却装置。同时，乙醇蒸馏回收需要在高温条件下，又需要加热，这些都增加了乙醇的成本。若在高温下进行发酵，就可以节约冷却和加热的成本。同时，高温能有效的抑制杂菌生长，提高乙醇得率。因此，开发能够利用纤维素、半纤维素，以及纤维素、半纤维素的水解产物，在高温下发酵生产乙醇的菌株势在必行。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供了一株嗜热厌氧菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1，该菌株已于2011年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2011109。
本发明另一目的是将嗜热厌氧菌株应用在发酵生产乙醇中。
本发明中所述发酵生产乙醇是利用葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、木聚糖、淀粉、果胶中一种或几种任意混合发酵生产乙醇。
本发明中所述发酵生产乙醇是利用半纤维素发酵生产乙醇。
本发明提供的菌株能与Clostridium thermocellum菌进行共培养，利用木质纤维素发酵生产乙醇。
本发明另一目的是将嗜热厌氧菌株应用在利用木质纤维素发酵生产氢气方面。
本发明另一目的是将嗜热厌氧菌株应用在对其进行一个或复数个基因的改造或外源基因的导入获得突变株中。
本发明中所述的嗜热厌氧菌株Thermoanaerobacterium sp. Rx1主具有以下微生物学特征：
本菌株分离及培养的基础培养基采用改良的M640培养基（DSMZ），命名为MM640，培养基组分如下：NH4Cl 0.9g，MgCl2·6H2O 0.4g，KH2PO4 0.75g，K2HPO4 1.5g，蛋白胨2g，酵母膏1g，FeCl3·6H2O 2.5mg，木糖10g，半胱氨酸盐酸盐0.75g，刃天青0.5mg，微量元素溶液-SL-10 1ml，维生素溶液5ml (培养基灭菌后用0.22水系膜过滤加入)，各组分溶解后定容至1000ml，培养基加热从蓝色变为无色后，采用铜柱除氧系统除氧，分装到充满氮气的亨特试管中，每管装5ml，121℃灭菌后备用。
微量元素溶液-SL-10组分为：HCl (25%; 7.7 M) 10ml，FeCl2·4H2O 1.5 g，ZnCl2 70mg，MnCl2·4H2O 100mg，H3BO3 6.0 mg，CoCl2·6H2O 190mg，CuCl2·2H2O 2mg，NiCl2·6H2O 24mg，Na2MoO4·2H2O 36mg，首先将FeCl2溶解到HCl中，然后加入蒸馏水，再溶解其它盐，定容至1000ml，备用。
维生素溶液：维生素H 2mg，叶酸 2mg，盐酸吡哆辛10mg，盐酸硫胺5mg，核黄素5mg，烟酸5mg，D-泛酸钙 5mg， 维生素B12 0.1mg，对氨基苯甲酸5mg，硫辛酸 5mg，溶解后定容至1000ml，-20℃保存备用。
除温度、pH实验之外的其它实验均在55℃，pH值7.0的条件下培养，接种量均为2%，所有实验都设3组平行实验。本发明中除特殊说明外，鉴定菌株特性的培养基采用MM640培养基(碳源为木糖)。
1、形态学特征
本发明菌株Rx1是从云南省保山市温泉泥水样中分离筛选得到的，MM640培养基培养，菌体为白色。相差显微镜观察，细胞为杆状，运动，在指数生长期后期，稳定期前期有芽孢形成。（见图1）
2、生理学特征
菌株Rx1为革兰氏阳性专性厌氧菌，生长温度范围为38℃～68℃，最适生长温度为50～55℃；生长的pH范围为4.5～8.0，最适pH=7，氯化钠的耐受浓度为3%；硫代硫酸钠被还原成硫储存在细胞内，同时体外也有硫的存在（见图2），且胞外存在的硫与培养基中的氯化亚铁反应能生成黑色沉淀硫化亚铁（见图3）。硫酸盐，亚硫酸盐几乎不影响Rx1的生长，还原产物都为硫化氢，而在硫存在的条件下，Rx1几乎不生长，但也检测到硫化氢的产生。
本发明中Thermoanaerobacterium sp. Rx1的碳源利用情况如下（见表1）：
表1：本发明菌株的碳源利用结果
葡萄糖 + 半乳糖 + 阿拉伯糖 + 丙酮酸 - 海藻酸钠 -
木糖 + 甘露糖 + 木聚糖 + 果胶 + 纤维素 -
果糖 + 乳糖 + 纤维二糖 + 甘油 -    
甘露醇 + 蔗糖 - 淀粉 + 乙醇 -    
木糖醇 - 麦芽糖 + 山梨醇 - 柠檬酸 -    
注：表中“+”表示可以利用，“-”表示不可以利用。
本发明提供的Thermoanaerobacterium sp. Rx1在含有1.0%的葡萄糖和木糖培养基中生长最好。
本发明提供的Thermoanaerobacterium sp. Rx1可以直接利用木聚糖、淀粉、果胶等多糖，以及葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、阿拉伯糖等来源于木质纤维素生物质的糖类及其甘露醇等醇类物质，同时将其转化为乙醇。其中，Rx1以40g/l的木聚糖为碳源进行发酵时，发酵液中乙醇产率最高，为66.61mM。
本发明提供的Thermoanaerobacterium sp. Rx1与Thermoanaerobacterium属相似度最高菌株的表型特征比较结果（见表2），从表中的表型特征可以看出，Thermoanaerobacteriumsp. Rx1是Thermoanaerobacterium属的一株新菌。
表2：Thermoanaerobacteriumsp. Rx1与Thermoanaerobacterium属最相似菌的特征比较
Figure 201110422904X100002DEST_PATH_IMAGE001
注：表中“+”可利用或可产生相应产物；“-”不能利用或不能产生相应产物；ND，没有数据显示。
本发明提供的Thermoanaerobacteriumsp. Rx1菌株具有如下优点是:
(1)      本发明提供的Thermoanaerobacteriumsp. Rx1菌株，可以利用木质纤维素水解溶液中
的源于纤维素的纤维二糖、葡萄糖，还可以利用源于半纤维素的木糖、阿拉伯糖等戊糖，这有效提高了木质纤维素的乙醇转化率，是一株极具木质纤维素乙醇工业发酵潜力的菌株。
(2)      本发明提供的Thermoanaerobacteriumsp. Rx1菌株，可以直接利用木质纤维素的多聚
糖成分半纤维素，不需将其水解成可溶性成分，这减少了木质纤维素乙醇生产过程中酶的生产，大幅度降低了木质纤维素乙醇生产的成本。
(3)      本发明提供的Thermoanaerobacterium sp. Rx1菌株，可以在55℃下发酵，无需给发
酵罐配备冷却装置。同时，乙醇蒸馏回收不需要加热，就可以节约冷却和加热的成本。同时高温能有效的抑制杂菌生长，提高乙醇得率。
附图说明
图1 是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1在相差显微镜下的形态示意图。
图2 是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1培养在含有10g/l木糖和10g/l的硫代硫酸钠的MM640培养基中，通过相差显微镜观察细胞内积累的硫及其细胞外存在的硫的结果示意图。
图3是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1培养在含有10g/l木糖和10g/l的硫代硫酸钠的
MM640培养基中的情况示意图，对照一试管未接菌体，对照二试管未添加硫代硫酸钠，试管3中细胞外存在的硫与培养基中的氯化亚铁反应生成黑色沉淀硫化亚铁（从左至右）。 
图4 是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1在添加不同浓度木糖培养基中的生长曲线示意图。
图5 是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1在添加不同浓度葡萄糖培养基中的生长曲线示意图。
图6是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1发酵不同浓度葡萄糖，并采用高效液相色谱分析乙醇产量及其它代谢产物的分析示意图。
图7是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1发酵不同浓度木糖，并采用高效液相色谱分析乙醇产量及其它代谢产物的分析示意图。
图8 是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1发酵不同浓度甘露醇，并采用高效液相色谱分析乙醇产量及其它代谢产物的分析示意图。
图9是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1发酵不同浓度纤维二糖，并采用高效液
相色谱分析乙醇产量及其它代谢产物的分析示意图。
图10 是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1发酵不同浓度淀粉，并采用高效液相色
谱分析乙醇产量及其它代谢产物的分析示意图。
图 11是本发明菌株Thermoanaerobacteriumsp. Rx1发酵不同浓度木聚糖，并采用高效液相
色谱分析乙醇产量及其它代谢产物的分析示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明进一步的详细说明，但是本发明的保护范围并不仅限于所述内容，实施例中如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：嗜热厌氧菌株Rx1的筛选分离
将从云南省保山市温泉泥水中采集的温泉泥水样按1:10稀释（w/v），接种到装有50ml MM640培养基的250ml厌氧试剂瓶中（碳源为10g/l的木聚糖），60℃培养，培养两天后转接到新鲜的MM640试管培养基中，培养到OD=0.6～0.8，转接到新鲜的试管培养基中，反复接三次(接种量为2%)。将培养物梯度稀释，采用亨特滚管(培养基为MM640，碳源为10g/l的木糖，加1.2%植物凝胶)分离，挑选单菌落接种于碳源为木聚糖的MM640培养基中。筛选出能利用木聚糖的菌株，编号为Rx1，16S rRNA的基因序列在GenBank中的登录号为AB544080。通过分子系统发育学分析，命名为Thermoanaerobacteriumsp. Rx1，送“中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)保存，保藏号为CCTCC NO：M 2011109。
实施例2：不同浓度木糖和葡萄糖对Rx1生长的影响
将新鲜培养的Rx1转接到分别含有0.5%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%木糖和分别含有0.5%，1.0%，2.0%，3.0%，4.0%葡萄糖的MM640培养基中，55℃培养，测定600nm处吸光度值，结果见图4和图5，由图可知，菌株在含1.0%的葡萄糖和木糖培养基中生长的最好，随着葡萄糖浓度的增长，几乎对菌株的生长没有影响，但在木糖培养基中，3.0%，4.0%的浓度明显抑制菌株的生长。
实施例3： 菌株Rx1发酵不同浓度木糖和葡萄糖生产乙醇
新鲜培养的Rx1转接到分别含有5g/l，10 g/l，20 g/l，30 g/l，40 g/l葡萄糖和木糖的MM640培养基中，55℃培养发酵48h后取发酵液，4℃，5000rpm离心10 min，取上清液，过滤器过滤加入进样瓶，高效液相色谱（HPLC）分析发酵产物，HPLC分析条件如下：
流动相：0.5mM H2SO4，流速：0.5 ml/min，色谱柱：Aminex HPX-87H Column，(300×7.8mm)，柱温：55℃，检测器：时差检测器，进样量：20μl。
结果见图6和图7，由图可知，Rx1在不同浓度的葡萄糖(注：葡萄糖为一水葡萄糖，计算理论产值和葡萄糖的利用量时将其转换成无水葡萄糖经行计算)和木糖的培养基中都有乙醇、乳酸和乙酸的产生。在含有10g/l的葡萄糖或木糖培养基中乙醇的产量最高，分别为33.18mM和56.55mM，分别是理论产值的54.38%和62.29%，葡萄糖和木糖都没有利用完。而在含5g/l的葡萄糖和木糖的培养基中，乙醇产量为29.32mM和45.05mM，分别是理论产值的58.26%和81.39%，葡萄糖和木糖被全部利用完。与葡萄糖底物发酵相比，以木糖为底物发酵生产乙醇，副产物乳酸和乙酸较少。
实施例4：菌株Rx1发酵不同浓度甘露醇生产乙醇
新鲜培养的Rx1转接到分别含有5 g/l，10 g/l，20 g/l，30 g/l，40 g/l甘露醇的MM640培养基中，55℃培养发酵48h，代谢产物分析方法同实施例4。结果见图8，Rx1在含不同浓度甘露醇底物中发酵，有乙醇和乳酸的产生，与其它底物发酵相比，在甘露醇中没有乙酸的产生，且在10g/l的甘露醇中乙醇产量最高，为55.89mM。
实施例5：菌株Rx1发酵不同浓度纤维二糖生产乙醇
将新鲜培养的菌种Rx1转接到分别含有5 g/l，10 g/l，20 g/l，30 g/l，40 g/l，50g/l纤维二糖的MM640培养基中，55℃培养发酵48h，代谢产物分析方法同实施例4。结果见图9，由图可以看出Rx1在不同浓度纤维二糖底物中有乙醇、乳酸和乙酸的产生，在40g/l的纤维二糖中乙醇产量最高，为28.48mM。从5-50g/l的底物浓度对乙醇及其副产物乳酸和乙酸几乎没有影响。
实施例6：菌株Rx1发酵不同浓度淀粉生产乙醇
将新鲜培养的菌种Rx1转接到分别含有5 g/l，10 g/l，20 g/l，30 g/l，40 g/l淀粉的MM640培养基中，55℃培养发酵48h，代谢产物分析方法同实施例4。结果见图10，由图可以看出Rx1在不同浓度淀粉底物中有乙醇、乳酸和乙酸的产生，在30g/l的纤维二糖中乙醇产量最高，为40.6mM。
实施例7：菌株Rx1发酵不同浓度木聚糖生产乙醇
新鲜培养的Rx1转接到分别含有5 g/l，10 g/l，20 g/l，30 g/l，40 g/l，50g/l木聚糖的MM640培养基中，55℃培养发酵48h，代谢产物分析方法同实施例4，结果见图11，从图可以看出，Rx1在不同浓度的木聚糖中都有乙醇、乳酸、乙酸的产生。在40g/l的木聚糖中乙醇的产量最高，高达66.61mM。木聚糖浓度从5g/l到40g/l逐渐升高时，乙醇的产量也随着升高，50g/l木聚糖浓度开始抑制菌株的生长，乙醇产量也降低。

Claims (4)

1.一株嗜热厌氧菌株（Thermoanaerobacteriumsp.） Rx1，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC NO：M 2011109。
2.权利要求1所述的嗜热厌氧菌株在发酵生产乙醇中的应用。
3.根据权利要求2所述的嗜热厌氧菌株在发酵生产乙醇中的应用，其特征在于：利用葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、木聚糖、淀粉、果胶、纤维二糖中一种或几种发酵生产乙醇。
4.根据权利要求2所述的嗜热厌氧菌株在发酵生产乙醇中的应用，其特征在于：利用木质纤维素发酵生产乙醇。
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