CN102839128B - 一种用于脱色糖蜜酒精废水的微生物及脱色方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于脱色糖蜜酒精废水的微生物为黄曲霉(Aspergillus flavus)，该菌已于2010年11月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。其筛选和分离是以模拟糖蜜酒精废水色素类黑精为底物，采用稀释涂布平板法从自然环境中筛选获得能够脱色类黑精的微生物，将有明显脱色圈的菌株转接入未处理的实际糖蜜酒精废水培养基中进行复筛，将获得的具有脱色能力的菌株转接培养基培养，洗脱孢子制备孢子悬液。糖蜜酒精废水稀释至A475≈3.5左右，外加营养源，将孢子悬液接入糖蜜酒精废水液体培养基中进行脱色反应，反应结束后，抽滤分离菌体，通过测试475nm处吸光度的变化计算脱色率。
Description
技术领域
本发明属于废水生物处理领域，具体地涉及一种用于脱色糖蜜酒精废水的微生物。
本发明还涉及筛选分离上述微生物的方法。
本发明还涉及利用上述微生物进行糖蜜酒精废水生物脱色的方法。
背景技术
糖蜜废水发酵生产酒精，一直是制糖产业提高行业效益、解决糖蜜排放的重要途径之一，也可适应石油能源逐渐枯竭而带来的未来能源多样化的需求，但糖蜜酒精废水的高色素值是此工业发展面临的“瓶颈”问题之一，处理难度在于成分较为复杂、部分色素不易被微生物降解及对pH敏感、长时间放置色值不减等特点。糖蜜酒精废水中的色素主要有类黑精色素、焦糖色素和酚类色素三大类，酚类色素是甘蔗自身产生的一类植物色素，焦糖色素是由糖热解产生，类黑精色素是糖和氨基酸发生美拉德反应形成的一类褐色聚合物，其中类黑精色素最难以降解，焦糖色素和酚类色素都具有可再生和利用价值。传统的物化法试剂成本高，并有二次污染，而以微生物代谢为手段、污染物消减为目的的环境生物技术具有条件温和、环境友好等优点，是一种经济效益和环境效益俱佳的方法。
脱色菌种选育是生物脱色技术的关键之一，目前对于糖蜜酒精废水的生物脱色研究国内外都有一些报道。如细菌方面，报道的有荧光假单胞菌、植物乳杆菌、希式乳杆菌等，其中希式乳杆菌对模拟糖蜜酒精废水的脱色率最高达到40％；真菌方面，报道的有云芝菌、黄孢原毛平革菌、黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、链霉菌等。Pant等使用一株黄曲霉对厌氧处理后的糖蜜酒精废水进行脱色，28天的脱色率达到74.67％，从此菌体中提取的降解酶液对未稀释的厌氧处理的糖蜜酒精废水的脱色率可达29.44％。Murata等报道了一株链霉菌TT14最佳培养条件下对类黑精脱色率为64％。国内在糖蜜酒精废水生物脱色方面的研究刚刚起步，目前研究菌种仅限于云芝菌，如冉艳红等报道了一株云芝菌，摇瓶培养条件下对20％的糖蜜酒精废液的脱色率为50％。
另一方面，不同废水种类和来源、不同生产季节、不同的废水预处理方式都可能影响脱色降解效率和色值测定。这也是对目前糖蜜酒精废水脱色率的文献报道值很难进行比较的原因之一。如Kumar等研究发现云芝和黄孢原毛平革菌在最佳条件下对浓度为6.25％的经厌氧反应器处理过的糖蜜酒精废水的10天脱色率分别为71.5％和53.5％，对浓度为25.0％的糖蜜酒精废水的脱色率分别为19.5％和16.5％；Ohmomo等报道的嗜热菌烟曲霉G-2-6在对糖蜜废水进行连续脱色过程中发现对经透析处理的糖蜜酒精废水的脱色率达到70％，但对未透析处理的废水脱色率只有40％；Sirianuntapiboon等报道的产乙酸菌No.BP103对未处理糖蜜酒精废水原液和厌氧处理过的糖蜜酒精废水的脱色率差别很大，分别为32.3±3.2％和73.5±3.5％；同样东方伊萨酵母对经厌氧处理后的糖蜜废水7天脱色率达到90％，但对未处理的糖蜜废水脱色率则只有50-60％。在这些报道中，起始的废水色值也不尽相同。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于脱色糖蜜酒精废水的微生物。
本发明的又一目的在于提供一种筛选和分离上述微生物的方法。
本发明的再一目的在于提供一种利用上述微生物进行糖蜜酒精废水脱色的方法。
为实现上述目的，本发明提供的可用于脱色糖蜜酒精废水的微生物为黄曲霉(Aspergillus flavus)，该菌已于2010年11月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.4292。
本发明提供的筛选和分离上述微生物的方法，以模拟糖蜜酒精废水色素类黑精为底物，采用稀释涂布平板法从自然环境中筛选获得能够脱色类黑精的微生物，将有明显脱色圈的菌株转接入未处理的实际糖蜜酒精废水培养基中进行复筛，将获得的具有脱色能力的菌株转接培养基培养，洗脱孢子制备孢子悬液。
所述筛选和分离的方法，其中，糖蜜酒精废水培养基是在糖蜜酒精废水中加入：葡萄糖5～25g/L，蛋白胨或NaNO3 1.0～5.0g/L，KH2PO40.5～1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.05～0.5g/L，琼脂15～20g/L；培养温度为25～50℃，pH 4.5～9.0，转速100～400rpm。
所述筛选和分离的方法，其中，糖蜜酒精废水稀释至A475≈3.5。
所述筛选和分离的方法，其中，培养菌株的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度为25-28℃。
所述的筛选和分离的方法，其中，洗脱孢子是以0.5％的Tween80溶液。
本发明提供的利用上述微生物进行糖蜜酒精废水生物脱色的方法，主要步骤为：
糖蜜酒精废水稀释至A475≈3.5左右，外加营养源，将孢子悬液接入糖蜜酒精废水液体培养基中进行脱色反应，反应结束后，抽滤分离菌体，通过测试475nm处吸光度的变化计算脱色率。
所述的脱色方法，其中，营养源为：葡萄糖、果糖、蔗糖或淀粉5～25g/L，蛋白胨或NaNO3 1.0～5.0g/L，KH2PO4 0.5～1.5g/L，MgSO4·7H2O0.05～0.5g/L。
所述的脱色方法，其中，糖蜜酒精废水培养基中孢子悬液接种量为102～107个/mL。
所述的脱色方法，其中，脱色条件为：2～7天，20～60℃，pH＝3.0～9.0，转速50～350rpm。
本发明与现有技术相比，具有节约成本，减少二次污染等优点。与现有的生物脱色方法相比，提供了一种可高效脱色未处理糖蜜酒精废水的菌种。该菌种4天培养对未处理的实际糖蜜酒精废水的最高脱色率可达65％左右，高于目前报道的大多数细菌。与文献报道的真菌菌株相比，所筛选到的黄曲霉培养时间较短，真菌达到较高脱色率都需要较长的培养时间，在实际应用中会受到限制，而且真菌用于经厌氧或好氧处理后的糖蜜酒精废水的脱色效率较高，对实际糖蜜酒精废水原液的脱色率不高。因此本专利提供的菌种和脱色工艺具有良好的生物脱色效率，可为实际工业废水处理提供一种优良的菌种和脱色方法。
具体实施方式
1、本发明以模拟糖蜜酒精废水色素类黑精为底物，采用稀释涂布平板法从自然环境中筛选获得能够脱色类黑精的微生物，将有明显脱色圈的菌株转接入未处理的实际糖蜜酒精废水培养基中进行复筛，将具有较好脱色能力的菌株进行保藏和鉴定。
2、接种物制备：取出保藏菌种转接试管斜面培养基，培养3～5天后，以0.5％的Tween80溶液洗脱孢子制备孢子悬液，血球计数板计数后备用。
3、菌株对糖蜜酒精废水脱色：糖蜜酒精废水稀释至A475≈3.5左右，外加适量营养源，按102～107个/mL的接种量将孢子悬液接入糖蜜酒精废水液体培养基中进行脱色反应，反应温度为20～60℃，pH为3.0～9.0，摇床转速为50～350rpm，振荡培养2～7天，反应结束后，抽滤分离菌体，通过可见分光光度计测试475nm处吸光度的变化来计算脱色率。
4、在本发明的方法中，所用的糖蜜酒精废水为未经任何处理的粗馏塔底排出的实际糖蜜酒精废水，所用的菌种为黄曲霉，该菌已于2010年11月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.4292。
本发明所用菌种为黄曲霉，所用糖蜜酒精废水为未经任何净化处理的糖蜜酒精废水原液，未优化条件下39℃培养4天对未处理的实际糖蜜酒精废水脱色率可达50％以上，经优化后对未处理实际糖蜜酒精废水的最高脱色率可达到65％左右，高于目前的文献报道值。
以下举若干实施例作详细说明。
实施例1
(1)挑取少许保藏的黄曲霉(Aspergillus flavus)菌株接种到PDA试管斜面培养基中，培养基为葡萄糖15g/L，NaNO3 3.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，琼脂15g/L，pH 4.5～9.0，转速100～400rpm，生化培养箱中28℃培养5天。用0.5％Tween80溶液冲洗孢子，倒入装有玻璃珠的摇瓶，振荡分散孢子，过滤得孢子悬液，血球计数板测定孢子悬液浓度。培养基是在糖蜜酒精废水中加入：
(2)250mL锥形瓶中装液60mL糖蜜酒精废水液体培养基，培养基为将糖蜜酒精废水稀释至A475≈3.5，外加葡萄糖25g/L，NaNO3 2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH调至5.0，孢子接种量为104个/mL，39℃，150rpm振荡培养4天，取出摇瓶，抽滤分离菌体，取1mL滤液用乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1M，pH5.0)10倍稀释，可见分光光度计测脱色前后475nm处吸光度的变化。菌体放入烘箱105℃烘干过夜，电子分析天平称重。脱色率为50.91％，细胞干重为10.7900g/L。
实施例2
(1)菌种种子液培养及接种物制备同实施例1步骤(1)。
(2)250mL锥形瓶中装液60mL糖蜜酒精废水液体培养基，培养基为将糖蜜酒精废水稀释至A475≈3.5，外加淀粉25g/L，NaNO3 2.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH调至5.0，孢子接种量为105个/mL，39℃，150rpm振荡培养4天，取出摇瓶，抽滤分离菌体，取1mL滤液用乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1M，pH5.0)10倍稀释，可见分光光度计测脱色前后475nm处吸光度的变化。菌体放入烘箱105℃烘干过夜，电子分析天平称重。脱色率为58.09％，细胞干重为12.8067g/L。
实施例3
(1)菌种种子液培养及接种物制备同实施例1步骤(1)。
(2)250mL锥形瓶中装液60mL糖蜜酒精废水液体培养基，培养基为将糖蜜酒精废水稀释至A475≈3.5，外加淀粉30g/L，蛋白胨3.0g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH调至5.0，孢子接种量为105个/mL，39℃，150rpm振荡培养4天，取出摇瓶，抽滤分离菌体，取1mL滤液用乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1M，pH5.0)10倍稀释，可见分光光度计测脱色前后475nm处吸光度的变化。菌体放入烘箱105℃烘干过夜，电子分析天平称重。脱色率为62.67％，细胞干重为13.4083g/L。
实施例4
(1)菌种种子液培养及接种物制备同实施例1步骤(1)。
(2)250mL锥形瓶中装液60mL糖蜜酒精废水液体培养基，培养基为将糖蜜酒精废水稀释至A475≈3.5，外加淀粉25g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH调至5.0，孢子接种量为103个/mL，30℃，150rpm振荡培养4天，取出摇瓶，抽滤分离菌体，取1mL滤液用乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1M，pH5.0)10倍稀释，可见分光光度计测脱色前后475nm处吸光度的变化。菌体放入烘箱105℃烘干过夜，电子分析天平称重。脱色率为48.95％，细胞干重为10.1167g/L。
实施例5
(1)菌种种子液培养及接种物制备同实施例1步骤(1)。
(2)250mL锥形瓶中装液60mL糖蜜酒精废水液体培养基，培养基为将糖蜜酒精废水稀释至A475≈3.5，外加淀粉30g/L，NH4NO3 2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH调至6.0，孢子接种量为104个/mL，39℃，120rpm振荡培养5天，取出摇瓶，抽滤分离菌体，取1mL滤液用乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1M，pH5.0)10倍稀释，可见分光光度计测脱色前后475nm处吸光度的变化。菌体放入烘箱105℃烘干过夜，电子分析天平称重。脱色率为60.36％，细胞干重为11.7617g/L。
实施例6
(1)菌种种子液培养及接种物制备同实施例1步骤(1)。
(2)250mL锥形瓶中装液60mL糖蜜酒精废水液体培养基，培养基为将糖蜜酒精废水稀释至A475≈3.5，外加蔗糖30g/L，蛋白胨2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH调至5.0，孢子接种量为104个/mL，39℃，150rpm振荡培养4天，取出摇瓶，抽滤分离菌体，取1mL滤液用乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1M，pH5.0)10倍稀释，可见分光光度计测脱色前后475nm处吸光度的变化。菌体放入烘箱105℃烘干过夜，电子分析天平称重。脱色率为65.35％，细胞干重为14.2100g/L。
Claims (5)
1.一种用于脱色糖蜜酒精废水的黄曲霉(Aspergillus flavus)，于2010年11月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.4292。
2.一种利用权利要求1所述的黄曲霉进行糖蜜酒精废水生物脱色的方法：
糖蜜酒精废水稀释至A475＝3.5，外加营养源，将孢子悬液接入糖蜜酒精废水液体培养基中进行脱色反应，反应结束后，抽滤分离菌体，通过测试475nm处吸光度的变化计算脱色率。
3.根据权利要求2所述的脱色方法，其中，营养源为：葡萄糖、果糖、蔗糖或淀粉5～25g/L，蛋白胨或NaNO31.0～5.0g/L，KH2PO40.5～1.5g/L，MgSO4·7H2O0.05～0.5g/L。
4.根据权利要求2所述的脱色方法，其中，糖蜜酒精废水培养基中孢子悬液接种量为102～107个/mL。
5.根据权利要求2所述的脱色方法，其中，脱色条件为：2～7天，20～60℃，pH为3.0～9.0，转速50～350rpm。
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