CN103045504B - 微生物催化制备(2s, 3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯及菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株能够催化羰基不对称还原的新菌株——唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 ZJB-12126，及其在微生物转化外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯制备(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M2012379，保藏日期2012年9月25日。本发明菌株用于生物转化合成(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，反应条件温和，环境友好，更重要的是，产物构型主要为(2S, 3R)-构型，省去了再用化学法翻转产物构型的步骤，因而操作流程简单，具有良好的工业应用前景。
Description
（一）技术领域
本发明涉及唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）ZJB-12126，及其在微生物转化外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯制备式（I）（2S，3R）-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用。
（二）背景技术
4-乙酰氧基氮杂环丁酮（简称为4AA），是一种重要的手性合成子，是合成碳青霉烯和青霉烯类新型广谱抗生素的重要中间体，如用于合成亚胺培南、法罗培南、美罗培南等。
4AA的化学结构式如式（I）所示。4AA的分子骨架特征是一个四元内酰胺环，共含有3个手性中心，存在8种立体异构体，如何高选择性地建立手性中心，是合成4AA的关键所在。日本Noyori和Takasago公司采用以乙酰乙酸乙酯为起始原料的路线，各步的收率和立体选择性都很好，总收率高达50%，是一条非常具有工业化前景的路线，该工艺路线如式（1）所示，其中R是含有1-6个碳原子的饱和低级烷基。在该路线中，乙酰乙酸乙酯首先与卤化后N-羟甲基苯甲酰胺反应，生成2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯（式II），然后利用手性催化剂(R)-BINAP-Ru经过羰基不对称还原反应，生成(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯（式III），再经过脱保护基、分子内成酰胺键、叔丁基二甲硅基保护、三氯化钌催化下的乙酰氧基化得到4AA。
式（1）
在上述路线中，最关键的步骤是手性催化剂(R)-BINAP-Ru不对称催化2-苯甲酰氨甲基-3羰基丁酸酯（式II）生成(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯（式III），但由于该过程需要使用到贵重金属钌作为催化剂，并且需要在高温高压条件下进行，对反应器要求较高，因此造成该路线生产成本较高，限制了4AA大规模工业化生产。
近年来，利用生物催化进行不对称反应的方法，以其高度的化学、区域和立体选择性，受到了越来越广泛的关注。采用的生物催化剂既可以是提纯的酶，也可以是微生物细胞。由于生物催化还原反应需要价格昂贵的辅酶参与，因此，通常采用具备辅酶再生系统的微生物全细胞作为催化剂。
Peter Schneider等（美国专利，US 4927507）曾报道一种利用面包酵母还原2-苯甲酰氨甲基-3羰基丁酸酯的方法，得到产物的构型为(2S, 3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯和(2R, 3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯。赵志全等（中国专利，CN 1940079B，CN 1940080B）也曾研究利用面包酵母细胞不对称合成制备 (2S, 3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯系列化合物，但获得的主要产物构型为(2S, 3S) -2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，占总产物的75%以上，少部分副产物为(2R, 3S) -2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，再利用碱性条件下进行C2位构型翻转，使副产物(2R, 3S)构型转化为(2S, 3S)构型产物，再通过化学方法将(2S,3S)构型产物进行C3位构型翻转，得到(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，最后脱除3个保护基，最终得到(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸。
由于上述已报道的方法中，利用面包酵母羰基不对称还原所得到的产物主要构型均为(2S, 3S)构型产物，需要再经过化学方法进行构型翻转的步骤，操作繁琐，回收率低。
然而，关于利用微生物细胞直接催化制备(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯却少有报道。微生物法羰基不对称还原制备(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯具有反应条件温和，立体选择性高，易操作等优点，代表着绿色化学的发展方向。
（三）发明内容
本发明的目的是提供一种能够催化羰基不对称还原的新菌株——唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli） ZJB-12126，及其在微生物转化外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯制备(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用。
本发明采用的技术方案是：
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）ZJB-12126，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M 2012379，保藏日期2012年9月25日。
该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还涉及所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ZJB-12126在微生物转化外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯制备式（I）所示（2S，3R）-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用：
式（I）中，R为C1~C6的烷基。
涉及的反应如式（2）所示：
式（2）
具体的，所述应用为：以唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 ZJB-12126经产酶培养获得的含酶菌体细胞为催化剂，以2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯为底物进行转化反应，于反应液中获得所述(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯。反应结束后反应液经离心去除菌体细胞，用高效液相色谱可检测到产生所述(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯。
所述的反应体系为蒸馏水、自来水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、水/有机介质形成的单相体系或水/有机介质形成的双相体系。
优选的，所述微生物转化在20~45℃、pH5.0~9.0下进行，反应时间4~48h。更为优选的，所述微生物转化在pH6.0~7.5的缓冲液中进行。
所述缓冲液中还可添加20~100g/L的辅助底物，以实现辅酶的再生循环，所述辅助底物为下列之一：甲醇、乙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘油。
为增加底物的溶解度，所述缓冲液中还可添加占缓冲液体积2~20%的助溶剂，所述助溶剂为下列之一：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、乙酸乙酯。
所述的底物2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯的浓度为5~100g/L，所述的湿菌体添加量为5~300g/L。本发明中所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ZJB-12126湿菌体含水量为80~90%。
所述的湿菌体可按照如下步骤获得：
（1）种子培养：将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 ZJB-12126接种于斜面培养基，于20~37℃下培养24~48小时，获得斜面活化菌种，所述斜面培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母膏2~25g/L，蛋白胨5~50g/L，琼脂15~20g/L，溶剂为水，初始pH为6.0~8.0；再将斜面活化菌种接种于种子培养基，在25~35℃、摇床转数100~200r/min条件下培养12~36小时得到种子液，所述种子培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母膏2~25g/L，蛋白胨5~50g/L，溶剂为水，初始pH为6.0~8.0。
（2）菌体培养：发酵培养基中按照体积比接入1~5%的种子液，在25~35℃、摇床转数100~200r/min条件下培养12~48小时，将培养液离心、洗涤，收集湿菌体，冷藏备用，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖5~50g/L，酵母膏5~50g/L，NaCl 1~10g/L，溶剂为水，初始pH为6.0~8.0。
更具体的，推荐本发明所述方法按如下步骤进行：
（1） 种子培养
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 ZJB-12126接种于斜面培养基，斜面培养基配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，用1M盐酸溶液或1M氢氧化钠溶液调节初始pH为7.0，于30℃下培养24小时。将斜面培养的菌体接种于种子培养基中进行培养。种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，溶剂为水，用1M盐酸溶液或1M氢氧化钠溶液调节初始pH为7.0。种子培养基在30℃，150r/min条件下培养16小时。
（2）含酶菌体细胞培养
将培养好的种子液按照2%的体积比接种到发酵培养基中以获得菌体。发酵培养基的配方为：葡萄糖30g/L，酵母膏30g/L，NaCl 4g/L，溶剂为水，用1M盐酸溶液或1M氢氧化钠溶液调节初始pH为7.0，在30℃、摇床转数150r/min条件下培养24小时。将培养液离心，收集湿菌体，用生理盐水洗涤两次后，离心收集菌体，冷藏备用。
（3） 生物转化
以2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯为底物，以唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ZJB-12126经产酶培养获得的含酶菌体细胞为催化剂，转化体系为pH7.0，0.1M磷酸钠缓冲液，其中底物浓度为10g/L，助溶剂为异丙醇（添加量为5%），辅助底物为葡萄糖（添加量为50g/L），湿菌体添加量为50g/L，在35℃下进行转化反应24小时，于反应液中获得所述(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯。
本发明中产物摩尔转化率和产物(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯光学纯度（对映体过量值（e.e.%）和非对映体过量值（d.e.%））采用高效液相色谱测定，方法如下：
反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用0.45 μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析。HPLC流动相为色谱纯正己烷和乙醇按体积比为70 : 30混合，并采用超声波脱气。HPLC分析条件：岛津LC-20AT泵，岛津SPD-20A 紫外-可见光检测器，250mm×4.6mm Chiralpak AY-HS手性柱（大赛璐，日本），柱温40℃，流动相流速1.0mL /min，进样量为20.0μL，UV检测波长254nm。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ZJB-12126及其在生物转化合成(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用，该合成反应条件温和，环境友好，更重要的是，产物构型主要为(2S, 3R)-构型，省去了再用化学法翻转产物构型的步骤，因而操作流程简单，具有良好的工业应用前景。
（四）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：微生物的筛选、鉴定
（1）微生物的筛选
菌种富集培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯40g/L，二甲基亚砜40mL/L，溶剂为水，pH7.0。
平板培养基和斜面培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 7.0。
种子液培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，溶剂为水，pH 7.0。
发酵产酶培养基：葡萄糖30g/L，酵母膏30g/L，NaCl 4g/L，溶剂为水，pH为7.0。
从来自浙江、广东、山东、辽宁和江苏等地的菜园果园植物丛采集土样，共200余份用以菌种筛选。具体过程如下：
取少许土样加入到生理盐水中，制成土壤悬液，于菌种富集培养基中150 r/min，30℃的摇床上经过两次富集培养，经过稀释涂布，选取单菌落转接至试管斜面并编号于30℃生化培养箱中培养培养24小时。再从斜面转接至摇瓶发酵产酶培养基中，30℃培养16小时，收集菌体，用0.85%生理盐水洗涤2次，离心收集菌体，所得菌体与底物2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯100mg分散于蒸馏水中，在30℃，150r/min水浴下反应24小时后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用0.45μm微滤膜过滤，滤液通过高效液相色谱检测分析，能转化底物2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯生成(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的菌株为目的菌株，最终从中选择出一株转化活性最高的菌株（编号为ZJB-12126，即CCTCC No：M 2012379）做后续的菌种鉴定及转化。
（2）微生物菌株编号为“ZJB-12126”菌株的生理生化鉴定
i）菌株形态特征：
菌落形态：于30℃在YPD培养基平板培养24小时，菌落呈圆形，光滑湿润，无褶皱，边缘整齐，乳白色，半透明。
细胞形态：为短杆状单生的革兰氏阴性菌，无芽孢，无荚膜，大小约为0.2*1.0μm，端生鞭毛，运动。
ii）菌株生理生化特征：
利用Biolog（GEN III）自动微生物鉴定系统对菌株ZJB-12126进行了94种表型测试（Biolog微生物自动鉴定专用试剂及培养基等购自Biolog公司），包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测：将菌株接种于BUG平板培养基，33℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液混合，制成菌悬液，用浊度计调整至95%T。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog GEN III微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。将微孔鉴定板放在33℃培养箱中，分别在培养12h和24h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株ZJB-12126可较强利用44种碳源，对其他27种碳源不能利用或利用能力较弱；菌株ZJB-12126对12种化学物质敏感。Biolog系统给出24小时鉴定结果，如表1和表2所示。
表1：菌株ZJB-12126对Biolog GEN III板上71种碳源的利用能力
表2：菌株ZJB-12126对Biolog GEN III板上23种化学物质的化学敏感性
（3） 16S rDNA全序列测定与分析
以提取到的菌株细胞总DNA为模板，利用设计的引物扩增菌株ZJB-12126的16S rDNA，由生工生物工程（上海）有限公司进行测序，该片段实际长度为1524 bp，与GenBank相关数据进行相似性分析发现，该菌与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）同源性最高（homology，99%/1524bps，based on 16S rDNA），因此根据生理生化鉴定结合分子生物学鉴定，可确定该菌株为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）。
实施例2：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 ZJB-12126湿菌体的制备
（1）斜面培养：将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 ZJB-12126接种于斜面培养基，于30℃下培养24小时，获得斜面菌体。斜面培养基配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L， 琼脂20g/L，溶剂为水，pH为7.0。
（2）种子培养：用接种环从斜面菌体挑取一环菌体接种于种子培养基，30℃，150r/min条件下培养16小时，获得种子液。种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，溶剂为水，初始pH为7.0。
（3）发酵培养：将培养好的种子液按照2%的体积比接种到发酵培养基中以获得菌体。发酵培养基的配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，NaCl 2g/L，溶剂为水，初始pH为6.5，在25℃、摇床转数200r/min条件下培养48小时，获得含菌细胞发酵液。将发酵液离心，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤两次后，离心收集沉淀，获得湿菌体，湿菌体的产量为57g/L。
实施例3：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 ZJB-12126湿菌体的制备
（1）斜面培养：同实施例2。
（2）种子培养：同实施例2。
（3）发酵培养：将培养好的种子液按照5%的体积比接种到发酵培养基中以获得菌体。发酵培养基的配方为：葡萄糖30g/L，酵母膏30g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.0，在30℃、摇床转数150r/min条件下培养24小时，获得含菌细胞发酵液。将发酵液离心，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤两次后，离心收集沉淀，获得湿菌体，湿菌体的产量为83g/L。
实施例4：
湿菌体的制备同实施例2。在转化瓶中加入100mL柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0，0.1M），其中含有湿菌体2.5g，底物2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯1g，助溶剂乙醇5mL，在25℃恒温水浴搅拌反应4小时，期间用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸水溶液调节反应体系pH值维持在6.0。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用0.45 μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析，产物(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的光学纯度分别为88%（d.e.%）和82%（e.e.%），摩尔转化率为28%。
实施例5：
湿菌体的制备同实施例2。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲溶液（pH7.0，0.1M），其中含有湿菌体2.5g，底物2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯1g，助溶剂二甲基乙酰胺5mL，辅助底物葡萄糖5g，在25℃恒温水浴搅拌反应18小时，期间用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸水溶液调节反应体系pH值维持在7.0。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用0.45 μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析，产物(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的光学纯度分别为85%（d.e.%）和82%（e.e.%），摩尔转化率为49%。
实施例6：
湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲溶液（pH6.5，0.1M），其中含有湿菌体5g，底物2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯1g，助溶剂甲醇5mL，辅助底物葡萄糖5g，在30℃恒温水浴搅拌反应8小时，期间用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸水溶液调节反应体系pH值维持在6.5。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用0.45 μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析，产物(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的光学纯度分别为89%（d.e.%）和80%（e.e.%），摩尔转化率为54%。
实施例7：
湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲溶液（pH7.5，0.1M），其中含有湿菌体5g，底物2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯1g，助溶剂二甲基甲酰胺5mL，辅助底物果糖5g，在35℃恒温水浴搅拌反应12小时，期间用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸水溶液调节反应体系pH值维持在7.5。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用0.45 μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析，产物(2S,3R)-2- -苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的光学纯度分别为93%（d.e.%）和80%（e.e.%），摩尔转化率为65%。
实施例8：
湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲溶液（pH7.0，0.1M），其中含有湿菌体10g，底物2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯5g，助溶剂二甲基亚砜10mL，辅助底物葡萄糖5g，在35℃恒温水浴搅拌反应24小时，期间用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸水溶液调节反应体系pH值维持在7.0。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用0.45 μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析，产物(2S, 3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的光学纯度分别为91%（d.e.%）和81%（e.e.%），摩尔转化率为59%。
实施例9：
湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100mL磷酸钠缓冲溶液（pH7.0，0.1M），其中含有湿菌体10g，底物2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯5g，助溶剂异丙醇10mL，辅助底物葡萄糖10g，在35℃恒温水浴搅拌反应24小时，期间用1M氢氧化钠水溶液或1M盐酸水溶液调节反应体系pH值维持在7.0。反应结束后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用0.45 μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析，产物(2S, 3R)-2 -苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的光学纯度分别为92%（d.e.%）和81%（e.e.%），摩尔转化率为64%。
Claims (6)
1.一株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）ZJB-12126，其保藏编号为CCTCC No：M2012379，保藏日期为2012年9月25日。
2.如权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ZJB-12126在微生物转化外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯制备式（I）所示（2S，3R）-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用：
式（I）中，R为C1～C6的烷基。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述微生物转化在20～45℃、pH5.0～9.0下进行。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述微生物转化在pH6.0～7.5的缓冲液中进行。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述缓冲液中还添加有20～100g/L的辅助底物，所述辅助底物为下列之一：葡萄糖、果糖。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述缓冲液中还添加有占缓冲液体积2～20%的助溶剂，所述助溶剂为下列之一：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、乙酸乙酯。
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