CN100383253C - 一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法。该方法包括微生物菌株的培养、以微生物的完整细胞作为生物催化剂，以尼古丁为底物生物转化合成6-羟基-3-琥珀酰-吡啶以及用沉淀的方法分离纯化6-羟基-3-琥珀酰-吡啶等步骤。本发明的方法具有操作简单，容易控制，转化条件要求宽泛，产物分离纯化简单等特点。为生物转化法大规模生产6-羟基-3-琥珀酰-吡啶提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法。具体的说，涉及一种以微生物的完整细胞为催化剂，以廉价的尼古丁为底物生物转化制备高价值的6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法。
背景技术
尼古丁(nicotine)，俗称烟碱，是许多烟草品种中的主要生物碱。烟叶和卷烟工业的下脚料中含有大量的尼古丁，人们已经开发出从这些材料中提取尼古丁的成熟技术。6-羟基-3-琥珀酰-吡啶(6-hydroxy-3-succinoyl-pyridine，HSP)，是尼古丁的一种衍生物，也是假单胞菌等细菌代谢尼古丁的一种产物，由于它的吡啶环6位被羟基化，所以很容易通过化学修饰合成2，5-或2，3，5-取代的吡啶化合物，这些化合物通常是具有商业价值的药物和农药或其前体。
目前，有关6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生产的研究还不是很多，这与其重要用途不相适应。1954年和1955年，Wada和Yamasaki以及Tabuchi首先报道了在假单胞菌属细菌中发现6-羟基-3-琥珀酰-吡啶为该类细菌代谢尼古丁的一个产物，这为利用微生物生产6-羟基-3-琥珀酰-吡啶提供了重要的前提。
1997年，Roduit等报道了采用假单胞菌(Pseudomonas sp.)DSM 8653和争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)DSM 8244以流加的方式发酵生产6-羟基-3-琥珀酰-吡啶，但是该技术反应时间长；采用复杂的发酵体系，不利于反应控制；培养液成分复杂也给6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的分离纯化造成了极大的困难。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有方法中，反应相对复杂不易控制的不足。本发明要解决的问题是，提供一种以廉价的尼古丁为底物，以微生物的完整细胞为生物催化剂，生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法。该方法具有反应时间短，操作简单，反应体系简单易于产物分离纯化的特点。
本发明的方法由如下步骤组成：
(1)微生物菌种：选择恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8062、纤维单胞菌(Cellulomonas sp.)NRRL B-8063、假单胞菌(Pseudomonas sp.)DSM 8653、争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus)DSM 8244和假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC 11922之一；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有质量体积比为1.5～2.0％的琼脂并加有质量体积比为0.2～5％的尼古丁的固体斜面基本培养基上，25℃～37℃培养12～24小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.2～5％的尼古丁液体基本培养基中，25℃～37℃条件下，在摇床上振荡培养6～24小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以5％的体积比的接种量，接一级种子于200～1000mL含有质量体积比为0.2～5％的尼古丁液体基本培养基中，25℃～37℃条件下，在摇床上振荡培养6～24小时，制得二级种子；
(5)发酵罐培养：以5％的体积比的接种量，接二级种子于2～20L含有质量体积比为0.5～5％的尼古丁液体基本培养基中，25℃～37℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的光密度达到0.6～3.7，终止发酵培养；
(6)收集细胞：取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心10～15分钟，收集发酵培养的细胞，并用pH 7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集细胞沉淀，此细胞沉淀即为生物催化剂，在4℃储存，备用；
(7)转化反应：将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于蒸馏水中，再加入尼古丁，混匀，使混合物中生物催化剂的终浓度为620nm下1～10个光密度，尼古丁的终浓度为1～7g/L；调pH至6.0～9.0，在20℃～40℃、180～350转/分钟条件下振荡，使生物催化剂、尼古丁与空气充分混合；反应期间取样，用HPLC检测6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成情况，当反应混合物中6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成量达到0.6g/L～4.7g/L时，终止转化反应；
(8)生物催化剂的去除：将步骤(7)终止反应后的反应混合物，以6,000～12,000转/分10～30分钟离心，去除步骤(7)中所加入的生物催化剂，得到含有6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；
(9)浓缩：将步骤(8)制得的上清液，在真空度0.08～0.1MPa，50℃～70℃的条件下蒸馏浓缩至原体积的1/20～1/5；
(10)6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集：将步骤(9)制得的浓缩液以盐酸溶液调pH为2～3.5，然后在4℃下静置2～5小时，使6-羟基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；将得到的沉淀用抽滤的方法去除上清溶液，再用体积比为3～6倍的盐酸溶液洗涤；然后将所得的沉淀在40℃～60℃，真空度为0.08～0.1MPa的条件下，干燥2～8小时，最后得到的粉末即为6-羟基-3-琥珀酰-吡啶；
(11)样品检测：将步骤(10)制得的6-羟基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC、ESI-MS、13C NMR和1H NMR检测纯度和结构。
上述步骤(1)所述的菌种为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061。
上述步骤(3)、(4)(5)所述的液体基本培养基的配方是：
K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，金属离子混合液0.5mL/L；调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；
其中，金属离子混合液的配方是：
以1mol/L盐酸溶液为溶剂，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO4 0.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步骤(2)所述的固体斜面基本培养基的配方是向所述的液体基本培养基中加入质量体积比为1.7～2.0％的琼脂。
上述步骤(2)、(3)、(4)(5)所述的菌体培养温度为29～32℃。
上述步骤(2)所述的菌体培养时间为16～20小时。
上述步骤(3)、(4)所述的菌体培养时间为12～15小时。
上述步骤(2)、(3)、(4)(5)所述的尼古丁浓度为2～3％。
上述步骤(6)所述的磷酸缓冲液的浓度为50mmol/L。
上述步骤(7)所述的生物催化剂是指恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRLB-8061的完整细胞。
上述步骤(7)所述的生物催化剂的终浓度为620nm下5～7个光密度。
上述步骤(7)所述的尼古丁的终浓度为2.5～4g/L。
上述步骤(7)所述的pH为6.5～7.5。
上述步骤(7)所述的转化反应温度为28℃～32℃。
上述步骤(7)所述的HPLC方法采用Agilentl 100高压液相色谱仪，色谱柱为KR100-5C18柱(150×4.6mm，填料颗粒5よm，瑞典Kromasil公司)，流动相为0.1mmol/L硫酸∶甲醇＝85∶15，流速为0.5mL/min，紫外检测器波长为210nm，柱温为30℃。
上述步骤(10)所述的pH为2.5，以6mol/L的盐酸调节。
上述步骤(11)所述的ESI-MS用API 4000质谱仪(美国Applied Biosystem公司)分析，溶剂为甲醇。
上述步骤(11)所述的13C NMR和1H NMR用AVANCE 600核磁共振仪(瑞士Bruker公司)分析，溶剂为氘代二甲基亚砜。
本发明是一种利用廉价的尼古丁为底物以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061的完整细胞作为生物催化剂生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶，并且利用简单的沉淀技术分离纯化6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法。
本发明涉及的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8062、纤维单胞菌(Cellulomonas sp.)NRRL B-8063、假单胞菌(Pseudomonas sp.)DSM 8653、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)DSM 8244和假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC 11922转化尼古丁生成6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法的原理可用下述化学反应式表示：
本发明涉及的一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法具有以下特点：
(1)用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061的完整细胞作为生物催化剂合成6-羟基-3-琥珀酰-吡啶，反应快，节约时间和能源。
(2)制备生物催化剂采用的菌株所需的培养基简单、成本低。
(3)该菌株的细胞通透性好，不需破碎，可直接用完整细胞进行转化，操作方便。
(4)生物催化剂可以用过滤法或离心法去除，并且可以回收重复使用2～3次。
(5)转化反应体系成分简单，条件温和，易控制。
(6)反应副产物很少，后续分离提取易操作，费用低廉。
附图说明
图1：转化反应起始时转化液的HPLC图谱。
其中，2.594分钟处的峰为尼古丁。
图2：转化反应终止时转化液的HPLC图谱。
其中，11.126分钟处的峰为6-羟基-3-琥珀酰-吡啶。
图3：6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的ESI-MS图谱。
图4：6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的13C NMR图谱。
图5：6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的1HNMR图谱。
具体实施方式
实施例1
(1)微生物菌种：恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)NRRL B-8061；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有质量体积比为1.7％的琼脂并加有质量体积比为2.5％的尼古丁的固体斜面基本培养基上，30℃培养18小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于50mL含有质量体积比为2.5％的尼古丁液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养14小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以5％的体积比的接种量，接一级种子于600mL含有质量体积比为2.5％的尼古丁液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养14小时，制得二级种子；
(5)发酵罐培养：以5％的体积比的接种量，接二级种子于10L含有质量体积比为3％的尼古丁液体基本培养基中，30℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的光密度达到2.4，终止发酵培养；
(6)收集细胞：取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心12分钟，收集发酵培养的细胞，并用50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集细胞沉淀，此细胞沉淀即为生物催化剂，在4℃储存，备用；
(7)转化反应：将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于4L蒸馏水中，再加入尼古丁，混匀，使混合物中生物催化剂的终浓度为620nm下6个光密度，尼古丁的终浓度为3g/L；调pH至7.0，在30℃、200转/分钟条件下振荡，使生物催化剂、尼古丁与空气充分混合；反应期间取样，用HPLC检测6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成情况，当反应混合物中6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成量达到1.5g/L时，终止转化反应；
(8)生物催化剂的去除：将步骤(7)终止反应后的反应混合物，以10,000转/分20分钟离心，去除步骤(7)中所加入的生物催化剂，得到含有6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；
(9)浓缩：将步骤(8)制得的上清液，在真空度0.1MPa，60℃的条件下蒸馏浓缩至原体积的1/10；
(10)6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集：将步骤(9)制得的浓缩液以6mol/L的盐酸溶液调pH为2.5，然后在4℃下静置4小时，使6-羟基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；将得到的沉淀用抽滤的方法去除上清溶液，再用体积比为4倍的盐酸溶液洗涤；然后将所得的沉淀在50℃，真空度为0.1MPa的条件下，干燥5小时，最后得到5.7g粉末即为6-羟基-3-琥珀酰-吡啶提取率达到94％；
(11)样品检测：将步骤(10)制得的6-羟基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC检测纯度达98％，用ESI-MS、13C NMR和1H NMR鉴定其结构确为6-羟基-3-琥珀酰-吡啶。
上述步骤(3)、(4)(5)所述的液体基本培养基的配方是：
K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，金属离子混合液0.5mL/L；调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；
其中，金属离子混合液的配方是：
以1mol/L盐酸溶液为溶剂，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO4 0.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步骤(7)所述的HPLC方法采用Agilentl100高压液相色谱仪，色谱柱为KR100-5C18柱(150×4.6mm，填料颗粒5よm，瑞典Kromasil公司)，流动相为0.1mmol/L硫酸∶甲醇＝85∶15，流速为0.5mL/min，紫外检测器波长为210nm，柱温为30℃。
上述步骤(11)所述的ESI-MS用API 4000质谱仪(美国Applied Biosystem公司)分析，溶剂为甲醇。
上述步骤(11)所述的13C NMR和1H NMR用AVANCE 600核磁共振仪(瑞士Bruker公司)分析，溶剂为氘代二甲基亚砜。
实施例2
(1)微生物菌种：假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC 11922；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有质量体积比为1.5％的琼脂并加有质量体积比为0.2％的尼古丁的固体斜面基本培养基上，25℃培养12小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于20mL含有质量体积比为0.2％的尼古丁液体基本培养基中，25℃条件下，在摇床上振荡培养6小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以5％的体积比的接种量，接一级种子于200mL含有质量体积比为0.2％的尼古丁液体基本培养基中，25℃条件下，在摇床上振荡培养6小时，制得二级种子；
(5)发酵罐培养：以5％的体积比的接种量，接二级种子于2L含有质量体积比为0.5％的尼古丁液体基本培养基中，25℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的光密度达到0.6，终止发酵培养；
(6)收集细胞：取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心10分钟，收集发酵培养的细胞，并用50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集细胞沉淀，此细胞沉淀即为生物催化剂，在4℃储存，备用；
(7)转化反应：将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于1L蒸馏水中，再加入尼古丁，混匀，使混合物中生物催化剂的终浓度为620nm下1个光密度，尼古丁的终浓度为1g/L；调pH至6.0，在20℃、180转/分钟条件下振荡，使生物催化剂、尼古丁与空气充分混合；反应期间取样，用HPLC检测6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成情况，当反应混合物中6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成量达到0.4g/L时，终止转化反应；
(8)生物催化剂的去除：将步骤(7)终止反应后的反应混合物，以6,000转/分30分钟离心，去除步骤(7)中所加入的生物催化剂，得到含有6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；
(9)浓缩：将步骤(8)制得的上清液，在真空度0.09MPa，50℃的条件下蒸馏浓缩至原体积的1/5；
(10)6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集：将步骤(9)制得的浓缩液以6mol/L的盐酸溶液调pH为3.5，然后在4℃下静置2小时，使6-羟基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；将得到的沉淀用抽滤的方法去除上清溶液，再用体积比为3倍的盐酸溶液洗涤；然后将所得的沉淀在40℃，真空度为0.09MPa的条件下，干燥2小时，最后得到0.36g粉末即为6-羟基-3-琥珀酰-吡啶提取率达到92％；
(11)样品检测：将步骤(10)制得的6-羟基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC检测纯度达97％，用ESI-MS、13C NMR和1H NMR鉴定其结构确为6-羟基-3-琥珀酰-吡啶。
上述步骤(3)、(4)(5)所述的液体基本培养基的配方是：
K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，金属离子混合液0.5mL/L；调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；
其中，金属离子混合液的配方是：
以1mol/L盐酸溶液为溶剂，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO4 0.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步骤(7)所述的HPLC方法采用Agilentl100高压液相色谱仪，色谱柱为KR100-5C18柱(150×4.6mm，填料颗粒5よm，瑞典Kromasil公司)，流动相为0.1mmol/L硫酸∶甲醇＝85∶15，流速为0.5mL/min，紫外检测器波长为210nm，柱温为30℃。
上述步骤(11)所述的ESI-MS用API 4000质谱仪(美国Applied Biosystem公司)分析，溶剂为甲醇。
上述步骤(11)所述的13C NMR和1H NMR用AVANCE 600核磁共振仪(瑞士Bruker公司)分析，溶剂为氘代二甲基亚砜。
实施例3
(1)微生物菌种：争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)DSM 8244；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有质量体积比为2.0％琼脂并加有质量体积比为5％的尼古丁的固体斜面基本培养基上，37℃培养24小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL含有质量体积比为5％的尼古丁液体基本培养基中，37℃条件下，在摇床上振荡培养24小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以5％体积比的接种量，接一级种子于1000mL含有质量体积比为5％的尼古丁液体基本培养基中，37℃条件下，在摇床上振荡培养24小时，制得二级种子；
(5)发酵罐培养：以5％体积比的接种量，接二级种子于20L含有质量体积比为5％的尼古丁液体基本培养基中，37℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的光密度达到3.7，终止发酵培养；
(6)收集细胞：取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心15分钟，收集发酵培养的细胞，并用50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集细胞沉淀，此细胞沉淀即为生物催化剂，在4℃储存，备用；
(7)转化反应：将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于7.5L蒸馏水中，再加入尼古丁，混匀，使混合物中生物催化剂的终浓度为620nm下10个光密度，尼古丁的终浓度为7g/L；调pH至9.0，在40℃、350转/分钟条件下振荡，使生物催化剂、尼古丁与空气充分混合；反应期间取样，用HPLC检测6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成情况，当反应混合物中6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成量达到3.1g/L时，终止转化反应；
(8)生物催化剂的去除：将步骤(7)终止反应后的反应混合物，以12,000转/分10分钟离心，去除步骤(7)中所加入的生物催化剂，得到含有6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；
(9)浓缩：将步骤(8)制得的上清液，在真空度0.08MPa，70℃的条件下蒸馏浓缩至原体积的1/20；
(10)6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集：将步骤(9)制得的浓缩液以6mol/L的盐酸溶液调pH为2，然后在4℃下静置5小时，使6-羟基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；将得到的沉淀用抽滤的方法去除上清溶液，再用体积比为6倍的盐酸溶液洗涤；然后将所得的沉淀在60℃，真空度为0.08MPa的条件下，干燥8小时，最后得到22.3g粉末即为6-羟基-3-琥珀酰-吡啶提取率达到96％；
(11)样品检测：将步骤(10)制得的6-羟基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC检测纯度达96％，用ESI-MS、13C NMR和1H NMR鉴定其结构确为6-羟基-3-琥珀酰-吡啶。
实施例4
与实施例1相同，所不同的是步骤(1)所选用的微生物菌种为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)NRRL B-8062。
实施例5
与实施例1相同，所不同的是步骤(1)所选用的微生物菌种为纤维单胞菌(Cellulomonassp.)NRRL B-8063。
实施例6
与实施例2相同，所不同的是步骤(1)所选用的微生物菌种为假单胞菌(Pseudomonassp.)DSM 8653。
Claims (9)
1.一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法，由如下步骤组成：
(1)微生物菌种：选择恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8062、纤维单胞菌(Cellulomonas sp.)NRRL B-8063、假单胞菌(Pseudomonas sp.)DSM8653、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)DSM 8244和假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC 11922之一；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有质量体积比为1.5～2.0％的琼脂并加有质量体积比为0.2～5％的尼古丁的固体斜面基本培养基上，25℃～37℃培养12～24小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.2～5％的尼古丁液体基本培养基中，25℃～37℃条件下，在摇床上振荡培养6～24小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以5％的体积比的接种量，接一级种子于200～1000mL含有质量体积比为0.2～5％的尼古丁液体基本培养基中，25℃～37℃条件下，在摇床上振荡培养6～24小时，制得二级种子；
(5)发酵罐培养：以5％的体积比的接种量，接二级种子于2～20L含有质量体积比为0.5～5％的尼古丁液体基本培养基中，25℃～37℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的光密度达到0.6～3.7，终止发酵培养；
(6)收集细胞：取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心10～15分钟，收集发酵培养的细胞，并用pH 7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集细胞沉淀，此细胞沉淀即为生物催化剂，在4℃储存，备用；
(7)转化反应：将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于蒸馏水中，再加入尼古丁，混匀，使混合物中生物催化剂的终浓度为620nm下1～10个光密度，尼古丁的终浓度为1～7g/L；调pH至6.0～9.0，在20℃～40℃、180～350转/分钟条件下振荡，使生物催化剂、尼古丁与空气充分混合；反应期间取样，用HPLC检测6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成情况，当反应混合物中6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的生成量达到0.6g/L～4.7g/L时，终止转化反应；
(8)生物催化剂的去除：将步骤(7)终止反应后的反应混合物，以6,000～12,000转/分10～30分钟离心，去除步骤(7)中所加入的生物催化剂，得到含有6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的上清液；
(9)浓缩：将步骤(8)制得的上清液，在真空度0.08～0.1MPa，50℃～70℃的条件下蒸馏浓缩至原体积的1/20～1/5；
(10)6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的沉淀和收集：将步骤(9)制得的浓缩液以盐酸溶液调pH为2～3.5，然后在4℃下静置2～5小时，使6-羟基-3-琥珀酰-吡啶充分沉淀；将得到的沉淀用抽滤的方法去除上清溶液，再用体积比为3～6倍的盐酸溶液洗涤；然后将所得的沉淀在40℃～60℃，真空度为0.08～0.1MPa的条件下，干燥2～8小时，最后得到的粉末即为6-羟基-3-琥珀酰-吡啶；
(11)样品检测：将步骤(10)制得的6-羟基-3-琥珀酰-吡啶粉末，用HPLC、ESI-MS、13C NMR和1H NMR检测纯度和结构。
上述步骤(3)(4)(5)所述的液体基本培养基的配方是：K2HPO4·3H2O13.3g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，金属离子混合液0.5mL/L，其中，金属离子混合液的配方是：以1mol/L盐酸溶液为溶剂，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O 0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O 0.05g/L，调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；步骤(2)所述的固体斜面基本培养基的配方是向所述的液体基本培养基中加入质量体积比为1.7～2.0％的琼脂。
2.如权利要求1所述的一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步骤(1)所述的微生物菌种为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061。
3.如权利要求1所述的一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步骤(6)所述的磷酸缓冲液的浓度是50mmol/L。
4.如权利要求1所述的一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步骤(7)所述的生物催化剂是指恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL B-8061的完整细胞。
5.如权利要求1、2、4所述的一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步骤(7)所述的生物催化剂的终浓度为620nm下5～7个光密度。
6.如权利要求1、2、4所述的一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步骤(7)所述的尼古丁的终浓度为2.5～4g/L。
7.如权利要求1、2、4所述的一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步骤(7)所述的pH调为6.5～7.5。
8.如权利要求1、2、4所述的一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步骤(7)所述的HPLC的检测条件是：色谱柱为瑞典Kromasil公司的KR100-5C18柱，流动相为0.1mmol/L硫酸∶甲醇＝85∶15，流速为0.5mL/min，紫外检测器的波长为210nm，柱温为30℃。
9.如权利要求1、2、4所述的一种以尼古丁为底物生物转化制备6-羟基-3-琥珀酰-吡啶的方法，其特征在于，步骤(10)所述的pH为2.5，以6mol/L的盐酸调节。
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