CN105296564B - 一种生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种生物转化制备3‑琥珀酰吡啶的方法，包括以下步骤：步骤一、将含尼古丁的液体作为生物转化反应的底物；步骤二、将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的spmA基因敲除，得到基因工程菌；步骤三、将基因工程菌进行培养后收集菌体全细胞作为生物催化剂；步骤四、将该菌体全细胞与该底物进行转化反应得到产物；步骤五、将该产物离心、减压浓缩、干燥得到3‑琥珀酰吡啶。其中，以废次烟叶提取尼古丁为底物。本发明为利用微生物转化的方法大规模生产3‑琥珀酰吡啶提供了可行性，具有操作简单，易于控制，转化条件温和，产物单一且易于分离纯化，原料成本低，实现废次烟叶的绿色再利用等优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种3-琥珀酰吡啶的制备方法，尤其是涉及一种生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法。
背景技术
尼古丁(nicotine)，又称烟碱，是烟草中最主要的生物碱，同时也是卷烟中的有害成分之一，是吸烟产生烟瘾和依赖性的主要因素。在卷烟工业中产生了大量含有尼古丁的“有害的危险废物”，其中的尼古丁能够通过地下水或者空气进入环境中，会对环境及人类健康造成极大的危害。
我国是卷烟生产大国，在烟草加工过程中会产生约20％～30％废次烟叶，除此之外各烟厂中积存的大量烟末，以及大量丢弃的上部烟叶和烟花等，这些烟草工业下脚料的利用率很低，废弃后不仅造成浪费，还对环境产生污染。从这些烟叶种植及卷烟加工中产生的下脚料中提取尼古丁的技术已经发展比较成熟，从传统的水蒸气蒸馏法，二次萃取法到“绿色”新型分离技术超临界萃取法，通过这些手段提取出尼古丁，既可以减少其对环境污染，又可以利用提出的尼古丁作为医药和生物农药产品开发的工业原料。
3-琥珀酰吡啶(3-succinoyl-pyridine，SP)，是假单胞菌属代谢尼古丁的一种中间产物，该化合物通过化学修饰后可以作为合成某些药物和农药的前体，具有较高的利用价值。目前，有关3-琥珀酰吡啶生产的研究报道还不充分，如何有效获得3-琥珀酰吡啶成为人们希望解决的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法，包括以下步骤：
步骤一、底物的获取：将含尼古丁的液体作为生物转化反应的底物；
步骤二、构建生物转化用的菌株：将能代谢尼古丁的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的spmA基因敲除，得到恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌；
步骤三、菌株培养与收集：将步骤二中得到的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)基因工程菌进行培养后收集菌体全细胞作为生物催化剂；
步骤四、转化反应：将步骤三中收集的菌体全细胞与步骤一中的底物在pH6.0～10.0(优选地是pH7.0～9.0)，20～45℃温度下，120～180rpm振荡条件下反应，直至尼古丁完全被降解后终止反应，或者定时向反应液中补加底物，维持尼古丁浓度在1g/L以上反应6～15小时；
步骤五、产物分离：将步骤四反应结束后的产物在5000～10000rpm转速下离心10～30分钟，取上清液置于真空度0.08～0.1MPa，45～65℃的条件下减压蒸馏至原体积的1/20～1/50，加入盐酸调节pH在2.0～4.0，静置、沉淀，然后用抽滤方法去除水溶液，将沉淀干燥，得到3-琥珀酰吡啶。其中优选地是静置待3-琥珀酰吡啶充分沉淀。最后干燥得到的3-琥珀酰吡啶为白色粉末。步骤一与步骤二和步骤三是独立分别进行的，不存在先后顺序。
进一步地，步骤一以废次烟叶作为生物转化的原料，利用水浸提废次烟叶获得烟叶浸提液或利用二次萃取的方法从废次烟叶中获得尼古丁提取液，烟叶浸提液或尼古丁提取液作为生物转化反应的底物。
其中，步骤一中的烟草浸提液的获取方法是：将废次烟叶和纯水按照质量比1:10～15混合，在50～60℃下搅拌处理3～5小时，过滤除去废次烟叶，获得烟草浸提液。
其中，步骤一中的尼古丁提取液的获取方法是：将废次烟叶烘干后粉碎成烟末，将烟末与蒸馏水按照1:10～1:15混合均匀，用氢氧化钠调节pH在11～14，搅拌2～4小时后静置12～24小时，过滤除去滤渣获得含有烟碱的滤液，加入滤液体积的1/5～1/10氯仿进行萃取，萃取温度为35～40℃，pH控制在11～14，搅拌萃取2～4小时后加入滤液体积的1/5～1/10稀硫酸进行反萃，稀硫酸的pH为1～4，利用分液漏斗除去有机相，获得硫酸烟碱水溶液，即为尼古丁提取液。
进一步地，步骤二中的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是于2005年04月18日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M205038的菌株。这里被命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)S16。具体保藏信息可见http://www.cctcc.org/sci/microbe_common/search1_result.php？ptzyh＝1542C0001WHM205038。
进一步地，步骤二中的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌的具体构建方法是包括以下步骤：
步骤甲、PCR扩增spmA基因：以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CCTCC M205038为模版，spm-F和spm-R为引物进行PCR扩增获得PCR产物；spm-F引物序列(SEQ IDNO.1)为CCACGTCGACCAAGTTAACTGGTTATGCGAC，含有酶切位点为Sal Ⅰ；spm-R引物序列(SEQID NO.2)为CCACGAATTCAGTCCTTGGCCGAAACTTTGC，含有酶切位点为EcoR Ⅰ；
步骤乙、质粒构建与转化：将步骤甲中的PCR产物和穿梭质粒分别用限制性内切酶Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ进行酶切，获得酶切产物，并回收、连接酶切产物得到带有PCR产物的穿梭质粒；利用热激法将带有PCR产物的穿梭质粒转化到大肠杆菌中，再经过酶切及测序验证，得到供体菌；
步骤丙、双亲杂交：将步骤乙中得到的供体菌和以恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)CCTCC M 205038作为受体菌的两菌株通过双亲杂交的方法获得恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌。
进一步地，步骤三中菌株培养包括以下三个步骤：
步骤a、斜面培养：将步骤二中的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌接种到固体斜面LB培养基，25～37-℃培养10～24小时，固体斜面LB培养基组含有1％～3％琼脂糖和50～100mg/L卡那霉素；
步骤b、种子培养：将步骤a中斜面上长势良好的菌体在无菌的环境中转接到LB液体培养基或者甘油液体培养基中，在25～37-℃培养8～24小时，获得种子液，LB液体培养基和甘油液体培养基中均含有卡那霉素50～100mg/L和尼古丁0.5～1.5g/L；
步骤c、放大培养：将步骤b中的种子液按照体积比1％～5％接种量转接到LB液体培养基或者甘油液体培养基中，25～37℃下120～200rpm培养8～24小时到对数生长中期，LB液体培养基和甘油液体培养基中均含有50～100mg/L卡那霉素和0.5～1.5g/L尼古丁。
进一步地，步骤a～c中的菌体培养温度为29～31℃。步骤a中的菌体培养时间为10～14小时。步骤b和c中的菌体培养时间为12～16小时。步骤b和c中的培养基中的尼古丁浓度为0.8～1.2g/L。
进一步地，步骤四中的菌体全细胞参与反应时的初始浓度是600nm下OD值为5～15个光密度，优选地是8～11个光密度；步骤一中的尼古丁在步骤四中参与反应时的初始浓度是1～5g/L，优选地是2～4g/L；以上初始浓度均用水调制获得。
在本发明的生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法的另一实施方式中，还包括步骤六：产物鉴定：将步骤五中获得的3-琥珀酰吡啶用高效液相色谱(HPLC)检测其纯度，用液相-质谱联用(ESI-MS)和核磁波谱(NMR)的方法鉴定其结构。
进一步地，步骤六中的NMR检测分别检测13CNMR和1HNMR，用Avance Ⅲ400核磁共振仪分析，溶剂为二甲基亚砜。步骤六中的ESI-MS用Agilent 6230质谱仪分析，溶剂为甲醇。
进一步地，步骤四还包括反应期间每小时取样，用薄层层析(TLC)或者高效液相色谱检测3-琥珀酰吡啶的生成情况；薄层层析的反应展层剂中氯仿:乙醇:甲醇:0.5M氢氧化钠的体积比为30:15:2:1.5；高效液相色谱的检测条件是：Agilent1100高效液相色谱仪配备XDB-C18色谱柱，流动相中0.1M硫酸:乙腈的体积比为85:15，流速为0.5mL/min，检测波长为254nm，柱温为30-℃；步骤六中的高效液相色谱的检测条件与步骤四中的高效液相色谱的检测条件相同。
进一步，步骤四中的转化反应发生在只有恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌、底物尼古丁和溶剂蒸馏水存在的反应体系中。
本发明将微生物菌株基因的定向改造、废次烟叶中尼古丁的提取与3-琥珀酰吡啶的制备有机的结合在一起，利用一株经定向改造后的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌作为生物催化剂，高效而稳定的降解尼古丁并且积累单一的代谢中间物3-琥珀酰吡啶。本发明借助基因工程菌高效且特异性的生物催化功能，解决了野生型菌株在转化过程中产物3-琥珀酰吡啶很难积累且易被相关酶降解的问题。本发明提供的3-琥珀酰吡啶制备的方法，具有成本低廉，催化反应体系简单，产物单一易于分离纯化，反应耗时短、效率高的优点。
本发明提供了一种将废次烟叶综合利用的新思路，以废次烟叶作为廉价的原料，从中提取尼古丁，再结合微生物催化作用，将尼古丁转化为高值的代谢中间物3-琥珀酰吡啶，利用简单易行的减压浓缩及酸沉降法分离纯化3-琥珀酰吡啶。
本发明所涉及的生物催化剂是一株经过定向基因改造的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌，该基因工程菌的基因组中spmA基因，通过插入失活的方法使其无法表达，进而导致尼古丁代谢阻断在3-琥珀酰吡啶，达到稳定高效的积累3-琥珀酰吡啶的目的，经定向改造后整个生物催化过程的化学反应式如下所述：
本发明所涉及的一种生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法具有以下显著特点：
(1)实现了废次烟叶的开发利用。利用废次烟叶作为原料提取尼古丁，用作生产高值化合物3-琥珀酰吡啶，有利于降低成本，同时解决由于废次烟叶废弃带来的环境污染问题。
(2)利用微生物全细胞作为生物催化剂。微生物具有繁殖快、环境耐受性强、代谢能力强等优势，作为催化剂成本低，能高效的实现尼古丁到3-琥珀酰吡啶的转化，耗时短，节省能源。
(3)根据基因工程原理定向改造菌株。通过基因敲除方法，使本发明所述的基因工程菌能够定向的积累产物3-琥珀酰吡啶，减少副产物的产生，阻断了产物的消耗，高效稳定的积累单一目的产物3-琥珀酰吡啶。
(4)本发明所述的生物催化为全细胞催化，在转化反应结束后，微生物催化剂可以通过离心或者过滤的手段再次收集后，重复利用3～4次。
(5)转化反应体系成分简单，反应条件温和，易于控制与操作。
附图说明
图1是转化反应起始时反应液的HPLC图谱。
图2是转化反应终止时反应液的HPLC图谱。
图3是spmA基因敲除示意图。
图4是3-琥珀酰吡啶的ESI-MS图谱。
图5是3-琥珀酰吡啶的13CNMR图谱。
图6是3-琥珀酰吡啶的1HNMR图谱。
图7是补料发酵时尼古丁与3-琥珀酰吡啶浓度随时间变化图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌的构建，见图3
基于基因工程原理，结合相关的分子生物学方法完成恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)基因工程菌的构建，具体实施步骤如下所述：
(1)引物设计：上游引物为spm-F:CCACGTCGACCAAGTTAACTGGTTATGCGAC，酶切位点为Sal Ⅰ；下游引物为spm-R:CCACGAATTCAGTCCTTGGCCGAAACTTTGC，酶切位点为EcoR Ⅰ。
(2)DNA片段扩增：以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CCTCC M 205038的基因组为模板，利用(1)所述的上下游引物，通过PCR技术扩增，获得多拷贝目的DNA片段。
(3)质粒构建与转化：将(2)中PCR产物和穿梭质粒pK18mob分别用限制性内切酶Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ进行酶切，将酶切获得的产物进行回收、连接，利用热激法转化到大肠杆菌S17-1中，再经过酶切及测序验证，得到了在大肠杆菌S17-1中的pK18mob-spm重组质粒。
(4)双亲杂交：通过双亲杂交的方法获得恶臭假单胞菌(-Pseudomonas putida)基因工程菌，需含有重组质粒pK18mob-spm的大肠杆菌S17-1作为供体菌，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CCTCC M 205038作为受体菌。具体方法：分别活化大肠杆菌S17-1和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CCTCC M 205038，培养温度分别为37℃和30℃；将活化好的菌株按合适接种量接种到无抗生素的LB培养基中，检测菌株生长状态，待其同时生长到OD600nm为0.6左右；上述菌株用无菌生理盐水洗涤两遍并重悬至原来体积，分别取400μL的供体菌，2 000μL的受体菌混合起来，用无菌滤膜过滤混合菌液，将滤膜剪下贴在无抗生素LB平板上，37℃培养4h后，再转入到30℃；培养过夜后用无菌生理盐水洗下菌体，重悬至200μL左右涂布在含有50mg/L卡那霉素的M9固体培养基平板上，30℃培养1～2天。利用PCR技术对M9固体培养基平板上的转化子进行筛选，筛选出恶臭假单胞菌(-Pseudomonasputida)基因工程菌。上述M9固体培养基的配方是：首先配制5×的M9盐：8.5g Na2HPO4，1.5gKH2PO4，0.25g NaCl，0.5g NH4Cl，用蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20分钟；每800mL蒸馏水加入5g柠檬酸三钠，灭菌，冷却后加入5×M9盐200ml，固体培养基则需加入1.5％的琼脂粉。
实施例2：从废次烟叶中提取尼古丁
在实验室条件下，采用二次萃取的方法从废次烟叶中提取尼古丁，具体实施步骤如下：
(1)废次烟叶由河南中烟公司提供，先将废次烟叶烘干后碾碎成粉末状，称取50g烟叶粉末，加入到600mL蒸馏水中，搅拌均匀后用氢氧化钠将pH调至11，然后在搅拌仪上连续搅拌2小时，静置过夜。
(2)过滤除去滤渣，获得含有尼古丁的滤液约500mL，向其中加入100mL氯仿进行萃取，萃取温度为37℃，pH调至11，搅拌萃取3小时；利用分液漏斗除去水相，获得含有尼古丁的氯仿相。
(3)利用20mL稀硫酸溶液从氯仿相中反萃出尼古丁，所用稀硫酸溶液pH调至2，用分液漏斗获得最终含有硫酸烟碱的水溶液；此步骤中的含有尼古丁的氯仿相可重复多次反萃，以提高尼古丁的萃取率。
(4)HPLC法检测硫酸烟碱水溶液中尼古丁的含量。HPLC检测条件是：Agilent1100高效液相色谱仪配备XDB-C18色谱柱，流动相为0.1M H2SO4：乙腈＝85:15，流速为0.5mL/min，检测波长254nm，柱温为30℃。用HPLC定量检测尼古丁浓度，需要尼古丁浓度与峰面积相对应的标准曲线，配制不同浓度梯度的尼古丁标准品，分别为0g/L，0.1g/L,0.5g/L,1g/L,2g/L,3g/L,4g/L，测定相应浓度下的峰面积，绘制标准曲线。将步骤(3)中所得硫酸烟碱稀释到合适浓度后，用HPLC检测获得在254nm下峰面积，再由标准曲线换算出其尼古丁浓度。
实施例3：尼古丁经生物转化生成3-琥珀酰吡啶
(1)生物催化剂：进行生物转化采用的微生物菌种为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)基因工程菌；
(2)斜面培养：将步骤(1)中的菌株接种到固体斜面LB培养基，30℃培养15小时；所述的固体斜面LB培养基组含有1.5％琼脂糖，1g/L尼古丁和50mg/L卡那霉素；
(3)种子培养：将步骤(2)中斜面上长势良好的菌体，在无菌的环境中转接到LB液体培养基中，所述的LB液体培养基中含有卡那霉素50mg/L和1g/L的尼古丁，在30℃培养12小时，获得种子液；
(4)放大培养：将步骤(3)中的种子液按照2％接种量转接到1L LB液体培养基中，所述的液体培养基中含有50mg/L卡那霉素和1g/L尼古丁，30℃下200rpm培养12小时到对数生长中期；
(5)收集菌体：将步骤(4)中处于对数生长中期的细胞培养液在4200rpm转速下离心20分钟，收集菌体，并用0.1M PBS缓冲液洗涤1次，再用蒸馏水重复洗涤2次，收集细胞作为生物催化剂；
(6)提取尼古丁：利用二次萃取的方法从废次烟叶中提取尼古丁，所述的尼古丁提取液作为生物转化反应的底物；
(7)转化反应：将步骤(5)中菌体细胞重悬于400mL蒸馏水中，调成600nm下OD值为10个光密度，尼古丁初始浓度为3g/L，pH调至9，在30℃温度下，150rpm振荡条件下反应，反应时间为10小时至尼古丁完全被降解后终止反应；反应期间每小时取样，用TLC或者HPLC检测3-琥珀酰吡啶的生成情况，见图1和2；
(8)补料发酵反应：将步骤(5)中获得的菌体细胞重悬于400mL蒸馏水中，调成600nm下OD值为10个光密度，尼古丁初始浓度为3g/L，用3M盐酸调节pH至9，在30℃温度下，150rpm振荡条件下反应；反应期间取样检测底物尼古丁浓度，适时补加底物尼古丁，维持反应体系中尼古丁含量在1g/L以上；同时取样检测产物3-琥珀酰吡啶浓度，当产物浓度不再升高时即终止反应，见图7；
(9)产物分离：将步骤(7)中的反应液在10000rpm转速下离心15分钟，去除生物催化剂；将上清液在真空度0.08MPa，55℃的条件下减压蒸馏至原体积的1/40；加入盐酸调节pH在2，静置待3-琥珀酰吡啶充分沉淀；用抽滤方法去除水溶液，将沉淀在70℃下干燥8小时，得到的0.72g白色粉末即为3-琥珀酰吡啶；
(10)产物鉴定：将步骤(8)中获得的3-琥珀酰吡啶晶体，利用HPLC检测其纯度为95％，利用ESI-MS和13CNMR和1HNMR鉴定其结构确为3-琥珀酰吡啶，见图4-6。
上述步骤(2)、(3)、(4)所述的LB培养基配方是：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，蒸馏水为溶剂。
上述步骤(4)、(5)所述的甘油培养基配方是：10g/L甘油，1g/L(NH4)2SO4，13.3g/LK2HPO4·3H2O，4g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4·7H2O，0.5mL/L无机盐混合液；所述的无机盐混合液的配方是：0.05g/L CaCl2·2H2O,0.05g/L CuCl2·2H2O,0.008g/L MnSO4·H2O,0.004g/L FeSO4·7H2O，0.1g/L ZnSO4,0.1g/L NaMoO4·2H2O,0.05g/L Na2WO4·2H2O,溶于0.1M的盐酸溶液中。
上述步骤(5)所述的0.1M PBS缓冲液配方是：0.27g/L KH2PO4,1.42g/L Na2HPO4,8g/L NaCl,0.2g/L KCl,调节pH至7.4。
上述步骤(7)所述的TLC反应展层剂为氯仿-乙醇-甲醇-0.5M氢氧化钠(30:15:2:1.5,V/V)。
上述步骤(7)所述的HPLC检测条件是：Agilent1100高效液相色谱仪配备XDB-C18色谱柱(250×4.6mm)，流动相为0.1M H2SO4：乙腈＝85:15，流速为0.5mL/min，紫外检测波长254nm，柱温为30℃。
上述步骤(9)所述的ESI-MS用Agilent 6230质谱仪分析，溶剂为甲醇。
上述步骤(9)所述的NMR检测分别检测13CNMR和1HNMR，用AvanceⅢ400核磁共振仪分析，溶剂为氘代二甲基亚砜。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、底物的获取：将含尼古丁的液体作为生物转化反应的底物；
步骤二、构建生物转化用的菌株：将能代谢尼古丁的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的spmA基因敲除，得到恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌；
步骤三、菌株培养与收集：将所述步骤二中得到的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌进行培养后收集菌体全细胞作为生物催化剂；
步骤四、转化反应：将所述步骤三中收集的菌体全细胞与所述步骤一中的底物在pH6.0～10.0，20～45℃温度下，120～180rpm振荡条件下反应，直至尼古丁完全被降解后终止反应，或者定时向反应液中补加底物，维持尼古丁浓度在1-5g/L反应6～45小时；
步骤五、产物分离：将所述步骤四反应结束后的产物在5000～10000rpm转速下离心10～30分钟，取上清液置于真空度0.08～0.1MPa，45～65℃的条件下减压蒸馏至原体积的1/20～1/50，加入盐酸调节pH在2.0～4.0，静置、沉淀，然后用抽滤方法去除水溶液，将沉淀干燥，得到3-琥珀酰吡啶；
所述步骤一以废次烟叶作为生物转化的原料，利用水浸提废次烟叶获得烟叶浸提液或利用二次萃取的方法从废次烟叶中获得尼古丁提取液，所述烟叶浸提液或所述尼古丁提取液作为生物转化反应的底物；
所述步骤一中的烟草浸提液的获取方法是：将废次烟叶和纯水按照质量比1:10～15混合，在50～60℃下搅拌处理3～5小时，过滤除去废次烟叶，获得所述烟草浸提液；
所述步骤一中的尼古丁提取液的获取方法是：将废次烟叶烘干后粉碎成烟末，将所述烟末与蒸馏水按照1:10～1:15g/mL的质量体积比混合均匀，用氢氧化钠调节pH在11～14，搅拌2～4小时后静置12～24小时，过滤除去滤渣获得含有烟碱的滤液，加入所述滤液体积的1/5～1/10氯仿进行萃取，萃取温度为35～40℃，pH控制在11～14，搅拌萃取2～4小时后加入所述滤液体积的1/5～1/10稀硫酸进行反萃，所述稀硫酸的pH为1～4，利用分液漏斗除去有机相，获得硫酸烟碱水溶液，即为所述尼古丁提取液；
所述步骤二中的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是于2005年04月18日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 205038的菌株。
2.如权利要求1所述的生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于，所述步骤二中的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌的具体构建方法是包括以下步骤：
步骤甲、PCR扩增spmA基因：以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CCTCC M 205038为模版，spm-F和spm-R为引物进行PCR扩增获得PCR产物；所述spm-F引物序列为CCACGTCGACCAAGTTAACTGGTTATGCGAC，含有酶切位点为SalⅠ；所述spm-R引物序列为CCACGAATTCAGTCCTTGGCCGAAACTTTGC，含有酶切位点为EcoRⅠ；
步骤乙、质粒构建与转化：将所述步骤甲中的PCR产物和穿梭质粒分别用限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ进行酶切，获得酶切产物，并回收、连接所述酶切产物得到带有PCR产物的穿梭质粒；利用热激法将所述带有PCR产物的穿梭质粒转化到大肠杆菌中，再经过酶切及测序验证，得到供体菌；
步骤丙、双亲杂交：将所述步骤乙中得到的供体菌和以所述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CCTCC M 205038作为受体菌的两菌株通过双亲杂交的方法获得所述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌。
3.如权利要求1所述的生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于，所述步骤三中菌株培养包括以下三个步骤：
步骤a、斜面培养：将所述步骤二中的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因工程菌接种到固体斜面LB培养基，25～37℃培养10～24小时，所述固体斜面LB培养基组含有1％～3％琼脂糖和50～100mg/L卡那霉素；
步骤b、种子培养：将所述步骤a中斜面上长势良好的菌体在无菌的环境中转接到LB液体培养基或者甘油液体培养基中，在25～37℃培养8～24小时，获得种子液，所述LB液体培养基和所述甘油液体培养基中均含有卡那霉素50～100mg/L和尼古丁0.5～1.5g/L；
步骤c、放大培养：将所述步骤b中的种子液按照体积比1％～5％接种量转接到LB液体培养基或者甘油液体培养基中，25～37℃下120～200rpm培养8～24小时到对数生长中期，所述LB液体培养基和所述甘油液体培养基中均含有50～100mg/L卡那霉素和0.5～1.5g/L尼古丁。
4.如权利要求1所述的生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于，所述步骤四中的菌体全细胞参与反应时的初始浓度是600nm下OD值为5～15个光密度；所述步骤一中的尼古丁在所述步骤四中参与反应时的初始浓度是1～5g/L；以上初始浓度均用水调制获得。
5.如权利要求1～4任一项所述的生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于，还包括步骤六：产物鉴定：将所述步骤五中获得的3-琥珀酰吡啶用高效液相色谱检测其纯度，用液相-质谱联用和核磁波谱的方法鉴定其结构。
6.如权利要求5所述的生物转化制备3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于，所述步骤四还包括反应期间每小时取样，用薄层层析或者高效液相色谱检测3-琥珀酰吡啶的生成情况；所述薄层层析的反应展层剂中氯仿:乙醇:甲醇:0.5M氢氧化钠的体积比为30:15:2:1.5；所述高效液相色谱的检测条件是：Agilent1100高效液相色谱仪配备XDB-C18色谱柱，流动相中0.1M硫酸:乙腈的体积比为85:15，流速为0.5mL/min，检测波长为254nm，柱温为30-℃；所述步骤六中的高效液相色谱的检测条件与所述步骤四中的高效液相色谱的检测条件相同。
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