CN100434512C - 一种恶臭假单胞菌制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种恶臭假单胞菌制剂，属微生物农药技术领域。该制剂由下列步骤得到：a.选用的生产菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)J5，CGMCCNO.1828；b.种子培养：将J5接种到液体NA培养基上，在28-30℃温度下培养48小时获得发酵种子；c.发酵罐发酵：将种子接种到装有牛肉膏0.5%、蛋白胨3%、氯化钠3%、K₂HPO₄ 1%、pH 7-7.5、消泡剂0.1%，其余为水的发酵罐中，在温度29-30℃、搅拌速度120-150rpm、通气量5-10%、发酵时间45-48小时的条件下得到制剂。该制剂具有烟碱降解率高，并能够提高烟草的品质，可用于降解烟草或烟草废弃物中的烟碱。

Description

一种恶臭假单胞菌制剂及其应用

技术领域：

本发明涉及一种恶臭假单胞菌制剂及其应用，属微生物农药技术领域。

背景技术：

尼古丁(俗称烟碱)是烟草生物碱中的主要成分，是影响烟叶品质的重要因素之一，也是烟草工业生产废水、废物中的主要有害成分。烟碱进入人体后90％被肺部吸收，进入血液6秒钟后即可到达大脑，严重影响人体的呼吸系统和交感神经。在香烟生产过程中，烟碱的含量过高会增加烟气的刺激性，影响卷烟吸味，安全性也差。如何把烟草的烟碱含量控制到人们所期望的范围，是烟草科技工作者和环境保护者研究的热点课题。降低烟草中的烟碱含量的方法通常利用农业操作在烟草生长过程中控制烟碱的含量和利用物化手段在烟草加工过程中降低烟叶中的烟碱含量，但由于以上方法操作性不强、效果不明显，国内外的研究正趋向于利用微生物降解烟碱。

微生物特别是细菌广泛存在于各种生态条件下，特定的环境孕育了特殊的微生物类群。早在20世纪三、四十年代就有关于从土壤中分离可代谢尼古丁微生物的报道。1947年Enders等就发现酵母菌可以降解烟碱，随后研究人员相继发现了许多可以降解烟碱的微生物如球形节杆菌(Arthrobacter globiformils)、烟草节杆菌(A.nicotianae)、噬烟碱节杆菌(A.nicotinovorans)、氧化节杆菌(A.oxydans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、棒杆菌菌(Corynebacterium sp.)、烟草微球菌(Micrococcus nicotianae)等。这些微生物多数是通过富集培养，然后以尼古丁为唯一碳氮源分离而得。

虽然目前微生物降解尼古丁的机理还不是十分明确，但国内外仍然有许多应用微生物活体降解烟碱的报道。烟草加工过程中产生的许多固态或液态废物主要含有大量的尼古丁等生物碱类有毒物质，平均含量达18000mg/kg干重。这些废物如不及时处理会给人们的生存和生活带来极大的危害。1997年Civilini等报道了采用P.putida和A.oxidans pAO1处理尼古丁废弃物的渗洗液，结果表明P.putida的处理效果最好。Brown&Williamson烟草公司利用纤维单胞菌来降低烟草中的烟碱和硝酸盐含量。结果显示，将经过处理的白肋烟和其它烟叶混合，与未经处理的白肋烟叶片相比，混合烟丝的硝酸盐含量从1.63％降至1.04％，烟碱从1.79％降至1.32％。将这些经过处理的混合烟丝制成卷烟后，烟气分析表明，硝酸盐、氰化氢和烟碱各降低了38.8％、19.7％和15.3％。由此可见，通过微生物手段降低尼古丁含量和消除污染在生产中具有很高的实际应用价值，其意义不但可以提高烟叶资源的利用率，取得丰厚的经济效益，而且还可以改善生态环境，获得显著的社会效益，利用微生物降解烟碱前景广阔。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种烟碱降解率高，并能够提高烟草品质的恶臭假单胞菌制剂及其应用。

本发明是这样实现的：

1、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)J5的获得

选自烟草叶片，烟叶样品研磨，稀释涂布平板，在M9+烟碱培养基：Na₂HPO₄12.8g、KH₂PO₄3.0g、NaCl 0.5g、NH₄Cl 0.5g、琼脂粉17g、烟碱10g、10.0g维生素B1 1μg/ml、pH自然，于28℃温度下培养2天，挑取能够在平板上健康生长的细菌菌落，其中有一菌落表现较好，定名为J5菌株。

对J5菌株进行生物学和生化试验，该菌营养琼脂平板需氧培养24h，细菌生长旺盛，菌落光滑，湿润，半透明淡黄色菌落，产生强烈的气味。革兰染色为阴性杆菌，极生多鞭毛，多数菌株鞭毛在三根以上。该菌专性好氧，呼吸型代谢，分解葡萄糖和木糖，利用枸橼酸酶，苯丙氨酸脱氢酶反应均为阴性。利用肌醇、氧化酶和细胞色素氧化酶阳性，精氨酸双水解酶阳性，不产生果聚糖，不水解明胶，不水解淀粉，水解七叶灵，蛋黄反应阴性，聚-β-羟基丁酸盐阴性，还原硝酸盐，羙红试验阴性，乙酰甲基甲醇试验阴性，吲哚试验阴性；4℃可生长，41℃不生长；适宜pH为7-8.5，pH在6以下不生长。

对该菌进行16SrDNA序列测定，GenBank注册号：DQ659138。通过序列比对和生化特性将J5鉴定为恶臭假单胞菌。

本发明所述的恶臭假单胞菌(J5)已于2006年10月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.1828，分类命名为：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。

2、制备恶臭假单胞菌制剂

a.发酵种子培养：将恶臭假单胞菌J5菌丝体接种到配方为牛肉膏3％、蛋白胨0.5％、氯化钠0.5％、琼脂1.5％、其余为蒸馏水、pH 7.0-7.2的培养基上，配方的比例为重量百分比，在28-30℃温度下培养48小时，获得发酵种子；

b.发酵罐发酵工艺：将a步骤获得的发酵种子接种到装有液体培养基配方：牛肉膏0.5％、蛋白胨3％、氯化钠3％、K₂HPO₄ 1％、pH 7-7.5、消泡剂0.1％，其余为水的发酵罐中，配方的比例为重量百分比，在发酵温度29-30℃、发酵罐转速120-150rpm、通气量5-10％、发酵时间45-48小时的条件下得到恶臭假单胞菌制剂。放入容器中避光保存，1星期内使用完毕。

本发明的恶臭假单胞菌制剂作为降解烟草或烟草废弃物中的烟碱的应用。

本发明的恶臭假单胞菌制剂具有烟碱降解率高，并能够提高烟草品质等优点。

附图说明：

附图为J 5在含有烟碱的液体中的生长和烟碱降解效果图(实施1)。

具体实施方式：

本发明实施例中培养基配方的比例均为重量百分比。

实施例1：(用于含烟碱液体)

制备恶臭假单胞菌制剂

a.发酵菌种培养：将恶臭假单胞菌J5菌丝体接种到配方为牛肉膏3％、蛋白胨0.5％、氯化钠0.5％、琼脂1.5％、其余为蒸馏水、pH 7.0的培养基上，在28℃温度下培养48小时，获得发酵菌种；

c.发酵工艺：将试管种接种到装有液体培养基配方：牛肉膏0.5％、蛋白胨3％、氯化钠3％、K₂HPO₄1％、pH 7、消泡剂0.1％，其余为水的三角瓶发酵中，在发酵温度29℃、发酵罐转速120rpm、通气量10％、发酵时间45小时的条件下得到恶臭假单胞菌制剂，放入容器中避光保存，1星期内使用完毕。

本发明的烟碱降解制剂的应用：将降烟碱降解制剂接种(接种量1％)到含有0.1％烟碱的M9液体中，30℃150rpm药瓶培养，每隔2小时取样检测溶液的烟碱含量，和代表菌体数量的溶液OD600值。应用结果见附图，降解12小时时烟碱含量为0，即应用制剂完全将溶液中的烟碱降解。

实施例2：(用于含烟碱液体)

基本同实施例1。不同之处为：试管种培养中：pH为7.2、温度30℃；发酵工艺中：pH为7.5、发酵温度30℃、发酵罐转速150rpm、通气量5％、发酵时间48h小时。

实施例3：(用于烤烟烟叶处理)

恶臭假单胞菌制剂的制备基本同实施例1。不同之处为：试管种培养中：pH为7.1、温度29.℃；发酵工艺中：pH为7.3、发酵温度29.5℃、发酵罐转速130rpm、通气量8％、发酵时间46小时。

本发明的烟碱降解制剂的应用：将本发明的制剂用水稀释10倍，放入长×宽×高为1.5m×0.5m×1m的水泥池中。将成熟好的烟叶采收后编杆。编杆后的烟叶放入含有菌剂的池中浸泡均匀，取出，自然流失掉多余的溶液，然后装入烤房中，按常规的烘烤方法进行烘烤。烘烤后的烟叶进行烟碱的检测，结果表明，本发明的烟碱降解制剂可以降低28％的烤烟烟碱。

使用本发明制剂后的烤烟的烟叶感官质量评吸结果表明：烟叶的劲头明显降低，香气质和香气量有不同程度改善；刺激性明显减弱，杂气明显减轻。

Claims (2)

1、一种恶臭假单胞菌制剂，由生产菌株经发酵种子培养、发酵罐发酵后得到，其特征在于该制剂由下列步骤得到：

a.选用的生产菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)J5，CGMCCN0.1828；

b.发酵种子培养：将恶臭假单胞菌J5菌丝体接种到配方为牛肉膏3％、蛋白胨0.5％、氯化钠0.5％、琼脂1.5％、其余为蒸馏水、pH 7.0-7.2的培养基上，配方的比例为重量百分比，在28-30℃温度下培养48小时，获得发酵种子；

c.发酵罐发酵工艺：将步骤b获得的发酵种子接种到装有液体培养基配方：牛肉膏0.5％、蛋白胨3％、氯化钠3％、K₂HPO₄ 1％、pH 7-7.5、消泡剂0.1％，其余为水的发酵罐中，配方的比例为重量百分比，在发酵温度29-30℃、发酵罐转速120-150rpm、通气量5-10％、发酵时间45-48小时的条件下得到恶臭假单胞菌制剂。

2、权利要求1所述恶臭假单胞菌制剂，其特征在于该制剂用于降解烟草或烟草废弃物中的烟碱。