CN101993844B - 一种降解烟碱的微生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降解烟碱的微生物及其应用，所述的微生物名称为摩氏摩根氏菌F4(Morganella morganii F4)，保藏编号为CGMCC No.3999。将摩氏摩根氏菌F4配制成菌悬液，按烟叶重量的5-15％接种于25-35℃、培养5-10d；或按烟叶浸提液体积的10-20％或烟草废弃物浸提液体积的10-20％接种，在25-35℃，pH6.5-7.5条件下，120-180r/min摇床培养5-10d。可使其中的烟碱分别降解56-68％、80-91％、84-96％。利用本发明降解烟碱不仅周期短、负面作用小，而且提高烟叶可利用性和资源利用率、降低了烟草废弃物中的烟碱含量，减少了环境污染，因而在烟草加工、环保等方面具有较广的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种降解烟碱的微生物摩氏摩根氏菌F4(Morganella morganii F4)以及利用该微生物降解烟叶、烟叶浸提液和烟草废弃物浸提液中烟碱的方法，属于微生物应用技术领域。
背景技术
烟碱又名尼古丁，是烟草中普遍存在的一种生物碱，也是卷烟和烟叶中的主要危害成分(包括烟碱、蛋白质、果胶、TSNA等)之一。它对人的中枢神经有强烈的麻痹和刺激作用，少量使用可使人产生兴奋，大量使用则会引起头晕、呕吐、中毒症状，一次摄入量过多会有致命的危险，在吸烟过程中烟碱还会被亚硝化，生成烟草中特有的强烈的致癌剂N-亚硝胺，它是烟叶和烟气中主要致癌成分，也是烟草中特有的亚硝胺的重要前提物质，对烟民身体健康有严重影响。随着人们对自身健康的日益关注及环保意识的逐渐增强，从世界范围来看，大部分卷烟企业的卷烟都向低焦油和低烟碱的淡味卷烟方向发展对烟民身体健康构成威胁。
我国的烟叶生产量平均约占世界总量的35％，卷烟产量约占世界总量的32％，现阶段吸烟人口约占世界总吸烟人口的25％，总数高达3.5亿人。这些数据都稳居世界第一位。但中国卷烟出口总量只占世界份额的1.8％，烟叶出口总量占世界份额的3.5％，且中国的烟草行业结构以及产品、品牌结构也与大国身份很不相称。这与我国部分烟草的质量偏低有着一定关系。部分烟草的烟碱含量偏高是导致其质量偏低的一个方面，如我国烤烟烟碱平均含量在3％-4％，白肋烟高达6％，而正常情况下烤烟应低于3％，白肋烟应在2％-4％。这导致我国高烟碱含量的烟叶大量积压，从而给企业和国家带来了巨大的经济损失，并造成资源浪费，严重影响了我国卷烟产业的发展。此外，在烟草生产加工的一系列过程中，会产生大量烟碱浓度较高的固、液、气态有毒的危险废物，未经处理就直接排放会造成严重的环境污染。
通过农业种植、化学浸提等途径可以降低烟草中烟碱含量，但是这些方法的周期很长或者负面作用大影响其在降解烟草中烟碱的应用。微生物在烟叶及土壤中广泛存在，易于从中筛选能高效降解烟草中烟碱的菌株，在提高烟叶品质、降低烟碱含量、提高资源利用率方面具有重大意义和广泛的发展应用前景。是解决烟草中烟碱对人体、工农业生产及环境带来危害的途径之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的部分烟叶、烟叶浸提液和烟草废物浸提液中的烟碱含量偏高的缺陷，提供一种能降解烟碱的微生物，并利用该微生物降低烟叶、烟叶浸提液和烟草废物浸提液中的烟碱含量、提高烟叶可利用性、降低烟草废弃物中的烟碱含量，减少环境污染的方法。
为解决上述技术问题，本发明使用以下技术方案：
一种降解烟碱的微生物名称为摩氏摩根氏菌F4(Morganella morganiiF4)，保藏编号为CGMCC NO.3999。
上述的降解烟碱的微生物的应用在于将摩氏摩根氏菌F4配制成菌悬液，按烟叶重量的5-15％或烟叶浸提液体积的10-20％或烟草废弃物浸提液体积的10-20％接种，于25-35℃、培养5-10d。在烟叶浸提液或烟草废弃物浸提液接种后，同时在pH6.5-7.5(用HCl或者NaOH调节pH)条件下，120-180r/min摇床培养。
所述的摩氏摩根氏菌F4菌悬液的制备方法为：在烟碱培养基中培养2d，然后将培养液10000r/min离心10min，收集菌体，用50Mm，pH7.0PBS将离心后的菌体配制成菌悬液。
所述的烟碱培养基配方：Nicotine 0.5-1.5g，K2HPO4 12-15g，KH2PO4 3-5g，MgSO4·7H2O0.1-0.3g，微量元素溶液0.3-0.6mL，调pH至7.0，分装，灭菌；所述的微量元素溶液是将MnSO4·7H2O 0.3-0.5g，CaCl2·2H2O 0.1-0.3g，FeSO4·7H2O 0.1-0.3g，用0.1mol/L HCl溶解并定容至100ml。
所述的烟碱培养基配方优选为：Nicotine 1.0g，K2HPO4 13.3g，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O0.2g，微量元素溶液0.5mL，调pH至7.0，分装，灭菌；所述的微量元素溶液是将MnSO4·7H2O0.4g，CaCl2·2H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.2g，用0.1mol/L HCl溶解并定容至100ml。
在上述烟碱培养基中培养摩氏摩根氏菌F4的条件为：在室温下接种，于25-35℃下，在120-180rpm摇床中培养，优选150rpm摇床中培养。
所述的烟草废弃物浸提液是将烟草废弃物与水按照1∶5的体积比例混合后浸泡12h，调节pH为7.0。
所述的烟叶浸提液是将烟叶与水按照1∶5的体积比例混合后浸泡12h，调节pH为7.0。
所述的摩氏摩根氏菌F4的获得方法为：
称取4.0g附着在烟草根部的土样，加入到36mL 0.85％的无菌生理盐水的三角瓶中，常温振荡30min后澄清10min，得到10-1倍菌液；取1mL 10-1倍菌液的上清液，加入到含有9mL0.85％无菌生理盐水的试管中，摇匀，即得10-2倍的菌液；同理制取10-3倍的菌液。取0.1mL10-1、10-2与10-3倍菌液，分别涂布于已制好的选择性培养基平板，30℃下培养4d。挑选单个菌落进一步划线分离，重复操作，直到获得纯单一菌株并编号。将初筛得到的纯菌株分别接入装有5mL液体烟碱培养基的试管中，摇床震荡培养2d，制备菌液。再将各菌株菌液加入装有50mL液体烟碱培养基的三角瓶中，每菌株两个平行，于30℃，200r/min的摇床振荡培养，以50mL未加烟碱的液体培养基作为空白，每2d测一次培养液中的烟碱含量，判定菌株降解烟碱的能力。
菌株F4在营养琼脂平板上生长良好，菌落圆形、边缘整齐，呈乳白色的奶油状，表面光滑湿润，凸起，不透明(如图1所示)。是杆菌，两端钝圆，无芽孢无荚膜(如图2所示)。其生理生化特性如下：
表1F4的生理生化特性
注：M.morganii为标准菌株数据；“+”表示试验结果为阳性，“-”表示试验结果为阴性，“N”表示未做此项试验
将生化鉴定结果提交到细菌筛选与鉴定系统(Bacterial Screening and Identification System，BaSIS)中得到初步鉴定结果(见表1)：系统显示菌株F4是摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)的可能性为83.76％，相似性为100％。再将F4与摩氏摩根氏菌的标准菌株的理化特征进行对照，基本可以确定F4为摩氏摩根氏菌。
表1
BaSIS
本发明的有益效果：
本发明从烟草土壤中分离一株降解烟碱的细菌摩氏摩根氏菌F4，利用其可使烟叶的烟碱降解56-68％；烟叶浸提液中的烟碱降解80-91％，烟草废物浸提液中的烟碱降解84-96％。与现有的利用农业种植、化学浸提等途径来降低烟草中烟碱含量的方法相比，这种利用微生物降解烟草或者烟草浸提液中烟碱的方法不仅周期短、负面作用小，而且提高烟叶可利用性和资源利用率、降低了烟草废弃物中的烟碱含量，减少了环境污染，因而具有较广的应用前景。
摩氏摩根氏菌F4(Morganella morganiiF4)，
保藏日期：2010年7月7日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
保藏编号为CGMCC NO.3999。
附图说明
图1为F4的平板培养特征照片；
图2为显微镜下F4的个体形态(1000×)照片。
具体实施方式：
下面结合实施例进一步说明本发明，而非限制本发明。
烟碱降解率的检测：
配制一系列有浓度梯度的含有烟碱的溶液，在紫外可见分光光度计上测烟碱的吸光度值，得到吸光度值和烟碱浓度的线性相关曲线。
在50ml液体烟碱培养基中接入菌株F4前，取少许培养液于10000r/min下离心后取上清液稀释到合适浓度，测烟碱的吸光度值并换算成烟碱的浓度，在接入菌株F4后每隔2d按同样的操作测培养液中的烟碱吸光度值，通过与标准曲线对比算出烟碱的降解率。
烟碱降解率的计算过程：
烟碱降解率＝100％×(C0-C1)/C0
C0：接入菌株F4前液体烟碱培养基中烟碱浓度；
C1：接入菌株F4后某天液体烟碱培养基中烟碱浓度。
实施例1
将摩氏摩根氏菌F4接种到优选烟碱培养基中，在150转摇床中培养2d，然后将培养液10000r/min离心10min，收集菌体，用50Mm，pH7.0PBS将离心后的菌体配制成菌悬液。以5-15％的接种量将菌悬液接种到含水量为10-20％的烟叶中于25-35℃发酵5-10d，烟碱降解率为56-68％。
实施例2
将摩氏摩根氏菌F4接种到优选烟碱培养基中，在150转摇床中培养2d，然后将培养液10000r/min离心10min，收集菌体，用50Mm，pH7.0PBS将离心后的菌体配制成菌悬液。以10-20％的接种量将菌悬液接种到烟叶浸提液(烟叶与水按照1∶5的比例混合后浸泡12h，调节pH为7.0)中于pH6.5-7.5，25-35℃摇床培养5-10d，烟碱降解率为80-91％。
实施例3
将摩氏摩根氏菌F4接种到优选烟碱培养基中，在150转摇床中培养2d，然后将培养液10000r/min离心10min，收集菌体，用50Mm，pH7.0PBS将离心后的菌体配制成菌悬液。以10-20％的接种量接种到烟草废物浸提液(烟草废弃物与水按照1∶5的比例混合后浸泡12h，调节pH为7.0)中于pH6.5-7.5，25-35℃摇床培养5-10d，烟碱降解率为84-96％。
Claims (3)
1.一种降解烟碱的微生物，其特征在于：所述的微生物名称为摩氏摩根氏菌F4(Morganellamorganii F4)，保藏编号为CGMCC NO.3999。
2.权利要求1所述的降解烟碱的微生物的应用方法，其特征在于：将摩氏摩根氏菌F4配制成菌悬液，按烟叶重量的5-15％或烟叶浸提液体积的10-20％或烟草废弃物浸提液体积的10-20％接种，于25-35℃、培养5-10d，所述的烟叶是含水量为10-20％的烟叶，所述的烟草废弃物浸提液是将烟草废弃物与水按照1∶5的体积比例混合后浸泡12h，调节pH为7.0，所述的烟叶浸提液是将烟叶与水按照1∶5的体积比例混合后浸泡12h，调节pH为7.0。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于：所述的摩氏摩根氏菌F4菌悬液的制备方法为：在烟碱培养基中培养2d，然后将培养液10000r/min离心10min，收集菌体，用50Mm，pH7.0PBS将离心后的菌体配制成菌悬液；所述的烟碱培养基配方：Nicotine 1.0g，K2HPO413.3g，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量元素溶液0.5mL，调pH至7.0，分装，灭菌；所述的微量元素溶液是将MnSO4·7H2O 0.4g，CaCl2·2H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.2g，用0.1mol/L HCl溶解并定容至100ml。
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