CN108056495B - 一种微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，先利用烟碱降解微生物降解烟草浸提液中的烟碱，以降低烟草浸提液中的烟碱含量，从而改善烟草浸提液的环境，提高分枝杆菌的耐受性；再加入甾醇降解微生物，利用其甾醇降解能力，降低烟草浸提液中的甾醇含量。实验证明，采用本发明微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的效果远远优于采用单一微生物(分枝杆菌)降解烟草浸提液甾醇的效果，其中，豆甾醇、胆甾醇、β‑谷甾醇的降解率分别提高79.1％、47.0％、65.2％，是一种针对性较强的生物减害技术。
Description
技术领域
本发明属于烟草生物技术及烟草减害领域，涉及一种降解烟草中甾醇类化合物的方法，特别涉及一种微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法。
背景技术
烟草中甾醇类化合物主要有豆甾醇、β-谷甾醇、胆甾醇以及菜油甾醇，霉变的烟草中还含有麦角甾醇，在烟草中的总含量约为0.1-0.3％。烟草甾醇类化合物在热解时可形成苯并(a)芘有害物质，因此减少烟草中的甾醇类化合物对烟草减害具有重要的意义。甾醇是烟气中苯并(a)芘的前体化合物，已经确认为严重致癌物质之一。因此，研究开发烟草中甾醇类化合物的降解途径及方法，对于减少烟草危害、提高烟草品质具有重要的应用价值和意义。然而，从已有研究报道来看，关于烟草甾醇的分离、热裂解分析、危害性评价有一定的研究，但缺乏烟草甾醇的生物降解方法以及降解过程工艺的研究。
分枝杆菌种类繁多，其中新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)是一类可以高效降解甾醇的微生物。其降解甾醇最终的产物为水和CO2，这两类产物不会对烟草薄片本身的性质和质量产生影响。采用微生物法降解烟草薄片中的甾醇含量具有绿色、环保、目的性强以及降解效率高的优点。但是很多研究发现分枝杆菌虽然可以在烟草浸提液中繁殖，但生长速率慢，甾醇降解效率低。这可能与烟草浸提液中的复杂环境有一定的关系。因此如何有效提高分枝杆菌对烟草中甾醇类化合物的降解效率成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，该方法能够有效提高烟草中甾醇类化合物的降解效果。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，先利用烟碱降解微生物降解烟草浸提液中的烟碱，以降低烟草浸提液中的烟碱含量；再加入甾醇降解微生物降解烟草浸提液中的甾醇类化合物，以降低烟草浸提液中的甾醇类化合物含量。
所述的微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，具体包括以下步骤：
(1)取烟草制品加水浸提，再进行固液分离，得到的液体即为烟草浸提液；
(2)向烟草浸提液中加入烟碱降解微生物菌液，发酵，以降低烟草浸提液中的烟碱含量，使烟碱含量少于0.5g/L；
(3)向步骤(2)的烟草浸提液中加入分枝杆菌静息细胞液，发酵，以降低烟草浸提液中的甾醇类化合物含量。
步骤(1)中的烟草制品为烟叶、烟梗、烟末中至少一种。
步骤(1)中的加水量为烟草制品重量的20-30倍。
步骤(1)中的浸提条件为：温度50-60℃，时间50-70min。
步骤(1)中的固液分离为经过200目的筛网。
步骤(2)中的烟碱降解微生物为节杆菌、假单胞菌，菌液中菌种的浓度为109个/mL。
步骤(2)中的发酵条件为：接种量10-15％，温度25-32℃，转速150-250rpm。
步骤(3)中的分枝杆菌为Mycobacterium neoaurum ATCC 25795，细胞液中静息细胞浓度为109个/mL。
步骤(3)中的发酵条件为：接种量10-15％，温度35-37℃，转速150-250rpm，时间45-50h。
本发明首先利用烟碱降解微生物去除烟草浸提液中的部分烟碱，从而提高分枝杆菌在浸提液中的耐受性，再利用其甾醇降解能力，降低烟草浸提液中的甾醇含量，是一种针对性较强的生物减害技术。实验证明，采用本发明微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的效果远远优于采用单一微生物(分枝杆菌)降解烟草浸提液甾醇的效果，其中，豆甾醇、胆甾醇、β-谷甾醇的降解率分别提高79.1％、47.0％、65.2％。
附图说明
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为烟草浸提液原样品中的烟碱含量气质图(保留时间为0.96min时是烟碱，保留时间为2.093min时为内标正己烷)。
图2为烟草浸提液经节杆菌降解发酵后的烟碱含量气质图(保留时间为0.96min时是烟碱，保留时间为2.093min时为内标正己烷)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1、节杆菌和分枝杆菌的培养
1.1节杆菌
(1)节杆菌生长培养基：牛肉膏5g、蛋白陈10g、NaCl 5g、烟碱2g、琼脂15g，加水定容至1L，调节pH至7.0，121℃灭菌20min。
(2)节杆菌菌液：将节杆菌的种子液以10％接种量接种到生长培养基中，30℃，200rpm下培养24h，得到节杆菌菌液，菌液中节杆菌浓度为109个/mL。
1.2分枝杆菌
(1)分枝杆菌液体生长培养基：葡萄糖10.0g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NH4NO32g、柠檬酸铁胺0.05g、柠檬酸2.0g、甘油5.0g，加水定容至1L，调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min(制备固体平板培养基再加入液体生长培养基质量分数2％的琼脂)。
(2)分枝杆菌静息细胞液：将冷冻保存的分枝杆菌(Mycobacterium neoaurumATCC25795)种子接种到固体培养基上，37℃下培养48h后，挑取单菌落转接到液体生长培养基中，培养36h后，再转接一次(2％接种量)，培养36h，获得分枝杆菌静息细胞液，细胞液中静息细胞浓度为109个/mL。
实施例2
本发明微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，包括以下步骤：
(1)取烟梗烟末各30g，用20倍重量的水，在55℃下浸提1h，再经过200目的筛网进行固液分离，得到的液体即为烟草浸提液；
(2)按照10％的接种量，在烟草浸提液中加入节杆菌菌液，在30℃，200rpm下发酵，以降低烟草浸提液中的烟碱含量，使烟碱含量少于0.5g/L；
(3)按照10％的接种量，向步骤(2)的烟草浸提液中加入分枝杆菌静息细胞液，在37℃，200rpm下发酵48h，以降低烟草浸提液中的甾醇类化合物含量。
实施例3
本发明微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，包括以下步骤：
(1)取烟叶30g，用30倍重量的水，在50℃下浸提70min，再经过200目的筛网进行固液分离，得到的液体即为烟草浸提液；
(2)按照12％的接种量，在烟草浸提液中加入节杆菌菌液，在25℃，250rpm下发酵，以降低烟草浸提液中的烟碱含量，使烟碱含量少于0.5g/L；
(3)按照12％的接种量，向步骤(2)的烟草浸提液中加入分枝杆菌静息细胞液，在35℃，250rpm下发酵50h，以降低烟草浸提液中的甾醇类化合物含量。
实施例4
本发明微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，包括以下步骤：
(1)取烟叶60g，用25倍重量的水，在60℃下浸提50min，再经过200目的筛网进行固液分离，得到的液体即为烟草浸提液；
(2)按照15％的接种量，在烟草浸提液中加入节杆菌菌液，在32℃，150rpm下发酵，以降低烟草浸提液中的烟碱含量，使烟碱含量少于0.5g/L；
(3)按照15％的接种量，向步骤(2)的烟草浸提液中加入分枝杆菌静息细胞液，在37℃，150rpm下发酵45h，以降低烟草浸提液中的甾醇类化合物含量。
烟草浸提液的检测分析
1、烟碱降解
取1mL实施例2步骤(1)的烟草浸提液，通过正己烷多次萃取后，用气相测定烟草浸提液中的烟碱含量，根据烟碱标准曲线确定浸提液中的烟碱含量为1.26g/L(图1)。
取1mL实施例2步骤(2)的烟草浸提液，通过正己烷多次萃取后，用气相测定烟草浸提液中的烟碱含量，根据烟碱标准曲线确定浸提液中烟碱含量降低为0.42g/L(图2)。
结果证明，本发明加入节杆菌达到有效降低烟草浸提液中烟碱含量的目的。
2、甾醇降解
空白对照组：取实施例2步骤(1)的烟草浸提液200mL，加入分枝杆菌静息细胞液(接种量10％)，在37℃，200rpm下发酵48h，并测定空白对照组烟草浸提液的起始甾醇浓度和最终甾醇浓度。
样品组：取实施例2步骤(1)的烟草浸提液200mL，按照实施例2步骤(2)、(3)的方法进行处理，并测定样品组烟草浸提液的起始甾醇浓度和最终甾醇浓度。
结果见表1。
表1微生物组合法与单一微生物降解烟草浸提液甾醇的差异性
表1结果表明，样品组的甾醇类化合物的降解率明显高于空白对照组，说明本发明对烟草浸提液中的烟碱进行降解能够改善烟草浸提液的环境，提高分枝杆菌的耐受性，有助于分枝杆菌对烟草浸提液中甾醇类化合物的降解。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）取烟草制品加水浸提，再进行固液分离，得到的液体即为烟草浸提液；
（2）向烟草浸提液中加入烟碱降解微生物菌液，发酵，以降低烟草浸提液中的烟碱含量，使烟碱含量少于0.5 g/L；其中发酵条件为：接种量10-15%，温度25-32℃，转速150-250rpm；烟碱降解微生物为节杆菌、假单胞菌；菌液中菌种的浓度为109个/mL；
（3）向步骤（2）的烟草浸提液中加入分枝杆菌静息细胞液，发酵，以降低烟草浸提液中的甾醇类化合物含量；其中发酵条件为：接种量10-15%，温度35-37℃，转速150-250rpm，时间45-50h；分枝杆菌为Mycobacterium neoaurum ATCC 25795，细胞液中静息细胞浓度为109个/mL。
2.根据权利要求1所述的微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，其特征在于，步骤（1）中的烟草制品为烟叶、烟梗、烟末中至少一种。
3.根据权利要求1所述的微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，其特征在于，步骤（1）中的加水量为烟草制品重量的20-30倍。
4.根据权利要求1所述的微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，其特征在于，步骤（1）中的浸提条件为：温度50-60℃，时间50-70min。
5.根据权利要求1所述的微生物组合法降解烟草中甾醇类化合物的方法，其特征在于，步骤（1）中的固液分离为经过200目的筛网。
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