CN109161569B - 一种微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法，是在烟草浸提物中依次加入烟碱降解菌和细菌纤维素生产菌，组合发酵。本发明的的核心在于通过两种微生物组合发酵，利用烟碱降解菌降解烟草浸提物中的烟碱，去除了烟碱对木醋杆菌发酵能力的限制，从而有效提高了细菌纤维素的产量。与直接采用细菌纤维素生产菌发酵烟草浸提物相比，本发明细菌纤维素的产量提高1倍多，该方法可以更充分利用烟草浸提物中的底物来合成更高产量的细菌纤维素，在细菌纤维素生产领域具有良好的应用前景，具有很好的经济效益。

Description

一种微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法，属于烟草生物技术及发酵工程领域。
背景技术
细菌纤维素因其具有优良的特性，被广泛应用于包括医疗、造纸及食品等领域。目前用于生产细菌纤维素的原料包括椰子汁、葡萄、西瓜汁以及菊糖等。这些原料量大而且价格优廉，在降低发酵生产细菌纤维成本上具有明显的优势。但是，关于利用烟草原料作为微生物发酵原料来生产细菌纤维素的报道相对较少。在大量在我国，每年有超过90万吨的烟草废弃物，其中有很大一部分无法得到合理的处理，给环境造成了很大的压力。将烟草废弃物作为微生物发酵原料生产各种化学产品或高附加值的产品，将会是该领域内的一个重要方向。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法，可以有效促进细菌纤维素生产菌对烟草浸提物的利用，大幅提高细菌纤维素产量。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法，是在烟草浸提物中依次加入烟碱降解菌和细菌纤维素生产菌，组合发酵。
具体方法为：将烟草原料加水浸提后，加入烟碱降解菌种子液，震荡培养1-2天后，加入细菌纤维素生产菌种子液，静置培养1天，再震荡培养1天，最后静置培养3-7天。
烟草原料和水的重量比为1：6-10；培养温度为28-30℃。
更进一步的具体方法为：
(1)将烟草原料加水在50-60℃下浸提1-2h，冷却至室温；
(2)将烟碱降解菌种子液按照8-15％的接种量接种到步骤(1)的烟草浸提物中，在28-30℃，150-200rpm条件下震荡培养1-2天，获得发酵液；
(3)将细菌纤维素生产菌种子液按照10％的接种量接种到步骤(2)的发酵液中，先在28-30℃条件下静置1天，然后在28-30℃、150-200rpm条件下震荡培养1天；
(4)将步骤(3)震荡培养1天后的发酵液，在28-30℃条件下静置培养3-7天后，收集发酵产物细菌纤维素。
烟碱降解菌为嗜烟碱节杆菌。
细菌纤维素生产菌为木醋杆菌。
嗜烟碱节杆菌种子液的制备方法为：将嗜烟碱节杆菌接种到种子培养基中，在30℃，180rpm条件下震荡培养24h，获得嗜烟碱节杆菌种子液，种子液中活菌数为109个/mL。
种子培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，烟碱2g，琼脂15g，定容至1L，调节pH7.0，121℃灭菌20min。
木醋杆菌种子液的制备方法为：将木醋杆菌接种到种子培养基中，在30℃条件下静置培养3天，获得木醋杆菌种子液，种子液中活菌数为109个/mL.
种子培养基：葡萄糖100g，酵母浸膏10g，去离子水定容至1L，调节pH 7.2，121℃灭菌20min。
本发明有益效果：
烟草浸提物中含有多种糖类物质，部分细菌纤维素生产菌(木醋杆菌)可以利用这些糖类物质合成纳米材料细菌纤维素，本发明的的核心在于通过两种微生物组合发酵，利用烟碱降解菌降解烟草浸提物中的烟碱，去除了烟碱对木醋杆菌发酵能力的限制，从而有效提高了细菌纤维素的产量。与直接采用细菌纤维素生产菌发酵烟草浸提物相比，本发明细菌纤维素的产量提高1倍多，该方法可以更充分利用烟草浸提物中的底物来合成更高产量的细菌纤维素，在细菌纤维素生产领域具有良好的应用前景，具有很好的经济效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
嗜烟碱节杆菌种子液的制备方法为：将嗜烟碱节杆菌Z3接种到种子培养基中，在30℃，180rpm条件下震荡培养24h，获得嗜烟碱节杆菌种子液，种子液中活菌数为109个/mL；种子培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，烟碱2g，琼脂15g，定容至1L，调节pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
木醋杆菌种子液的制备方法为：将木醋杆菌ATCC 23767接种到种子培养基中，在30℃条件下静置培养3天，获得木醋杆菌种子液，种子液中活菌数为109个/mL；种子培养基：葡萄糖100g，酵母浸膏10g，去离子水定容至1L，调节pH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例1：以产细菌纤维素的木醋杆菌为例，结合嗜烟碱节杆菌进行发酵烟草浸提物生产细菌纤维素，具体步骤如下：
(1)将烟草原料中加入6倍重量的水，在55℃下浸提1h，冷却至室温；
(2)将嗜烟碱节杆菌种子液按照10％的接种量接种到步骤(1)的烟草浸提物中，在28-30℃，180rpm条件下震荡培养1天，获得发酵液；
(3)将木醋杆菌种子液按照10％的接种量接种到步骤(2)的发酵液中，先在28-30℃条件下静置1天，然后转入28-30℃、180rpm的震荡培养箱中进行震荡培养1天；
(4)将步骤(3)震荡培养1天后的发酵液，在28-30℃条件下静置培养5天后，收集发酵产物细菌纤维素。
实施例2：以产细菌纤维素的木醋杆菌为例，结合嗜烟碱节杆菌进行发酵烟草浸提物生产细菌纤维素，具体步骤如下：
(1)将烟草原料中加入8倍重量的水，在50℃下浸提2h，冷却至室温；
(2)将嗜烟碱节杆菌种子液按照8％的接种量接种到步骤(1)的烟草浸提物中，在28-30℃，150rpm条件下震荡培养2天，获得发酵液；
(3)将木醋杆菌种子液按照18％的接种量接种到步骤(2)的发酵液中，先在28-30℃条件下静置1天，然后转入28-30℃、150rpm的震荡培养箱中进行震荡培养1天；
(4)将步骤(3)震荡培养1天后的发酵液，在28-30℃条件下静置培养3天后，收集发酵产物细菌纤维素。
实施例3：以产细菌纤维素的木醋杆菌为例，结合嗜烟碱节杆菌进行发酵烟草浸提物生产细菌纤维素，具体步骤如下：
(1)将烟草原料中加入10倍重量的水，在60℃下浸提1h，冷却至室温；
(2)将嗜烟碱节杆菌种子液按照15％的接种量接种到步骤(1)的烟草浸提物中，在28-30℃，200rpm条件下震荡培养1天，获得发酵液；
(3)将木醋杆菌种子液按照15％的接种量接种到步骤(2)的发酵液中，先在28-30℃条件下静置1天，然后转入28-30℃、200rpm的震荡培养箱中进行震荡培养1天；
(4)将步骤(3)震荡培养1天后的发酵液，在28-30℃条件下静置培养7天后，收集发酵产物细菌纤维素。
对照例1：以木醋杆菌为例，直接用于烟草浸提物进行发酵生产细菌纤维素，具体步骤如下：
(1)将烟草原料中加入6倍重量的水，在55℃下浸提1h，冷却至室温；
(2)将木醋杆菌种子液按照10％的接种量接种到步骤(1)的烟草浸提物中，先在28-30℃条件下静置1天，然后转入28-30℃、180rpm的震荡培养箱中进行震荡培养1天，获得发酵液；
(3)将步骤(2)震荡培养1天后的发酵液，在28-30条件℃下静置培养5天后，收集发酵产物细菌纤维素。
对照例2：以不产细菌纤维素的嗜烟碱节杆菌为例，发酵烟草浸提物确定其对细菌纤维素产量的影响，具体步骤如下：
(1)将烟草原料中加入6倍重量的水，在55℃下浸提2h，冷却至室温；
(2)将嗜烟碱节杆菌种子液按照10％的接种量接种到步骤(1)的烟草浸提物中，先在28-30℃条件下静置1天，然后转入28-30℃、180rpm的震荡培养箱中进行震荡培养1天，获得发酵液；
(3)将步骤(2)震荡培养1天后的发酵液，在28-30条件℃下静置培养5天后，收集发酵产物。
产量比较：
将实施例1和对照例1、2收集的发酵产物用去离子水先洗涤1-2遍，然后再用质量分数0.1％的NaOH洗涤3-4次，再用去离子水反复洗涤到pH＝7.0，获得相应的细菌纤维素膜，干燥后称量为最终的细菌纤维素重量。
表1 木醋杆菌在不同烟草浸提物中的细菌纤维素产量对比
组别 细菌纤维素产量(g/L)
实施例1 7.2
对照例1 3.3
对照例2 0
上表结果表明，利用烟碱降解菌降解烟草浸提物中的烟碱后，可以有效促进细菌纤维素生产菌对烟草浸提物的利用，并大幅提高细菌纤维素产量，与直接接种细菌纤维素生产菌到烟草浸提物中相比，细菌纤维素的产量提高1倍多。而单独利用嗜烟碱节杆菌发酵烟草浸提物无法生产细菌纤维。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法，其特征在于，具体方法为：
（1）将烟草原料加水在50-60℃下浸提1-2 h，冷却至室温；烟草原料和水的重量比为1：6-10；
（2）将烟碱降解菌嗜烟碱节杆菌种子液按照8-15%的接种量接种到步骤（1）的烟草浸提物中，在28-30℃，150-200 rpm条件下震荡培养1-2天，获得发酵液；
（3）将细菌纤维素生产菌木醋杆菌种子液按照10%的接种量接种到步骤（2）的发酵液中，先在28-30℃条件下静置1天，然后在28-30℃、150-200 rpm条件下震荡培养1天；
（4）将步骤（3）震荡培养1天后的发酵液，在28-30℃条件下静置培养3-7天后，收集发酵产物细菌纤维素。
2.根据权利要求1所述的微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法，其特征在于，嗜烟碱节杆菌种子液的制备方法为：将嗜烟碱节杆菌接种到种子培养基中，在30℃，180 rpm条件下震荡培养24h，获得嗜烟碱节杆菌种子液，种子液中活菌数为109个/mL。
3.根据权利要求2所述的微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法，其特征在于，种子培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10g，NaCl 5g，烟碱2 g，琼脂15 g，定容至1L，调节pH7.0，121℃灭菌20 min。
4.根据权利要求1所述的微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法，其特征在于，木醋杆菌种子液的制备方法为：将木醋杆菌接种到种子培养基中，在30℃条件下静置培养3天，获得木醋杆菌种子液，种子液中活菌数为109个/mL.
5.根据权利要求4所述的微生物组合发酵烟草浸提物生产细菌纤维素的方法，其特征在于，种子培养基：葡萄糖 100 g，酵母浸膏 10g，去离子水定容至1 L，调节pH 7.2，121℃灭菌20 min。
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