CN101525579B

CN101525579B - 用于烟叶烟碱降解的假单胞菌zcj菌株及其筛选方法和应用

Info

Publication number: CN101525579B
Application number: CN2009100975369A
Authority: CN
Inventors: 舒明; 杨君; 钟卫鸿; 朱晨静; 朱申康; 朱雪娜
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; China Tobacco Zhejiang Industrial Co Ltd
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; China Tobacco Zhejiang Industrial Co Ltd
Priority date: 2009-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2029-04-09
Also published as: CN101525579A

Abstract

本发明涉及生物降解烟叶烟碱的技术，尤其涉及一种用于烟叶烟碱降解的假单胞菌ZCJ菌株及其筛选方法和应用。该假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)已经于2009年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO.M 209064。本发明还公开了上述的菌株的筛选和应用。本发明从烟叶原料中筛选出的烟碱降解菌株，该菌株具有较高生物活性，适用于固态的烟叶烟碱的降解，达到降低烟叶烟碱的目的。

Description

用于烟叶烟碱降解的假单胞菌ZCJ菌株及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及生物降解烟叶烟碱的技术，尤其涉及一种用于烟叶烟碱降解的假单胞菌ZCJ菌株及其筛选方法和应用。

背景技术

受天气、气候以及栽培等因素的影响，烟叶的烟碱(尼古丁)含量存在一定的波动性，易导致卷烟内在质量的不稳定性。同时，相对于降低焦油和烟气有害成分而言，烟草中烟碱(尼古丁)的降低尚未取得突破性的进展。

相对于农业田间管理降低烟碱方法而言，微生物易于培养，降解烟碱的见效快，而且有选择性和可控制性，对香烟品质还会产生其他有益的作用；但是迄今已发现的微生物降解菌的烟碱降解能力不是很强，耐受烟碱浓度较低，影响了其在生产中应用。因而筛选较高活性尼古丁降解菌种，选择合适的生物反应工艺，来实现烟碱的有效降解，控制其含量，是烟草行业的一个热门研究课题和研究方向。

中国发明和专利申请(申请号为：200710013068.3)公开了一种可以代谢尼古丁的恶臭假单胞菌，该菌株已于2005年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，其保藏编号为：CCTCC NO.M 205038。中国发明和专利申请(申请号为：200710013069.8)公开了一种可以代谢尼古丁的根癌土壤杆菌，该菌株已于2006年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，其保藏编号为：CCTCC NO.M 206131。上述的两款菌株具有较强的尼古丁代谢能力和尼古丁毒性抗性能力，可以利用菌株的完整细胞为生物催化剂，可将烟草加工废水中的尼古丁彻底生物降解。

中国发明和专利申请(申请号为：200710070805.3)公开了一株新的尼古丁降解菌-假单胞菌ZUTSKD及其应用。假单胞菌ZUTSKD(Pseudomonassp.ZUTSKD)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年6月18日，保藏编号CCTCC NO：M 207083。该菌可将尼古丁降解，能耐受的最高尼古丁浓度为5.5g/L，能够降解废弃烟末中的尼古丁，在工业上有一定的应用前景。

上述的三个专利涉及的菌株对尼古丁具有有效的降解性能，适用于废弃尼古丁的处理，唯一的缺点是都是涉及液体状态下的尼古丁降解，对于固态的烟叶是否具有作用还未经实验证实。

发明内容

为了解决上述的问题，本发明的一个目的是提供一种假单胞菌ZCJ菌株，该菌株具有较高生物活性，适用于固态的烟叶烟碱的降解。本发明的第二个目的是提供上述的假单胞菌ZCJ菌株的筛选方法。本发明的第三个目的是提供上述的假单胞菌ZCJ菌株的应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

假单胞菌ZCJ菌株，该假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)已经于2009年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCNO.M209064。

上述的菌株形态鉴定：该菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢。电镜观察发现，该菌鞭毛端生，鞭毛数1-3根。在BSM琼脂培养基上菌落为白色，光滑，边缘成齿状。生理生化鉴定：该菌株好氧，能以尼古丁为唯一碳、氮源生长。吲哚实验、甲基红实验、V.P.实验、淀粉水解实验均成阴性，氧化乳糖不产酸不产气。该菌株16S rDNA序列全长1417bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为了实现上述的第二个目的，本发明的假单胞菌ZCJ菌株的筛选方法，该方法包括以下的步骤：

1、在100mL生理盐水中，加入10g烟叶(由杭州利群卷烟厂提供)，24～37℃，150～200rpm振荡20～40min；

2、取1mL振荡液加入至100mL富集培养基中，24～37℃，150～200rpm振荡40～50h；

3、取适量富集培养液，涂布在BSM琼脂培养基上，25～37℃下培养35～50h；

4、挑取单菌落，划线在新鲜的BSM琼脂培养基上，获得纯化的菌。

作为优选，上述的富集培养基的配方如下：Na₂HPO₄5.57g·L^-1，KH₂PO₄ 2.44g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 1g·L^-1，MgCl₂·6H₂O 0.2g·L^-1，MnCl₂·4H₂O 0.0004g·L^-1，FeCl₃·6H₂O 0.001g·L^-1，CaCl₂0.001g·L^-1，尼古丁10g·L^-1，pH＝7.0。

作为优选，上述的步骤③的BSM琼脂培养基尼古丁含量为2g/L。

为了实现上述的第三个目的，本发明的假单胞菌ZCJ菌株用于烟叶烟碱的降解。特别是用于自然陈化1～2年的烟叶。具体的方法是：将所述的假单胞菌ZCJ菌株制成悬液，喷洒于烟叶。

本发明由于采用了上述的技术方案，从烟叶原料中筛选出的烟碱降解菌株，该菌株具有较高生物活性，适用于固态的烟叶烟碱的降解，特别是应用于经过自然陈化1-2年后的库存烟叶(特别是烟碱含量仍偏高的片烟)，以达到降低烟叶烟碱的目的。本发明不仅在提高库存烟叶的可用性、维护品牌形象等方面，具有重要意义，而且也为将来进一步开展烟叶陈化方面的研究，缩短烟叶陈化周期和减少企业原料烟叶库存占用资金，以及在生产工艺环节上的工业应用，提高卷烟产品的品质，打下应用基础。

附图说明

图1为本发明菌株ZCJ的电镜照片(10000×)。

图2为本发明菌株ZCJ的系统进化树。

图3为本发明菌株ZCJ在液体培养基中的生长效果图。

图4为本发明菌株ZCJ在液体培养基中对尼古丁的降解效果图。

图5本发明菌株ZCJ固态发酵降解烟叶烟碱(尼古丁)效果降解效果图。

具体实施方式

实施例1 假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)的分离、纯化及鉴定

一、烟叶烟碱(尼古丁)降解菌的分离纯化

在100mL生理盐水中，加入10g陈化烟叶(由浙江中烟工业有限责任公司提供)，30℃，180rpm振荡30min。取1mL振荡液加入至100mL富集培养基(富集培养基：Na₂HPO₄5.57g·L^-1，KH₂PO₄2.44g·L^-1，(NH₄)₂SO₄1g·L^-1，MgCl₂·6H₂O0.2g·L^-1，MnCl₂·4H₂O 0.0004g·L^-1，FeCl₃·6H₂O 0.001g·L^-1，CaCl₂ 0.001g·L^-1，尼古丁10g·L^-1，pH＝7.0)中，30℃，180rpm振荡48h。取适量富集培养液，涂布在BSM琼脂培养基上(尼古丁含量2g/L)，28℃下培养48h。挑取单菌落，划线在新鲜的BSM琼脂培养基上，获得一株纯化的菌。

二、菌株ZCJ形态结构观察及生理生化实验

1、形态鉴定：

该菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢。电镜观察发现，该菌鞭毛端生，鞭毛数1-3根(图1)。在BSM琼脂培养基上菌落为白色，光滑，边缘成齿状。

2、生理生化鉴定：

该菌株好氧，能以尼古丁为唯一碳、氮源生长。吲哚实验、甲基红实验、V.P.实验、淀粉水解实验均成阴性，氧化乳糖不产酸不产气。

三、假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)的16s r DNA的PCR扩增和序列测定

用试剂盒提取纯化后菌株的总DNA。采用细菌16s rDNA的通用引物(上海英骏生物技术有限公司合成，其正向引物序列：5’-agagtttgatcctggctcag-3’，反向引物序列为：5’-cggctaccttgttacgacttc-3’)进行16s rDNA的PCR扩增。PCR反应程序如下：①94℃ 5min；②94℃ 1min；③52℃ 1min；④72℃ 1min；⑤循环第2步到第4步34次；⑥72℃ 10min；⑦-20℃保存。

PCR产物的纯化和测序由上海英骏公司完成。该菌16S rDNA序列全长1417bp，序列见SEQ ID NO.1。

菌株ZCJ的Gene bank登录号为FJ815158，利用Clustalx和Treeview软件，绘制进化树(如图2)。根据其形态\生理生化和16s r DNA序列比对结果，参照伯杰氏细菌鉴定手册，可以判定菌株ZCJ属于假单胞菌属，命名为Pseudomonas sp.ZCJ。

实施例2 假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)的尼古丁降解特性

一、假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)在液体培养基中的生长和对尼古丁的降解效果

将1mL菌悬液(细胞干重约为0.3125mg)接种到100mL含尼古丁2g/L的BSM培养基中，180rpm，不同温度(25、28、37℃)下培养。4d后测量菌体干重及尼古丁降解情况。

取30mL菌悬液，4000rpm离心15min，去上清，烘箱中低温烘干至恒重。发现，随着培养温度的升高，菌体生长量增大(如图3所示)。利用HPLC检测尼古丁含量，发现当培养温度为37℃时，尼古丁降解最多(如图4所示)。

二、假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)固态发酵降解烟叶烟碱(尼古丁)效果

将烟叶处理成大拇指指甲盖大小，称取10g置于三角瓶中。添加5mL用0.05M，pH为7的磷酸缓冲液悬浮的降解菌ZCJ悬液，对照组加入不含降解菌的等量磷酸缓冲液。28℃静置培养7d后，往三角瓶中添加200mL蒸馏水，摇床振荡30min，过滤提取浸出液。经HPLC检测尼古丁含量，发现尼古丁含量与对照组相比，均有一定幅度的降低(如图5所示)，表明添加一定浓度的ZCJ菌悬液能降解烟叶中的尼古丁。

序列表

<110>浙江中烟工业有限责任公司、浙江工业大学

<120>用于烟叶烟碱降解的假单胞菌ZCJ菌株及其筛选方法和应用

<160>1

<210>1

<211>1417

<212>DNA

<213>假单胞菌ZCJ菌株

<400>1

ggctacacat gcagtcgagc ggatgagtgg agcttgctcc atgattcagc ggcggacggg 60

tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggacaac gtttcgaaag gaacgctaat 120

accgcatacg tcctacggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta tcagatgagc 180

ctaggtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa aggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg 240

tctgagagga tgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca 300

gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag 360

aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag ggcagtaagt taataccttg 420

ctgttttgac gttaccaaca gaataagcac cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa 480

tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttcgt 540

taagttggat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tggcgagcta 600

gagtatggca gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag 660

gaacaccagt ggcgaaggcg accacctggg ctaatactga cactgaggtg cgaaagcgtg 720

gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt 780

tgggatcctt gagatcttag tggcgcagct aacgcattaa gtcgaccgcc tggggagtac 840

ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 900

gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggccttg acatgcagag aactttccag 960

agatggattg gtgccttcgg gagctctgac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt 1020

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca 1080

cgttaaggtg ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac 1140

gtcaagtcat catggccctt acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa 1200

gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag 1260

tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctccag 1380

aagtagctag tctaaccttc ggggggacgg taccacg 1417

Claims

1.假单胞菌ZCJ菌株，其特征在于：该假单胞菌ZCJ菌株(Pseudomonas sp.ZCJ)的保藏编号为：CCTCC NO.M209064。

2.一种用于烟叶烟碱的降解的方法，其特征在于：该方法采用如权利要求1所述的假单胞菌ZCJ菌株。

3.根据权利要求2所述的一种用于烟叶烟碱的降解的方法，其特征在于：所述的烟叶为自然陈化1～2年的烟叶。

4.根据权利要求2或3所述的一种用于烟叶烟碱的降解的方法，其特征在于：将所述的假单胞菌ZCJ菌株制成悬液，喷洒于烟叶。