CN100422311C

CN100422311C - 一种生物降解烟碱的方法

Info

Publication number: CN100422311C
Application number: CNB2005101228317A
Authority: CN
Inventors: 陆兆新; 袁勇军; 吕凤霞; 别小妹; 李颖
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2005-12-06
Filing date: 2005-12-06
Publication date: 2008-10-01
Anticipated expiration: 2025-12-06
Also published as: CN1800361A

Abstract

本发明涉及一种生物降解烟碱的方法，它是以烟碱降解细菌(Ochrobactrumintermedium)DN2为菌种，利用Ochrobactrum intermedium DN2或Ochrobactrumintermedium DN2的尼古丁降解酶作用于复烤烟叶、烟丝、工农业烟草下脚料以及烟草废弃物以及上述各种对象的水提液，使烟碱发生部分或全部的降解。采用本发明可使复考烟叶的烟碱降解40～48%；烟丝中的烟碱降解降低35～56%；烟草抽提液中的烟碱降解75～98%。该法属于生物降解法，特异性强，效果显著，生产成本低，可用于烟草加工，烟草造纸以及环境保护等领域。

Description

一种生物降解烟碱的方法

技术领域

本发明涉及利用烟碱降解细菌(Ochrobactrum intermedium)DN2降解烟碱的方法，属于一种生物降解烟碱的生产方法，专用于生物降解烟碱。

背景技术

烟碱是普通烟草中的生物碱，俗称尼古丁(nicotine)，其主要作用在于它所产生的生理强度，即通常所说的劲头，该强度与烟碱含量成正比。烟碱对人的中枢神经有强烈的刺激和麻痹作用，少量使人兴奋，大量会引起眩晕、呕吐甚至中毒死亡，成人一次摄入40mg～60mg尼古丁，就可能致命。因此，烟草中的烟碱含量过高，就会严重危害烟民的健康。

我国部分烟区所产烟叶，尤其是上部烟叶烟碱含量偏高。据报道，目前我国烤烟烟碱平均含量为3％～4％，白肋烟高达6％，而正常情况下烤烟应低于3％，白肋烟应在2％～4％。国内各大烟厂贮存的上部烟叶较多，一般因其烟碱含量较高，而不易用于叶组配方中。对于上述烟碱含量高的上部烟叶，卷烟生产厂家一般是通过逐步消化的方法来实现其应用。但由于消化速度慢，仍然有大量的上部烟叶得不到有效的利用而造成浪费。也有的厂家为了回收烟叶的收购成本，干脆就用这些上部烟叶来生产低档次的卷烟，使上部烟叶的工业可用性和商业附加值得不到充分体现。近年来，随着世界范围反吸烟运动的不断深入和消费者对自身健康的更加关注，几乎所有类型的卷烟产品都在向低焦油和低烟碱的淡味型卷烟方向发展，且其发展速度十分迅猛。目前我国强制规定，对于卷烟烟气中烟碱的含量大于15mg/支的烤烟型卷烟不得生产和流通，且这个规定的值将来还会降低。此外，为创收外汇，我国也有少量的卷烟出口，这些卷烟的烟碱含量一般都很低。出口卷烟的生产厂家为了生产低烟碱的卷烟，除了配方上的改进外，通常需要精挑细选“上乘烟叶”来满足其生产需求，费时费力费财，且不能保证大量生产此类卷烟对原料的需求。因此降低卷烟中烟碱的含量已经成为卷烟生产厂家的当务之急。虽然目前已有一些降低烟草中烟碱含量的方法，如农业措施和浸提法，但这些技术在降低烟碱的同时，也会降低那些对香烟品质有贡献的成分。

烟碱也是一种环境有毒物质，烟气环境中就含有大量的烟碱。在烟草制品的生产过程中会产生大量的固体，液体和气体废弃物，其中烟碱的平均含量高达18g烟碱/kg干重。在欧洲，当每千克废弃物(干重)中烟碱含量超过500mg时，就被归类为“有毒和有害物质”。1994年以来，美国一直把烟碱列在美国排放毒性化学品目录(Toxics ReleaseInventory，TRI)中。据报道，我国每年产生的烟草废弃物约100万吨。这些废弃物如果不加处理就投放到环境中，会严重破坏生态环境，危害人类的健康。

综上所述，有效地控制和降低卷烟制品和环境中的烟碱含量，对于保护环境、维护人类健康有着深远的意义。目前，国外研究者已从环境中分离了多种烟碱降解菌。【文摘】利用Deharyomyces nicotianae和Micrococcus nicotianae的培养液进行工业发酵处理烟草，试验表明，这两种菌液既能改善烟草的风味和香气，也能分别使烟草的烟碱含量降解了0.45％和0.83％，而两种混合菌液处理的烟草烟碱含量降低了0.61％。Tobacco，1947，51：6-15。【文摘】在合成介质上，用由土壤中分离出的假单胞菌属(Pseudomonas)第41小种处理烟碱溶液24h后，烟碱含量大幅度降低，由于pH值的降低和菌落数的增大，烟碱的分解停止，约有75％的起始烟碱发生降解。Arch Biochem Biophys，1958，72(2)：145-162。【文摘】从烟叶中分离出可将烟碱氧化成γ-氨基丁酸的细菌。Journal of Bacterial，1958，(75)：474～479。【文摘】从烟叶仓库中分离出烟草节细菌(Arthrobacter nicotianae)，该菌在烟碱-琼脂上大量繁殖并使烟碱降解。Coresta，1959，3：2595。【文摘】使用0.2％烟碱作为唯一碳源的培养基，从烟草生长土壤和烟叶表面上分离出能够降解烟碱的细菌：争论产碱菌(Alcaligenes paradoxus)和球形节杆菌(Arthrobacter globiformils)，若培养基中有葡萄糖存在，它们会具有高烟碱降解活性，但是在烟碱浓度为0.5％时，菌的生长受到抑制；当把争论产碱菌喷洒到潮湿的烟叶上时，五天内都没有产生明显的降解；但是若同时在培养基中加入葡萄糖，将在两天之内产生明显降烟碱的效果。Science Paper，1976，118：197-201。【文摘】从干烟叶表面分离出一株能够降解烟碱的菌株，经鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)E-150。在含有烟碱(小于5g/L)的培养基中34℃、pH7.0的条件下进行发酵，此发酵过程中该菌降烟碱的能力得到诱导。另外，这种菌还能代谢烟酸，但不能降解去甲烟碱和新烟碱。Degrader(Spain)，1983，22：85-98。【文摘】布朗威&廉森公司从Puerto Rican雪茄烟叶上分离出可降解烟碱的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和可同时除去烟碱和硝酸盐的纤维单胞菌属(Cellulomana ssp)。将此微生物接种到白肋烟叶片上，同时添加足量的水和氨水，使烟叶的水分含量和pH值分别达到65％～75％和6.1。而后于30℃下堆积发酵，16h白肋烟叶片中的烟碱已基本耗尽。化学分析和评吸结果表明，与未处理烟叶加工的卷烟相比，由处理烟叶加工的卷烟配方及其烟气中的烟碱分别降低48％和42％，其感官评吸结果优良。US Patent，No.4037609【文摘】用假单胞菌降解烟尘废料中烟碱的研究。其实验是，取1kg烟尘样品(烟碱2.0％～2.5％)，加2.0～2.5L含有假单胞菌的水溶液浸润，使之完全浸透烟粉，室温下放置数天，并偶尔搅拌一下，约一周后，烟碱含量在4.0×10^-4～7.0×10^-4之间。国内在这方面的研究较少。Information Bulletin of Coresta Congress，1994，ST8。【文摘】王革从烟叶上分离3株降解烟碱能力较强的菌株。供试菌株在无蛋白质培养基上生长至一定浓度后，将菌液均匀喷淋在供试烟叶上，处理样与对照样放置于40℃培养箱中发酵。试验结果表明，烟叶经微生物发酵后，所有处理烟样烟碱含量较对照样均有不同程度减少，最高减少60.15％，最低也能减少5.90％，平均减少21.35％。烟草科学研究，2001，(2)：66-68。

实践证明，生物降解法是去除或减少烟草废弃物中烟碱的有效途径。通过降低烟叶中烟碱的含量，可以解决我国上部烟叶的工业可用性问题，增加烟叶的附加值；通过生物降解法可以使生产低烟碱卷烟的原料来源具有一般性，节约生产成本，扩大出口创汇；降解烟草废弃物中的烟碱，可以保护环境，维护人类健康。因此，利用生物降解烟碱具有重要的经济和社会意义。

烟碱降解细菌(Ochrobactrum intermedium)DN2是从土壤中分离的烟碱降解细菌，我们报道了该菌的分离和鉴定结果(微生物学报，2005，45(2)：181-184)。该菌的生物学特性为：革兰氏染色阴性，无芽孢，短杆状，2根端生鞭毛；在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上菌落白色，光滑，边缘整齐；接触酶、氧化酶反应呈阳性，严格好氧，能以烟碱为唯一碳源进行生长，最适生长温度和pH分别为30℃、7.0，氧化葡萄糖产酸，硝酸盐还原阳性，V.P.、M.P.反应阴性；在金氏培养基B中不产生水溶性色素，该菌不水解淀粉和明胶，能够利用葡萄糖、麦芽糖等，对黏菌素不敏感。但是目前尚未报道Ochrobactrum intermedium DN2降解烟碱的工艺。利用其为菌种降解烟碱可以运用于烟草制造、烟叶造纸以及环境保护等领域。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种生物降解烟碱的方法，利用烟碱降解细菌(Ochrobactrum intermedium)DN2或Ochrobactrum intermedium DN2的尼古丁降解酶降解烟碱，使复烤烟叶的烟碱降解40～48％；烟丝中的烟碱降解降低35～56％；烟草抽提液中的烟碱降解75～98％。通过降低烟叶或烟草抽提液中烟碱的含量，可以既可以解决我国上部烟叶的工业可用性问题，也可以解决烟草废弃物中烟碱对环境的污染问题。

技术方案

本发明一种生物降解烟碱的方法，其特征在于

1)烟碱降解细菌(Ochrobactrum intermedium)DN2的扩大培养普通培养基g/L：胰蛋白胨11.34、牛肉膏3.00、NaCl 5.00、MgSO₄·7H₂O 3.71、pH值7.23；

基础培养基g/L：NH₄NO₃ 1.00、MgSO₄·7H₂O 0.50、(NH₄)₂SO₄ 0.50、KH₂PO₄ 0.50、NaCl 0.50、K₂HPO₄ 1.50、pH值7.0；

烟草抽提液：烟草废弃物和水按1∶10的比例混合成水提液，过夜，水提液用4N NaOH或1N HCl将pH值调到7.0；

以上培养基121℃高压蒸汽灭菌30min；

2)菌悬液的制备

菌体的普通培养：将Ochrobactrum intermedium DN2接种到普通培养基中，32℃、120r/min摇床培养34h，获得普通培养液，10000r/min离心10min，收集菌体，用50mM，pH7.0的PBS将上述菌体配制菌悬液，获得普通培养的菌悬液；

菌体的诱导培养：将32℃、120r/min条件下培养34h的普通培养液以5％的比例接入烟碱浓度为500mg/L的基础培养基中，30℃、120r/min摇床培养36h，然后将培养液10000r/min离心10min，收集菌体，用50mM，pH7.0PBS将上述菌体配制菌悬液，获得诱导培养的菌悬液；

3)粗酶液的的制备

采用以上方法获得的诱导培养菌悬液，按1000mL培养菌悬液加60mL 50mM，pH7.0PBS缓冲液超声波破碎，超声波条件为400w，超声5s，间歇10s，90次，4℃、10000r/min离心10min，上清液即为粗酶液；

4)烟碱的生物降解

在复烤烟草中烟碱的生物降解为：用无菌水将复烤烟叶的水分调节到60％-85％后，分别将上述方法获得的普通培养菌悬液、诱导培养菌悬液或粗酶液以10-20％接种量接入复烤烟叶中，充分混匀菌体，于25～40℃固体发酵，每隔6h翻抖通气；

或者在烟丝中烟碱的生物降解为：用无菌水将烟丝的水分调节到60％-85％后，分别将上述方法获得的普通培养菌悬液、诱导培养菌悬液或粗酶液以10-20％接种量接入烟丝中，充分混匀菌体，于25～40℃固体发酵，每隔6h翻抖通气；

或者在烟草抽提液中烟碱的生物降解为：分别将上述方法获得的普通培养菌悬液、诱导培养菌悬液或粗酶液以10-20％接种量接入烟草抽提液中，30℃、120r/min摇床培养。

有益效果

本发明对首次从环境中分离一株具有较强的烟碱降解能力的细菌Ochrobactrumintermedium DN2进行开发利用。利用Ochrobactrum intermedium DN2或Ochrobactrumintermedium DN2的尼古丁降解酶降解烟碱，使复烤烟叶的烟碱降解40～48％；烟丝中的烟碱降解降低35～56％；烟草抽提液中的烟碱降解75～98％。

通过降低烟叶中烟碱的含量，可以解决上部烟叶的工业可用性问题，增加烟叶的附加值；通过生物降解法可以使生产低烟碱卷烟的原料来源具有一般性，节约生产成本，扩大出口创汇；降解烟草废弃物中的烟碱，可以保护环境，维护人类健康。

具体实施方式

【实施例1】

将Ochrobactrum intermedium DN2接种到普通培养基(g/L)：胰蛋白胨11.34、牛肉膏3.00、NaCl 5.00、MgSO₄·7H₂O 3.71、pH值7.23，32℃、120r/min摇床培养34h，10000r/min离心10min，收集菌体，用PBS(50mM，pH7.0)将上述菌体配制菌悬液，以15g/L的接种量接入烟草抽提液(烟草废弃物和水按1∶10的比例混合，过夜，水提液用4N NaOH或1N HCl将pH值调到7.0)中，于pH6.5～8.5，28～40℃下搅拌反应2～4d，烟碱降解率为85～98％。

【实施例2】

Ochrobactrum intermedium DN2经过普通培养基扩大培养(方法同实施例1)后，10000r/min离心10min，收集菌体，用PBS(50mM，pH7.0)将上述菌体配制菌悬液，以10％接种量接入含水量为60～85％的复烤烟叶中，于28～40℃固体发酵，每隔6h翻抖通气。2～4d的烟碱降解率为40～48％。

【实施例3】

Ochrobactrum intermedium DN2经过普通培养基扩大培养(方法同实施例1)后，10000r/min离心10min，收集菌体，用PBS(50mM，pH7.0)将上述菌体配制菌悬液，以18％接种量接入含水量为60～85％的烟丝中，于28～40℃固体发酵，每隔6h翻抖通气。2～4d的烟碱降解率为40～56％。

【实施例4】

将Ochrobactrum intermedium DN2在普通培养基(同实施例1)中32℃、120r/min条件下培养34h，以5％的比例接入基础培养基(g/L，NH₄NO₃ 1.00、MgSO₄·7H₂O 0.50、(NH₄)₂SO₄ 0.50、KH₂PO₄ 0.50、NaCl 0.50、K₂HPO₄ 1.50、pH值7.0，烟碱为0.5)中，30℃、120r/min摇床培养36h，然后将培养液10000r/min离心10min，收集菌体，用PBS(50mM，pH7.0)将上述菌体配制菌悬液，接入含烟碱的基础培养基中进行诱导培养，离心收集菌体，以15g/L的接种量接入烟草抽提液中，于pH6.5～8.5，25～40℃下搅拌反应2～4d，烟碱降解率为85～98％。

【实施例5】

Ochrobactrum intermedium DN2先在普通培养基培养，后接入含烟碱的基础培养基中进行诱导培养，离心收集菌体，用PBS(50mM，pH7.0)将上述菌体配制菌悬液(方法同实施例4)，以10-20％接种量接入含水量为60～85％的复烤烟叶中，于28～40℃固体发酵，每隔6h翻抖通气。2～4d的烟碱降解率为40～48％。

【实施例6】

Ochrobactrum intermedium DN2先在普通培养基培养，后接入含烟碱的基础培养基中进行诱导培养，离心收集菌体，用PBS(50mM，pH7.0)将上述菌体配制菌悬液(方法同实施例4)，以10-20％接种量接入含水量为60～85％的烟丝中，于28～40℃固体发酵，每隔6h翻抖通气。2～4d的烟碱降解率为40～56％。

【实施例7】

将Ochrobactrum intermedium DN2经烟碱诱导培养后(同实施例4)，按1000mL培养液菌体细胞加60mLPBS缓冲液(50mM，pH7.0)超声波破碎，超声波条件为400w，超声5s，间歇10s，90次。4℃、10000r/min离心10min，上清液即为粗酶液，将粗酶液或粗酶液以10-20％接种量接入烟草抽提液中，于pH6.5～8.5，25～40℃下搅拌反应2～4d，烟碱降解率为75～86％。

【实施例8】

将Ochrobactrum intermedium DN2经烟碱诱导培养后，采用超声波破壁获得粗酶液(方法同实施例7)，将粗酶液以10-20％接种量入含水量为65～85％的复烤烟叶中，于25～40℃固体发酵，每隔6h翻抖通气。2～4d的烟碱降解率为40～48％。

【实施例9】

将Ochrobactrum intermedium DN2经烟碱诱导培养后，采用超声波破壁获得粗酶液(方法同实施例7)，将粗酶液以10-20％接种量接入含水量为65～85％的烟丝中，于25～40℃固体发酵，每隔6h翻抖通气。2～4d的烟碱降解率为35～45％。

Claims

1. 一种生物降解烟碱的方法，其特征在于：

1)烟碱降解细菌(Ochrobactrum intermedium)DN2扩大培养所用的培养基普通培养基g/L：胰蛋白胨11.34、牛肉膏3.00、NaCl 5.00、MgSO₄·7H₂O 3.71、pH值7.23；基础培养基g/L：NH₄NO₃1.00、MgSO₄·7H₂O 0.50、(NH₄)₂SO₄0.50、KH₂PO₄0.50、NaCl0.50、K₂HPO₄1.50、pH值7.0；

以上培养基121℃高压蒸汽灭菌30min；

2)菌悬液的制备

菌体的普通培养：将烟碱降解细菌DN2接种到普通培养基中，32℃、120r/min摇床培养34h，获得普通培养液，10000r/min离心10min，收集菌体，用50mM，pH7.0的PBS将上述菌体配制菌悬液，获得普通培养的菌悬液；

菌体的诱导培养：将32℃、120r/min条件下培养34h的普通培养的菌悬液以5％的比例接入烟碱浓度为500mg/L的基础培养基中，30℃、120r/min摇床培养36h，然后将培养液10000r/min离心10min，收集菌体，用50mM，pH7.0PBS将上述菌体配制菌悬液，获得诱导培养的菌悬液；

3)粗酶液的制备

4)烟碱的生物降解

在复烤烟草中烟碱的生物降解为：用无菌水将复烤烟叶的水分调节到60％-85％后，将上述方法获得的普通培养菌悬液、诱导培养菌悬液或粗酶液以10-20％接种量接入复烤烟叶中，充分混匀，于25～40℃固体发酵，每隔6h翻抖通气；

或者在烟丝中烟碱的生物降解为：用无菌水将烟丝的水分调节到60％-85％后，将上述方法获得的普通培养菌悬液、诱导培养菌悬液或粗酶液以10-20％接种量接入烟丝中，充分混匀，于25～40℃固体发酵，每隔6h翻抖通气；

或者在烟草抽提液中烟碱的生物降解为：将上述方法获得的普通培养菌悬液、诱导培养菌悬液或粗酶液以10-20％接种量接入烟草抽提液中，30℃、120r/min摇床培养；

其中烟草抽提液是按如下方法制得的：烟草废弃物和水按1∶10的比例混合成水提液，过夜，水提液用4N NaOH或1N HCl将pH值调到7.0。