CN116716230B - 一种湖南假单胞菌mgj-2及其在降解尼古丁中的应用 - Google Patents
一种湖南假单胞菌mgj-2及其在降解尼古丁中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116716230B CN116716230B CN202310934714.9A CN202310934714A CN116716230B CN 116716230 B CN116716230 B CN 116716230B CN 202310934714 A CN202310934714 A CN 202310934714A CN 116716230 B CN116716230 B CN 116716230B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tobacco
- pseudomonas
- strain
- nicotine
- mgj
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 title claims abstract description 87
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 86
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 title claims abstract description 86
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 241000793855 Pseudomonas hunanensis Species 0.000 title description 9
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims abstract description 98
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims abstract description 97
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims abstract description 29
- 235000019505 tobacco product Nutrition 0.000 claims abstract description 26
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 25
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 21
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 235000019506 cigar Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000428 dust Substances 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 34
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 34
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000008953 bacterial degradation Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- UIKROCXWUNQSPJ-VIFPVBQESA-N (-)-cotinine Chemical compound C1CC(=O)N(C)[C@@H]1C1=CC=CN=C1 UIKROCXWUNQSPJ-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- MYKUKUCHPMASKF-VIFPVBQESA-N (S)-nornicotine Chemical compound C1CCN[C@@H]1C1=CC=CN=C1 MYKUKUCHPMASKF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- AQCRXZYYMOXFAN-UHFFFAOYSA-N 2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)-pyridine Chemical compound CN1CCCC1C1=CC=CC=N1 AQCRXZYYMOXFAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIKROCXWUNQSPJ-UHFFFAOYSA-N Cotinine Natural products C1CC(=O)N(C)C1C1=CC=CN=C1 UIKROCXWUNQSPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MYKUKUCHPMASKF-UHFFFAOYSA-N Nornicotine Natural products C1CCNC1C1=CC=CN=C1 MYKUKUCHPMASKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000736199 Paeonia Species 0.000 description 1
- 235000006484 Paeonia officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 240000005001 Paeonia suffruticosa Species 0.000 description 1
- 235000003889 Paeonia suffruticosa Nutrition 0.000 description 1
- 241001002356 Valeriana edulis Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 229950006073 cotinine Drugs 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003571 electronic cigarette Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004005 nitrosamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- -1 roots Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
- A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
- A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
- A24B15/10—Chemical features of tobacco products or tobacco substitutes
- A24B15/16—Chemical features of tobacco products or tobacco substitutes of tobacco substitutes
- A24B15/167—Chemical features of tobacco products or tobacco substitutes of tobacco substitutes in liquid or vaporisable form, e.g. liquid compositions for electronic cigarettes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
- A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
- A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
- A24B15/18—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes
- A24B15/20—Biochemical treatment
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09B—DISPOSAL OF SOLID WASTE NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- B09B3/00—Destroying solid waste or transforming solid waste into something useful or harmless
- B09B3/60—Biochemical treatment, e.g. by using enzymes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
- B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/20—Air quality improvement or preservation, e.g. vehicle emission control or emission reduction by using catalytic converters
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Soil Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种湖南假单胞菌MGJ‑2及其在降解尼古丁中的应用，属于微生物领域。所述菌株为湖南假单胞菌（Pseudomonas hunanensis）MGJ‑2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25121。本申请筛选获得的湖南假单胞菌MGJ‑2，在尼古丁培养基、烟草制品以及烟草种植地的尼古丁降解中均显示出了很高的降解能力，可减轻吸烟对身体的危害，处理含有尼古丁的烟草废弃物，实现废物利用，提高烟草利用率，以及用于处理烟草种植地中的尼古丁，从而改善环境，避免尼古丁对环境及生态危害，具有重要的经济、社会和生态效益。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种湖南假单胞菌MGJ-2及其在高效降解尼古丁中的应用。
背景技术
尼古丁（Nicotine）又称烟碱，是烟草特有致癌物质亚硝胺（TSNAs）的重要前体物，存在于环境（例如种植烟草的土壤）中不易降解，严重污染环境。
尼古丁作为香烟和雪茄烟中的主要毒性物质，通过传统方式难以在加工过程中减少其含量。并且，尼古丁在人体肝脏中代谢产物包括可替宁、去甲烟碱和烟碱酸等，可明显增加人体患癌症的风险。
与此同时，烟草类制品的生产过程中，会产生大量难以降解的含尼古丁的烟草废弃物，如烟梗、烟末，不利于其回收再利用。
通过筛选并分离能够高效降解尼古丁的微生物菌株，可以丰富降解尼古丁菌株资源，提高烟草产品的质量，降低吸烟对人身体的风险，同时还能够避免尼古丁对环境及生态危害，具有重要的经济、社会和生态效益。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在提供一株高效尼古丁降解菌：湖南假单胞菌MGJ-2，该菌株可以利用尼古丁为碳氮源生长，以应用于降解烟草种植地、烟草工业废弃物与烟草制品中的尼古丁，降低烟草工业和种植业对环境的破坏以及吸烟对人体健康的危害。
一方面，本申请提供了一种湖南假单胞菌菌株，所述菌株为湖南假单胞菌（Pseudomonas hunanensis）MGJ-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 25121，保藏日期：2022年6月20日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
其中，本申请筛选获得的湖南假单胞菌MGJ-2为革兰氏阴性菌，菌落呈乳白色，圆形，表面光滑，边缘透明，直径约2-3 mm，菌体呈杆状，长约2 µm，宽约0.5 µm，无鞭毛。
另一方面，本申请还提供了利用所述的湖南假单胞菌MGJ-2制备的微生物菌剂。
可选的，本申请所述微生物菌剂可以是利用湖南假单胞菌MGJ-2制成的液体菌剂或固体菌剂，也可以是和其他可降解尼古丁或具有其他降解功能的菌株复配成的菌株组合物菌剂。
另一方面，本申请还提供了湖南假单胞菌MGJ-2菌株，和/或微生物菌剂在微生物降解尼古丁中的应用。
另一方面，本申请还提供了所述湖南假单胞菌MGJ-2菌株，和/或微生物菌剂在微生物降解烟草种植地、烟草工业废弃物和/或烟草制品中尼古丁的应用。
另一方面，本申请还提供了利用湖南假单胞菌MGJ-2菌株，和/或微生物菌剂处理烟草工业废弃物和/或烟草制品获得的菌降解物。
另一方面，本申请还提供了一种降解烟草制品中尼古丁的方法，包括利用所述湖南假单胞菌MGJ-2菌株和/或微生物菌剂处理烟草制品的步骤。
在一种实施方式中，所述菌株和/或所述微生物菌剂的接种量为基于所述烟草制品质量的0.01%~20%。
在一种实施方式中，所述处理的方式包括：将所述菌株和/或所述微生物菌剂制成OD值为2.0-3.0混悬液，喷施所述烟草制品或将所述烟草制品浸泡于所述混悬液中5~60秒后捞出。
在一种实施方式中，所述方法还包括以下步骤：将经所述湖南假单胞菌菌株和/或所述微生物菌剂处理后的烟草制品置于温度28℃~32℃、相对湿度20%~50%、氧气含量18%~25%下培养1~30天。
另一方面，本申请还提供了湖南假单胞菌MGJ-2菌株、微生物菌剂、菌降解物和/或降解方法在制备可燃卷烟、加热不燃烧卷烟和/或烟油中的应用。
可选的，在制备可燃卷烟和/或加热不燃烧卷烟时，MGJ-2菌株和/或微生物菌剂和/或菌降解物可应用的烟支部位包括但不限于：烟支的烟丝、滤嘴纤维丝束、卷烟纸、接口胶等。
可选的，所述烟油是电子烟和/或其他非燃烧类香烟产品的烟油。
在一种实施方式中，所述烟草制品包括烟叶、复烤烟叶、烟草薄片、烟丝、卷烟、雪茄烟；所述烟草工业废弃物包括烟梗和烟末。
可以理解的是，本申请所述“烟丝”是指用烟叶、复烤烟叶、烟草薄片为原料加工成制成的丝、末、粒状商品。
在一种实施方式中，本申请所述菌株MGJ-2的获得方法如下：采集烟草种植地土壤、烟草废弃物与烟草叶片、根、秸秆、花苞等生物材料，将其放入筛选培养基中培养获得含菌的培养液，将该培养液涂布于尼古丁无机盐固体培养基上，挑取长势旺盛菌株分离培养，以菌株16srDNA判断菌株种属，并通过高效液相色谱法判断其是否具有尼古丁降解能力，最终筛选获得对尼古丁降解能力高的菌株。
本申请至少具有如下有益效果。
（1）本申请筛选分离高效降解尼古丁菌株湖南假单胞菌MGJ-2，可以丰富降解尼古丁菌株资源，筛选高效降解尼古丁相关基因，为转基因烟草与工程菌株提供新的基因来源，提高烟草产品的质量，并且可以显著降低吸烟对人身体的危害。
（2）本申请筛选获得的湖南假单胞菌MGJ-2，在尼古丁培养基、烟叶和烟丝中均显示出了很高的降解尼古丁的能力，可用于烟草制品的生产中，起到减少烟草制品中尼古丁的含量，进而减轻吸烟对身体的危害；同时该菌株还可以用于降解烟草制品工业化生产中产生的含尼古丁废弃物，实现废物利用，提高烟草利用率，或者用于处理烟草种植地中的尼古丁，从而改善环境，避免尼古丁对环境及生态危害，具有重要的经济、社会和生态效益。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1是湖南假单胞菌MGJ-2的性状图，其中图1A是MGJ-2菌体在LB培养基中菌落形状图，图1B是MGJ-2菌体在电镜中观察的形状图，图1C是MGJ-2菌体通过革兰氏染色在光学电镜下观察图。
图2是MGJ-2菌体16srDNA测序后分析检测的菌属关系图。
图3是MGJ-2菌体降解无机盐培养基中尼古丁降解前的高效液相色谱图。
图4是MGJ-2菌体降解无机盐培养基中尼古丁降解后的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1 菌株的筛选与鉴定。
（一）、生物材料采集。
烟草种植地土壤与烟草叶片、根、秸秆、花苞以及烟草废弃物经化学分析含有大量尼古丁，故可推测其中可分离出多种尼古丁降解菌。
采集地点与材料。
1、黑龙江省哈尔滨市宾西县采集烟草种植地中的土壤，根，秸秆，叶。
2、黑龙江省牡丹江市烟草种植地采集烟草花苞、根、秸秆、叶。
3、四川省什邡市烟草叶片及烟草废弃物。
采集要求。
1、每采样点间隔约为20米。
2、每点取土样约一个乒乓球大小，取土壤深度5cm、10cm、15cm，并采集此地烟草叶片、秸秆等，要求尽量完整。
3、烟草废弃物采集方法同烟草种植地土壤。
（二）、分离得到一株高效降解尼古丁的湖南假单胞菌MGJ-2。
利用无机盐培养基，添加尼古丁作为唯一的碳氮源，分离可以利用尼古丁生长的菌株。最后分离得到9株不同菌株，其中MGJ-2具有很高的尼古丁降解活性。
具体方法如下。
1）培养基的配置及灭菌。
A、LB培养基的配置：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠l0 g，蒸馏水定容至1L，pH值自然。121℃高压灭菌20 min。
B、尼古丁无机盐培养基的配制。
根据表1中的配方数据配制培养基，纯水定容至1L，pH自然，121℃高压灭菌20min（尼古丁经0.22µm滤膜加入），固体培养基则在液体培养基基础上添加2.0%琼脂。
表1尼古丁无机盐培养基配方
注：固体培养基可加琼脂。
2）富集培养。
A、用LB培养基收集实验材料（切碎研磨后的植物组织与土壤样本各2g）中的大部分微生物，为期3-4天（30℃，160 rpm）。
B、利用尼古丁无机盐培养基以高浓度尼古丁进行胁迫，30℃、160 rpm，每7天换液一次，重复6次。
3）涂布筛菌。
将最后一次培养液涂布在尼古丁固体培养基上，并挑取长势旺盛的菌株进行单独培养，将此菌株分离纯化后接种到尼古丁培养基中，30℃、160 rpm摇床培养24 h后，通过高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测培养基中的尼古丁含量，筛选出具有尼古丁降解能力的菌株。
经筛选最终获得一株尼古丁降解能力突出的菌株MGJ-2，其来源于黑龙江省牡丹江市烟草种植地采集的烟草根中。
4）菌株MGJ-2菌落形态、革兰氏染色观察与电镜观察。
将菌株MGJ-2通过“Z”字划线法接种于LB固体培养基上，经过30℃恒温避光培养24h后，可观察到MGJ-2菌落呈乳白色，圆形，表面光滑，边缘透明，直径约2-3 mm，如图1A所示。
菌株MGJ-2的电镜观察如图1B所示，由图1B可知，其菌体呈杆状，长约2 µm，宽约0.5 µm，无鞭毛。
菌株MGJ-2的革兰氏染色结果如图1C所示，由图1C可知，菌株MGJ-2染色后呈红色，为革兰氏阴性菌。
（三）、确定菌属。
利用16SrDNA测序，并分析检测菌属关系，MGJ-2与标准菌株湖南假单胞菌Pseudomonas hunanensis LV关系最近，具体系统发育树见图2。
具体步骤如下。
1、提取菌株基因组DNA。
2、利用16SrDNA通用引物进行目的基因扩增，其中：正向引物为：5’-TGGCGAACGGGTGAGTAATACAT-3’；反向引物为：5’-GCGGTTAGGCTAACTACTTCTGG-3’。PCR反应体系见表2。
表2 16srDNA的PCR体系
注：总体积：50μL。
实施例2 湖南假单胞菌MGJ-2的分解尼古丁活性。
将湖南假单胞菌MGJ-2分别接种于如表1所示的尼古丁无机盐培养基、烟叶、烟梗以及烟草种植地土壤样品中，利用高效液相色谱HPLC检测接种前后的尼古丁含量，确认湖南假单胞菌MGJ-2的降解尼古丁活性。
其中，检测尼古丁含量的高效液相色谱条件如下：流动相：纯甲醇：0.1%二乙胺水溶液=40：60。柱温：40℃。进样量：20μL。流速：0.8 mL/min。
（一）、菌株MGJ-2对无机盐培养基中尼古丁的降解。
以1%的接种量，将菌株MGJ-2接种于5 mL浓度为500 mg/L的尼古丁无机盐培养基中，于30℃、160rpm下培养，并于加入菌种前，以及加入菌种后每隔5h取适量培养液，将培养液于12000 rpm离心10 min，取上清液过0.22 nm有机滤膜装入液相进样瓶中，进行高效液相色谱分析。所得结果如图3、图4与表3所示。
表3 菌株MGJ-2对无机盐培养基中尼古丁的降解效果
注：h：小时。
其中，图3和图4分别为菌株MGJ-2处理500mg/L的尼古丁无机盐培养基0h与25h后的高效液相色谱图。结合图3、图4和表3的结果可知，利用菌株MGJ-2处理表1中的尼古丁无机盐培养基25h后，500mg尼古丁几乎完全被降解，菌株MGJ-2对尼古丁无机盐培养基中的尼古丁具有显著的降解能力。
（二）、菌株MGJ-2对烟叶、烟草废弃物和烟草种植地土壤中尼古丁的降解。
1、处理方法。
1）烟叶、烟草废弃物以及烟草种植地土壤的前处理。
a、分别取适量的烟叶（由内蒙古卷烟厂提供），烟梗（由内蒙古卷烟厂提供，具体为采摘完烟叶的废弃烟梗，并粉碎至100目），和烟草种植地土壤（由内蒙古卷烟厂提供，具体为采集自内蒙古自治区赤峰市喀喇沁旗乃林镇的烟草种植区的已采收完烟草后的土壤样品），利用紫外灯灭菌6 h，期间不停翻动，保证灭菌效果。
b、灭菌后分别放入无菌取样袋中并加入一定量无菌水，放置24h平衡水分（此步骤可省略）。
2）菌株培养与提取。
A、将菌株MGJ-2以2%接种量接种于100mL LB培养基中，于30℃、160rpm培养24h。
B、倒入50mL离心管中以8000rpm转速离心3min，保留沉淀。
C、向离心管中加入10~20mL无菌水振荡洗涤。
D、以8000rpm转速离心3min，保留沉淀，重复洗涤两次。
E、加入一定量无菌水使菌液OD值达到2.0~3.0，获得MGJ-2混悬菌液。
3）菌株MGJ-2处理烟叶、烟草废弃物以及烟草种植地土壤。
a.对烟叶的处理：取30g烟叶浸泡入MGJ-2混悬菌液中30s后捞出擦干，放于30℃培养箱，于相对湿度30%、氧气含量21%条件下培养。
b.对烟梗的处理：取10mL MGJ-2混悬菌液，称取250g干燥后的烟梗，将菌液均匀地喷施在烟草废弃物中，放于30℃培养箱，于相对湿度30%、氧气含量21%条件下培养。
c.对烟草种植地土壤的处理：取10mL MGJ-2混悬菌液，称取250g干燥后的土壤样品，将菌液均匀地喷施在土壤样品中，放于30℃培养箱，于相对湿度30%、氧气含量21%条件下培养。
2、降解效果。
菌株MGJ-2对烟叶中尼古丁的降解效果见表4。由表4可知，烟叶的初始尼古丁含量（质量比m/m）约为3.83%，经过菌株MGJ-2的混悬菌液处理20天后，尼古丁含量（质量比m/m)约为3.25%，降解率达15.14%。
表4 菌株MGJ-2对烟叶中尼古丁的降解效果
| 时间 | 尼古丁含量（质量比m/m） | 降解率 |
| 0d | 3.83% | / |
| 5d | 3.61% | 5.74% |
| 10d | 3.48% | 9.14% |
| 15d | 3.37% | 12.01% |
| 20d | 3.25% | 15.14% |
注：d：天数。
菌株MGJ-2对烟梗中尼古丁的降解效果见表5。由表5可知，烟梗的初始尼古丁含量（质量比m/m)约为4.15%，经过菌株MGJ-2处理28天后，尼古丁含量（质量比m/m)约为2.83%，降解率达31.81%。
表5 菌株MGJ-2对烟梗中尼古丁的降解效果
| 时间 | 尼古丁含量（质量比m/m） | 降解率 |
| 0d | 4.15% | / |
| 7d | 3.92% | 5.54% |
| 14d | 3.47% | 16.39% |
| 21d | 3.10% | 25.30% |
| 28d | 2.83% | 31.81% |
注：d：天数。
菌株MGJ-2对烟草种植地土壤中尼古丁的降解效果见表6。由表6可知，土壤样品的初始尼古丁含量（质量比m/m)约为1.65%，经过菌株MGJ-2处理28天后，尼古丁含量（质量比m/m)约为0.38%，降解率达76.97%。
表6 菌株MGJ-2对土壤样品中尼古丁的降解效果
| 时间 | 尼古丁含量（质量比m/m） | 降解率 |
| 0d | 1.65% | / |
| 7d | 0.97% | 41.21% |
| 14d | 0.73% | 55.76% |
| 21d | 0.52% | 68.48% |
| 28d | 0.38% | 76.97% |
注：d：天数。
综合上述可知，本申请提供的湖南假单胞菌（Pseudomonas hunanensis）MGJ-2对尼古丁培养基、烟草制品、烟草废弃物以及烟草种植地中的尼古丁均显示出了很好的降解能力，在烟草种植和生产工业中，具有重要的经济、社会和生态效益。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (9)
1.一种湖南假单胞菌菌株，其特征在于，所述菌株为湖南假单胞菌（Pseudomonas hunanensis）MGJ-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25121。
2.利用如权利要求1所述的湖南假单胞菌MGJ-2制备的微生物菌剂。
3.如权利要求1所述的湖南假单胞菌菌株，和/或权利要求2所述的微生物菌剂在降解尼古丁中的应用。
4.如权利要求1所述的湖南假单胞菌菌株，和/或权利要求2所述的微生物菌剂在降解烟草种植地、烟草工业废弃物和/或烟草制品中尼古丁的应用。
5.一种降解尼古丁的方法，其特征在于，包括利用如权利要求1所述的湖南假单胞菌菌株，和/或如权利要求2所述的微生物菌剂处理烟草制品、烟草工业废弃物和/或烟草种植地土壤的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述湖南假单胞菌菌株和/或所述微生物菌剂处理烟草制品时的接种量为基于所述烟草制品质量的0.01%~20%；和/或，
所述处理的方式包括：将所述菌株和/或所述微生物菌剂制成OD值为2.0-3.0混悬液，喷施所述烟草制品或将所述烟草制品浸泡于所述混悬液中5~60秒后捞出。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：将经所述湖南假单胞菌菌株和/或所述微生物菌剂处理后的烟草制品置于温度28℃~32℃、相对湿度20%~50%、氧气含量18%~25%下培养1~30天。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述烟草制品包括复烤烟叶、烟丝、卷烟、雪茄烟；所述烟草工业废弃物包括烟梗和烟末。
9.如权利要求1所述的湖南假单胞菌菌株、如权利要求2所述的微生物菌剂和/或如权利要求5-8任一所述的方法，在制备可燃卷烟、加热不燃烧卷烟和/或烟油中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310934714.9A CN116716230B (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 一种湖南假单胞菌mgj-2及其在降解尼古丁中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310934714.9A CN116716230B (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 一种湖南假单胞菌mgj-2及其在降解尼古丁中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116716230A CN116716230A (zh) | 2023-09-08 |
| CN116716230B true CN116716230B (zh) | 2023-10-27 |
Family
ID=87875367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310934714.9A Active CN116716230B (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 一种湖南假单胞菌mgj-2及其在降解尼古丁中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116716230B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101139563A (zh) * | 2007-08-16 | 2008-03-12 | 浙江工业大学 | 降解尼古丁新菌株——假单胞菌zutskd及其应用 |
| CN111690562A (zh) * | 2020-06-09 | 2020-09-22 | 北京农学院 | 一株对酚酸类自毒物质有降解作用的湖南假单胞菌及其应用 |
| US11001515B1 (en) * | 2018-07-12 | 2021-05-11 | The University Of Toledo | Methods for using bacteria that degrade microcystin and biofilters utilizing same |
| CN113980839A (zh) * | 2021-10-14 | 2022-01-28 | 华南农业大学 | 一株降解烟草烟碱的代尔夫特菌nlg11及其应用 |
| CN115786181A (zh) * | 2022-10-11 | 2023-03-14 | 中国科学院水生生物研究所 | 一株湖南假单胞菌株pad-1、废水处理剂及其应用 |
-
2023
- 2023-07-28 CN CN202310934714.9A patent/CN116716230B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101139563A (zh) * | 2007-08-16 | 2008-03-12 | 浙江工业大学 | 降解尼古丁新菌株——假单胞菌zutskd及其应用 |
| US11001515B1 (en) * | 2018-07-12 | 2021-05-11 | The University Of Toledo | Methods for using bacteria that degrade microcystin and biofilters utilizing same |
| CN111690562A (zh) * | 2020-06-09 | 2020-09-22 | 北京农学院 | 一株对酚酸类自毒物质有降解作用的湖南假单胞菌及其应用 |
| CN113980839A (zh) * | 2021-10-14 | 2022-01-28 | 华南农业大学 | 一株降解烟草烟碱的代尔夫特菌nlg11及其应用 |
| CN115786181A (zh) * | 2022-10-11 | 2023-03-14 | 中国科学院水生生物研究所 | 一株湖南假单胞菌株pad-1、废水处理剂及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 乙草胺降解菌系的分离鉴定及其生长降解特性研究;陈森;韦德萍;王欢;韩丽珍;;基因组学与应用生物学(第11期);第4707-4715页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116716230A (zh) | 2023-09-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Calvaruso et al. | Root-associated bacteria contribute to mineral weathering and to mineral nutrition in trees: a budgeting analysis | |
| CN106754557B (zh) | 枯草芽孢杆菌ybm-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用 | |
| CN107779420B (zh) | 一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用 | |
| CN103667120B (zh) | 一株短小芽孢杆菌、该菌株的获取方法及该菌株在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用 | |
| Chen et al. | Isolation of nicotine-degrading bacterium Pseudomonas sp. Nic22, and its potential application in tobacco processing | |
| CN108485998B (zh) | 一株高效活化矿质元素和重金属镉的土壤杆菌t29 | |
| CN106479916B (zh) | 一种阴沟肠杆菌菌株及其应用 | |
| CN104403965B (zh) | 一种降解水体四环素污染物的栖木槿假单胞菌及其应用 | |
| AU2018402480A1 (en) | Endogenous bacillus megaterium BM18-2 with cadmium enrichment for promoting growth of hybrid pennisetum and application thereof | |
| CN1800361A (zh) | 一种生物降解烟碱的方法 | |
| CN110713957B (zh) | 一种高地芽孢杆菌j54及其应用 | |
| CN110846252B (zh) | 一种高地芽孢杆菌j45及其获取方法与应用 | |
| CN110129218B (zh) | 一种去甲基尼古丁降解菌及其生产的菌剂 | |
| CN116716230B (zh) | 一种湖南假单胞菌mgj-2及其在降解尼古丁中的应用 | |
| CN109370956B (zh) | 慢生型大豆根瘤菌菌株、组合物和用途 | |
| CN116694536B (zh) | 一种氯酚假节杆菌bjy-3及其在降解尼古丁中的应用 | |
| CN101139563A (zh) | 降解尼古丁新菌株——假单胞菌zutskd及其应用 | |
| CN115747103A (zh) | 一种促进中药材生长的草木樨中华根瘤菌lqr-15、菌剂及应用 | |
| CN107354112B (zh) | 一株噻虫醛降解菌及其应用 | |
| CN115305226A (zh) | 一株降解烟碱并产氢的抗辐射不动杆菌zj-22及其应用 | |
| CN104805018A (zh) | 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp.)MT-E | |
| CN114907996A (zh) | 卡利比克迈耶氏酵母bjm3及其在林可霉素降解方面的应用、菌剂 | |
| CN107164280A (zh) | 一株呕吐毒素降解菌及其应用 | |
| CN114395504A (zh) | 一种拮抗植物病原菌的生防菌株及其应用 | |
| JP2006333864A (ja) | 新規ホルムアルデヒド分解微生物及び該微生物含有ホルムアルデヒド分解剤、並びに該微生物を用いたホルムアルデヒド分解法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |