JP2006333864A - 新規ホルムアルデヒド分解微生物及び該微生物含有ホルムアルデヒド分解剤、並びに該微生物を用いたホルムアルデヒド分解法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ホルムアルデヒドの効果的な除去のために新規ホルムアルデヒド分解微生物及び該微生物含有ホルムアルデヒド分解剤、並びに該微生物を用いたホルムアルデヒド分解法を提供することにある。
【解決手段】ホルムアルデヒド耐性および分解能力を指標として微生物の探索を行った。特に、微生物の検索場所に注意を払い、特にホルムアルデヒド吸収実験に供試された鉢植えの観葉植物の根圏にそのサンプルを求めてホルムアルデヒド分解能力を有する微生物の取得に成功した。
【選択図】 図１
【解決手段】ホルムアルデヒド耐性および分解能力を指標として微生物の探索を行った。特に、微生物の検索場所に注意を払い、特にホルムアルデヒド吸収実験に供試された鉢植えの観葉植物の根圏にそのサンプルを求めてホルムアルデヒド分解能力を有する微生物の取得に成功した。
【選択図】 図１
Description
本発明は、新規ホルムアルデヒド分解微生物及び該微生物含有ホルムアルデヒド分解剤、並びに該微生物を用いたホルムアルデヒド分解法に関する。
近年、合板などの新建材や合成樹脂性の生活用品および化学繊維製の衣類そして、たばこの煙に由来する室内空気汚染物質が原因であるシックハウス症候群が多発している。また、生活様式の変化から住宅の高気密化が進み、これによる換気不足が事態をいっそう深刻化させている。特にホルムアルデヒドは粘膜に対する刺激性が強く、細胞毒性を有することから、平成１０年３月の厚生労働省の指針ではホルムアルデヒドの室内濃度は、０．１ｍｇ／ｍ３（０．０８ｐｐｍ）以下にすることが明示された。
従来の技術では、これらのホルムアルデヒドを主とした室内汚染物質を、空気清浄器を含む換気システムを改善する方法（特許文献１）や、活性炭（特許文献２）および吸着シート（特許文献３）を用いた吸着法で対応しようとしてきた。しかしながら、家庭で用いるためには、前者は装置の規模が大きすぎること、後者はその安定な吸着性および永続性が期待できないこと並びに再放出の問題があることなどから、室内汚染物質の対応に十分ではなかった。このような現況を改善すべく、ホルムアルデヒド分解能力を有する微生物を用いた方法（特許文献４）が提案されたが、室内で使用するに当たっての使い良さ、微生物によるアレルギーの可能性、環境中への影響など、この方法もまた現実の使用に際しては十分とはいえない。
微生物を用いた有害物質を分解・除去する方法、いわゆるバイオレメディエーションは、適切な微生物種を選択することにより効果的に行うことが可能であること、２次的な汚染物質がでにくいこと、大規模な装置および大量のエネルギーが不要であることなどから、これまでにもホルムアルデヒド分解能力を有する微生物に関する特許出願は、特許文献４以外にもいくつかなされてきた（特許文献５〜８）。しかしながら、いずれも排水中のホルムアルデヒドの分解を目的として排水および土壌から菌のスクリーニングを行ったもので、室内汚染物質としてのホルムアルデヒドの分解に適した菌の探索ではなかった。また、特許文献４にみられる微生物の室内で使用は、培養した特定の菌が限定された箇所で優先種となることであり、これは微生物界に限らずそれを包括する環境にとっても決して好ましいことではない。
一方、植物を用いた有害物質を除去する方法、いわゆるファイトレメディエーションも知られており、室内汚染物質、特にホルムアルデヒドに関して観葉植物に除去能力を有することが報告されている（非特許文献１および２）。しかしながら、植物の有する室内汚染物質に対する分解能力の約６０％は、その根圏に棲息する微生物によること（非特許文献３）、そして、植物はこれら根圏微生物の環境汚染物質に対する分解能力を高めるためにその根から特殊な物質を分泌し、酸素を供給することが報告されている（非特許文献４）。
特許公開２００２−０３９５９３
特許公開２００２−１９１９７０
特許公開２００３−３４０２７７
特許公開２００３−２８４５４８
特許公開２００３−０５２３５９
特許公開２００３−０５２３５５
特許公開平１１−０１９６８６
特許公開平１１−０１９６８５
沢田史子、吉田武稔、黒田浩之、大藪多可志著「植物の空気汚染能力評価法の提案と検証」計測自動制御学会論文集４０巻１０号 ９９４−９９９ （２００４）
沢田史子、大藪多可志、竹中幸三郎、吉田武稔著「実オフィス環境におけるアレカヤシのホルムアルデヒド浄化効果」電気学会論文誌Ｅ（センサ・マイクロマシン準部門誌）１２３巻１０号 ４１６−４２１（２００３）
Ｗｏｌｖｅｒｔｏｎ ＢＣ ａｎｄ Ｗｏｌｖｅｒｔｏｎ ＪＤ， Ｊ． Ｍｉｓｓｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８， １１−１５ （１９９３）
Ｃａｍｐａｎｅｌｌａ ＢＦ， Ｂｏｃｋ Ｃ ａｎｄ Ｓｃｒｏｏｄｅｒ Ｐ， Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＢｓ ａｎｄ ＰＣＤＤ／Ｆｓ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ ＆ Ｐｏｌｌｕｔ Ｒｅｓ ９ （１） ７３−８５ （２００２）
本発明の課題は、屋内で発生するホルムアルデヒドの効果的な除去のために植物の根圏に棲息または棲息可能な新規ホルムアルデヒド分解微生物及び該微生物含有ホルムアルデヒド分解剤、並びに該微生物を用いたホルムアルデヒド分解法を提供することにある。
上記課題を解決すべく室内空気汚染物質、特にシックハウス症候群の主要原因となっているホルムアルデヒド耐性および分解能力を指標として微生物の探索を行った。特に、微生物の検索場所に注意を払い、特にホルムアルデヒド吸収実験に供試された鉢植えの観葉植物の根圏においてホルムアルデヒド分解能力を有する微生物の取得に成功した。さらに、該微生物が種子の発芽に影響を与えないことを確認した。
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものであり、以下の構成からなる。
（１）ホルムアルデヒド分解能を有するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物。
（２）前記微生物が、トリコデルマ・ヴィレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ）である前項１に記載の微生物。
（３）前記微生物が、以下の菌学的性質を有することを特徴とする前項１又は２に記載の微生物。
（４）前記微生物が、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４６０菌株である、前項１−３のいずれか１に記載の微生物。
（５）前項１−４のいずれか１に記載の微生物を含有するホルムアルデヒド分解剤。
（６）前項１−４のいずれか１に記載の微生物を用いることを特徴とするホルムアルデヒド分解法。
（７）室内環境中のホルムアルデヒドを分解することを特徴とする前項６に記載のホルムアルデヒド分解法。
（８）室内環境中のホルムアルデヒドを、植物の根圏に添加した前項１−４のいずれか１に記載の微生物を用いて分解することを特徴とするホルムアルデヒド分解法。
（９）前項１−４のいずれか１に記載の微生物が根圏に添加されていることを特徴とする植物。
（１）ホルムアルデヒド分解能を有するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物。
（２）前記微生物が、トリコデルマ・ヴィレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ）である前項１に記載の微生物。
（３）前記微生物が、以下の菌学的性質を有することを特徴とする前項１又は２に記載の微生物。
（５）前項１−４のいずれか１に記載の微生物を含有するホルムアルデヒド分解剤。
（６）前項１−４のいずれか１に記載の微生物を用いることを特徴とするホルムアルデヒド分解法。
（７）室内環境中のホルムアルデヒドを分解することを特徴とする前項６に記載のホルムアルデヒド分解法。
（８）室内環境中のホルムアルデヒドを、植物の根圏に添加した前項１−４のいずれか１に記載の微生物を用いて分解することを特徴とするホルムアルデヒド分解法。
（９）前項１−４のいずれか１に記載の微生物が根圏に添加されていることを特徴とする植物。
従来、取り扱いが困難であったホルムアルデヒド分解微生物の屋内での使用が可能になり、かつ観葉植物が本来有するホルムアルデヒド分解能力も高めることができる。これによって、屋内で発生するホルムアルデヒドが原因となるシックハウス症候群の軽減に極めて有意義である。
（スクリーニング方法）
以下の方法でホルムアルデヒド分解能力を有する微生物のスクリーニングを行った。
（１）集積培養：ホルムアルデヒドに暴露した観葉植物の根圏の土壌をサンプルとして、ホルムアルデヒド含有培地を用いて一定時間振蘯培養を行った。
（２）微生物の単離：（１）の集積培養で生育した微生物を、ホルムアルデヒドを含む寒天培地を用いて単離を行った。
（３）形態観察および菌類学的性質：（２）で得られた菌株ＢＤＦ００１について、異なる培地を用いて巨視的及び顕微鏡的に形態観察を行い、その菌学的性質を以下の表１に示す。表中に記載されるＰＤＡ〔ポテトデキストロース寒天培地「ダイゴ」（日水製薬、東京）３９ｇ、蒸留水 １０００ｍＬ（ｐＨ ５．６）〕、ＭＡ〔Ｂａｃｔｏ Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）２０ｇ， Ａｇａｒ Ｐｏｗｄｅｒ １５ｇ， 蒸留水 １０００ｍＬ（ｐＨ６．０）〕、ＯＡ〔Ｂａｃｔｏ Ｏａｔｍｅａｌ Ａｇａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭＤ，ＵＳＡ） ７２．５ｇ，蒸留水 １０００ｍＬ（ｐＨ６．０）〕、ＬＣＡ〔ブドウ糖 １ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ、 ＫＣｌ ０．２ｇ、 ＮａＮＯ３ ２ｇ、酵母エキス ０．２ｇ、 寒天 １３ｇ、蒸留水 １０００ｍＬ（ｐＨ７．０）〕はそれぞれ培地の種類を表す。
以下の方法でホルムアルデヒド分解能力を有する微生物のスクリーニングを行った。
（１）集積培養：ホルムアルデヒドに暴露した観葉植物の根圏の土壌をサンプルとして、ホルムアルデヒド含有培地を用いて一定時間振蘯培養を行った。
（２）微生物の単離：（１）の集積培養で生育した微生物を、ホルムアルデヒドを含む寒天培地を用いて単離を行った。
（３）形態観察および菌類学的性質：（２）で得られた菌株ＢＤＦ００１について、異なる培地を用いて巨視的及び顕微鏡的に形態観察を行い、その菌学的性質を以下の表１に示す。表中に記載されるＰＤＡ〔ポテトデキストロース寒天培地「ダイゴ」（日水製薬、東京）３９ｇ、蒸留水 １０００ｍＬ（ｐＨ ５．６）〕、ＭＡ〔Ｂａｃｔｏ Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）２０ｇ， Ａｇａｒ Ｐｏｗｄｅｒ １５ｇ， 蒸留水 １０００ｍＬ（ｐＨ６．０）〕、ＯＡ〔Ｂａｃｔｏ Ｏａｔｍｅａｌ Ａｇａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭＤ，ＵＳＡ） ７２．５ｇ，蒸留水 １０００ｍＬ（ｐＨ６．０）〕、ＬＣＡ〔ブドウ糖 １ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ、 ＫＣｌ ０．２ｇ、 ＮａＮＯ３ ２ｇ、酵母エキス ０．２ｇ、 寒天 １３ｇ、蒸留水 １０００ｍＬ（ｐＨ７．０）〕はそれぞれ培地の種類を表す。
（微生物の菌学的性質）
巨視的及び顕微鏡的観察並びに菌学的性質より菌株ＢＤＦ００１株はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の糸状菌と同定された（図１）。この菌株は下記の国際機関に寄託されている。
名称：独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター
住所：茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
寄託日：平成１７年３月１５日
受託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４６０（菌株ＢＤＦ００１）
名称：独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター
住所：茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
寄託日：平成１７年３月１５日
受託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４６０（菌株ＢＤＦ００１）
（本発明のホルムアルデヒド分解微生物の生育条件）
培養温度は１０℃〜４０℃、望ましくは２０℃〜３５℃であり、特に好ましくは約２５℃であり、ｐＨは３．０〜１０．０、望ましくは４．０〜９．０であり、好気的に培養を行う。また、培地は、通常の糸状菌が生育可能な培地組成であれば特に問題はないが、グルコース １０ｇ、ペプトン ５ｇ、酵母抽出末 ３ｇ、麦芽抽出末 ３ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解し、ｐＨを６〜７に調整したものを使用すると良い。さらに上記培養液にホルムアルデヒドを０．１〜０．５％添加することにより、本糸状菌のホルムアルデヒド分解能を高めることができる。また、培養時間は、３〜２１日間、望ましくは５〜１４日間であり、特に好ましくは７〜１０日間である。
培養温度は１０℃〜４０℃、望ましくは２０℃〜３５℃であり、特に好ましくは約２５℃であり、ｐＨは３．０〜１０．０、望ましくは４．０〜９．０であり、好気的に培養を行う。また、培地は、通常の糸状菌が生育可能な培地組成であれば特に問題はないが、グルコース １０ｇ、ペプトン ５ｇ、酵母抽出末 ３ｇ、麦芽抽出末 ３ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解し、ｐＨを６〜７に調整したものを使用すると良い。さらに上記培養液にホルムアルデヒドを０．１〜０．５％添加することにより、本糸状菌のホルムアルデヒド分解能を高めることができる。また、培養時間は、３〜２１日間、望ましくは５〜１４日間であり、特に好ましくは７〜１０日間である。
（微生物の同定方法）
新規に単離された糸状菌ＢＤＦ００１株についての帰属分類群はＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域配列解析によって行った。ＢＤＦ００１株を定法にしたがって、ゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡをテンプレートとして１８Ｓ ｒＤＮＡ〜２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域断片の増幅を行った。その増幅産物を精製後、サイクルシークエンシング法によってＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域配列解析を行った。得られた塩基配列をＢＬＡＳＴ相同性検索後、上位２０エントリーの塩基配列を用いて系統樹を作成した。系統樹の推定には近隣結合法を用いた。
新規に単離された糸状菌ＢＤＦ００１株についての帰属分類群はＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域配列解析によって行った。ＢＤＦ００１株を定法にしたがって、ゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡをテンプレートとして１８Ｓ ｒＤＮＡ〜２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域断片の増幅を行った。その増幅産物を精製後、サイクルシークエンシング法によってＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域配列解析を行った。得られた塩基配列をＢＬＡＳＴ相同性検索後、上位２０エントリーの塩基配列を用いて系統樹を作成した。系統樹の推定には近隣結合法を用いた。
（ホルムアルデヒド分解能力検定方法）
本発明のホルムアルデヒド分解微生物が有するホルムアルデヒド分解能力を検定するために、以下に述べるＮａｓｈ法（Ｔ．Ｎａｓｈ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５５，４１６（１９５３）の変法を用いて、培養液ならびに反応液中の残存ホルムアルデヒド濃度の測定を行った。
試験管に検体として培養液または反応液を０．０１ｍＬ入れ、これにアセチルアセトン溶液（酢酸アンモニウム １５ｇ、酢酸 ０．３ｍＬ、アセチルアセトン０．２ｍＬ、蒸留水を加えて全量を１００ｍＬとする）を１ｍＬ加えてビー玉で栓をした後、６０℃で１０分間反応させた。反応液の吸光度を４１５ｎｍで測定し、同時に測定した標準ホルムアルデヒドの検量線から検体の濃度を求めた。
本発明のホルムアルデヒド分解微生物が有するホルムアルデヒド分解能力を検定するために、以下に述べるＮａｓｈ法（Ｔ．Ｎａｓｈ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５５，４１６（１９５３）の変法を用いて、培養液ならびに反応液中の残存ホルムアルデヒド濃度の測定を行った。
試験管に検体として培養液または反応液を０．０１ｍＬ入れ、これにアセチルアセトン溶液（酢酸アンモニウム １５ｇ、酢酸 ０．３ｍＬ、アセチルアセトン０．２ｍＬ、蒸留水を加えて全量を１００ｍＬとする）を１ｍＬ加えてビー玉で栓をした後、６０℃で１０分間反応させた。反応液の吸光度を４１５ｎｍで測定し、同時に測定した標準ホルムアルデヒドの検量線から検体の濃度を求めた。
（本発明のホルムアルデヒド分解微生物）
本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、上記寄託を行った菌株ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４６０（ＢＤＦ００１）が望ましいが、この菌株に限定されるものではなく、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属し、好適には、トリコデルマ・ヴィレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ）であるが、ホルムアルデヒド分解能力を有する限り、本発明におけるホルムアルデヒド分解微生物として利用可能である。すなわち、本願発明のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属する微生物特にトリコデルマ・ヴィレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ）は、該寄託微生物自体はもちろん、上記した菌学的性質を有する微生物である変異体及び子孫まで意図する。なお、変異体作成方法は、従来公知の放射線照射およびニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸、メチルメタンスルホン酸などの化学物質処理によって得ることができる。
また、本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、室内でも生育されている観葉植物のゴールデンポトスの根圏から単離されたものである。そのため、本発明のホルムアルデヒド分解菌は、特に室内環境下でも特に問題がない。さらに、本発明のホルムアルデヒド分解剤を、植物の根圏に添加した場合には、根圏は多くの微生物が共生している環境であるため、添加された本発明のホルムアルデヒド分解菌が特に優占種になることはなく、単一菌によるアレルギー問題の回避もできる。
本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、上記寄託を行った菌株ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４６０（ＢＤＦ００１）が望ましいが、この菌株に限定されるものではなく、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属し、好適には、トリコデルマ・ヴィレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ）であるが、ホルムアルデヒド分解能力を有する限り、本発明におけるホルムアルデヒド分解微生物として利用可能である。すなわち、本願発明のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属する微生物特にトリコデルマ・ヴィレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ）は、該寄託微生物自体はもちろん、上記した菌学的性質を有する微生物である変異体及び子孫まで意図する。なお、変異体作成方法は、従来公知の放射線照射およびニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸、メチルメタンスルホン酸などの化学物質処理によって得ることができる。
また、本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、室内でも生育されている観葉植物のゴールデンポトスの根圏から単離されたものである。そのため、本発明のホルムアルデヒド分解菌は、特に室内環境下でも特に問題がない。さらに、本発明のホルムアルデヒド分解剤を、植物の根圏に添加した場合には、根圏は多くの微生物が共生している環境であるため、添加された本発明のホルムアルデヒド分解菌が特に優占種になることはなく、単一菌によるアレルギー問題の回避もできる。
また、本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、ホルムアルデヒド分解能だけではなく、他の室内空気汚染物質であるキシレン、トルエン、アセトアルデヒド、スチレン、エチルベンゼンも分解することができる。また、特に、メチルホルムアルデヒド、ジメチルホルムアルデヒド、ホルムアミン等の分解に効果がある。
（本発明のホルムアルデヒド分解剤）
本発明のホルムアルデヒド分解微生物を培養して得られた菌体または分生子懸濁液、分生子付着シリカゲルビーズ、又は菌体を集めた後に一定濃度に希釈して得られる希釈液を、所定の担体に吸着せしめて、ホルムアルデヒド分解剤とすることができる。なお、その吸着方法は、特に限定されず、菌体懸濁液又は希釈液を担体に混合、又は噴霧することで充分である。また、菌体濃度としては、担体１ｇ当たり１０3 〜１０11個、好ましくは１０5〜１０8 個である。用いられる担体としては、公知の有機担体及び無機担体の内から適宜に選択使用され、例えば、有機コンポスト、フスマ、イナワラ、モミガラ、発泡ケイ酸、ケイソウ土、パーライト、貝化石、石灰石、シリカゲルビーズの単体又はそれらの２種以上の組み合わせを挙げることができる。
また、上記ホルムアルデヒド分解剤は、本発明のホルムアルデヒド分解微生物の生育、増殖に好ましい炭素源、窒素源、又はそれらの混合物を添加することが望ましく、これによって、更に、そのホルムアルデヒド分解能が増強されることとなる。なお、添加する炭素源としては、グルコース、マンノース、マンニット、キシロース、フルクトース、ガラクトース等の単品又はそれらの組み合わせが挙げられる。また、窒素源としては、各種アミノ酸や天然物が用いられ、例えばアミノ酸としては、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン等の単体又はそれらの組み合わせ、また天然物としては、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、コーンスティープリカーの単品又はそれらの組み合わせが用いられることとなる。さらに、ホルムアルデヒドを0.1〜1.0％添加することにより、本発明のホルムアルデヒド分解微生物のホルムアルデヒド分解能を高めることができる。
本発明のホルムアルデヒド分解微生物を培養して得られた菌体または分生子懸濁液、分生子付着シリカゲルビーズ、又は菌体を集めた後に一定濃度に希釈して得られる希釈液を、所定の担体に吸着せしめて、ホルムアルデヒド分解剤とすることができる。なお、その吸着方法は、特に限定されず、菌体懸濁液又は希釈液を担体に混合、又は噴霧することで充分である。また、菌体濃度としては、担体１ｇ当たり１０3 〜１０11個、好ましくは１０5〜１０8 個である。用いられる担体としては、公知の有機担体及び無機担体の内から適宜に選択使用され、例えば、有機コンポスト、フスマ、イナワラ、モミガラ、発泡ケイ酸、ケイソウ土、パーライト、貝化石、石灰石、シリカゲルビーズの単体又はそれらの２種以上の組み合わせを挙げることができる。
また、上記ホルムアルデヒド分解剤は、本発明のホルムアルデヒド分解微生物の生育、増殖に好ましい炭素源、窒素源、又はそれらの混合物を添加することが望ましく、これによって、更に、そのホルムアルデヒド分解能が増強されることとなる。なお、添加する炭素源としては、グルコース、マンノース、マンニット、キシロース、フルクトース、ガラクトース等の単品又はそれらの組み合わせが挙げられる。また、窒素源としては、各種アミノ酸や天然物が用いられ、例えばアミノ酸としては、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン等の単体又はそれらの組み合わせ、また天然物としては、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、コーンスティープリカーの単品又はそれらの組み合わせが用いられることとなる。さらに、ホルムアルデヒドを0.1〜1.0％添加することにより、本発明のホルムアルデヒド分解微生物のホルムアルデヒド分解能を高めることができる。
（本発明のホルムアルデヒド分解方法）
本発明のホルムアルデヒド分解方法は、本発明のホルムアルデヒド分解微生物を培養して得られた菌体または分生子懸濁液、若しくは菌体を集めた後に一定濃度に希釈して得られる希釈液、分生子付着シリカゲルビーズ、又は上記ホルムアルデヒド分解剤を、植物の根圏又は根圏周辺の土壌に添加することによって行うことができる。添加方法は、直接菌体懸濁液等を自体公知の散布方法によって行うことができる。
添加量は、根圏１００グラムに対して、上記菌体懸濁液等を０．５〜２０ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｌ、より好ましくは２〜５ｍｌ添加することによって行うことができるが、特に限定されない。
本発明のホルムアルデヒド分解方法は、本発明のホルムアルデヒド分解微生物を培養して得られた菌体または分生子懸濁液、若しくは菌体を集めた後に一定濃度に希釈して得られる希釈液、分生子付着シリカゲルビーズ、又は上記ホルムアルデヒド分解剤を、植物の根圏又は根圏周辺の土壌に添加することによって行うことができる。添加方法は、直接菌体懸濁液等を自体公知の散布方法によって行うことができる。
添加量は、根圏１００グラムに対して、上記菌体懸濁液等を０．５〜２０ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｌ、より好ましくは２〜５ｍｌ添加することによって行うことができるが、特に限定されない。
（本発明のホルムアルデヒド分解微生物が添加された植物）
本発明のホルムアルデヒド分解微生物が添加された植物は、上記菌体懸濁液又はホルムアルデヒド分解剤が根圏又は根圏周辺の土壌に添加されている植物を言う。また、植物は、室内生育可能な植物特に、ゴールデンポトス、アレカヤシ、ドラセナ、スパティフィラムおよびベンジャミン等が挙げられるが、特に限定される必要はない。
また、本発明のホルムアルデヒド分解微生物が添加された植物におけるホルムアルデヒド分解菌は、宿主先である植物から栄養を継続的に受け取るので、特に栄養等の追加が必要ではない。また、本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、宿主先である植物の根圏が生存している限り、継続的にホルムアルデヒドを分解することができる。
本発明のホルムアルデヒド分解微生物が添加された植物は、上記菌体懸濁液又はホルムアルデヒド分解剤が根圏又は根圏周辺の土壌に添加されている植物を言う。また、植物は、室内生育可能な植物特に、ゴールデンポトス、アレカヤシ、ドラセナ、スパティフィラムおよびベンジャミン等が挙げられるが、特に限定される必要はない。
また、本発明のホルムアルデヒド分解微生物が添加された植物におけるホルムアルデヒド分解菌は、宿主先である植物から栄養を継続的に受け取るので、特に栄養等の追加が必要ではない。また、本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、宿主先である植物の根圏が生存している限り、継続的にホルムアルデヒドを分解することができる。
（本発明のホルムアルデヒド分解微生物の酵素利用）
本発明のホルムアルデヒド分解微生物から従来既知の分離操作によって分離、精製した酵素を用いてホルムアルデヒドの分解除去を行う場合においても、酵素を固定化した後、使用に供することができる。酵素の固定化方法としては、不溶性担体（例えば活性炭、金属酸化物など）に物理的に吸着させる方法、イオン交換基を有する担体にイオン結合により固定化する方法、ブロモシアン活性化担体などに共有結合により固定化する方法、グルタルアルデヒドなどを用いて酵素同士を架橋する方法、ポリアクリルアミド、ウレタンポリマーなどの格子構造又は膜内に閉じ込める方法、エチルセルロースなどの半透性の膜内に閉じ込める方法などが挙げられる。
本発明のホルムアルデヒド分解微生物 、該微生物破砕液、又は該微生物から分離、精製した酵素の固定化に使用する担体等は所望の形状に成型して使用することができる。例えば、菌糸体単独からなる球形のペレット、またはアルギン酸カルシウム、アルギン酸バリウム、寒天、アガロースなどの多糖類の不溶性ゲル、またはポリアクリルアミド、ウレタンポリマーなどの高分子ポリマー内に封入したフィルタ状、ビーズ状に成型することができ、これにより、バイオリアクターとしてホルムアルデヒド分解用フィルタ、ビーズ等を構成できる。また、固定化した本発明のホルムアルデヒド分解微生物、該微生物破砕液、又は該微生物から分離、精製した酵素を用いてホルムアルデヒド測定バイオセンサを作製することができる。
本発明のホルムアルデヒド分解微生物から従来既知の分離操作によって分離、精製した酵素を用いてホルムアルデヒドの分解除去を行う場合においても、酵素を固定化した後、使用に供することができる。酵素の固定化方法としては、不溶性担体（例えば活性炭、金属酸化物など）に物理的に吸着させる方法、イオン交換基を有する担体にイオン結合により固定化する方法、ブロモシアン活性化担体などに共有結合により固定化する方法、グルタルアルデヒドなどを用いて酵素同士を架橋する方法、ポリアクリルアミド、ウレタンポリマーなどの格子構造又は膜内に閉じ込める方法、エチルセルロースなどの半透性の膜内に閉じ込める方法などが挙げられる。
本発明のホルムアルデヒド分解微生物 、該微生物破砕液、又は該微生物から分離、精製した酵素の固定化に使用する担体等は所望の形状に成型して使用することができる。例えば、菌糸体単独からなる球形のペレット、またはアルギン酸カルシウム、アルギン酸バリウム、寒天、アガロースなどの多糖類の不溶性ゲル、またはポリアクリルアミド、ウレタンポリマーなどの高分子ポリマー内に封入したフィルタ状、ビーズ状に成型することができ、これにより、バイオリアクターとしてホルムアルデヒド分解用フィルタ、ビーズ等を構成できる。また、固定化した本発明のホルムアルデヒド分解微生物、該微生物破砕液、又は該微生物から分離、精製した酵素を用いてホルムアルデヒド測定バイオセンサを作製することができる。
以下に、本発明の幾つかの実施例を示し、本発明を更に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのような実施例の記載によって、何等の制約をも受けるものでないことは、言うまでもないところである。また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記の具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、当業者の知識に基づいて種々なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが、理解されるべきである。
（ホルムアルデヒド暴露植物の作成）
エアコンで２５℃に調整し、太陽光を遮断した室内にアクリル性の密閉型チャンバー（５７５×５１０×１０００ｍｍ）を設置した。この中に暴露２日前に３００ｍＬの灌水を施した鉢植えのゴールデンポトス（英名Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｏｔｈｏｓ、学名Ｅｐｉｐｒｅｍｎｕｍ ａｕｒｅｕｍ）を入れ、マイクロシリンジを用いて８ＰＰＭになるようにホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ試薬特級）を注入した。１回の暴露時間は２４時間とし、これを７日間の間隔で３回行った。暴露期間中、チャンバー内の照明は白色蛍光灯を用いて１０００ルクスに保った。ゴールデンポトスは、園芸店で購入した高さ約４５ｃｍのものを市販の用土４０００ｍＬをいれた直径２４ｃｍ、高さ２６ｃｍの鉢に植え替えて用いた。
エアコンで２５℃に調整し、太陽光を遮断した室内にアクリル性の密閉型チャンバー（５７５×５１０×１０００ｍｍ）を設置した。この中に暴露２日前に３００ｍＬの灌水を施した鉢植えのゴールデンポトス（英名Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｏｔｈｏｓ、学名Ｅｐｉｐｒｅｍｎｕｍ ａｕｒｅｕｍ）を入れ、マイクロシリンジを用いて８ＰＰＭになるようにホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ試薬特級）を注入した。１回の暴露時間は２４時間とし、これを７日間の間隔で３回行った。暴露期間中、チャンバー内の照明は白色蛍光灯を用いて１０００ルクスに保った。ゴールデンポトスは、園芸店で購入した高さ約４５ｃｍのものを市販の用土４０００ｍＬをいれた直径２４ｃｍ、高さ２６ｃｍの鉢に植え替えて用いた。
（ホルムアルデヒド分解性微生物のスクリーニング）
集積培養用培地として表２に示す組成の培地（以下基本培地と呼ぶ）を用いた。この培地を１２１℃で２０分間蒸気滅菌を行った後、ホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ試薬特級、３５％溶液として使用、培地添加時は濾過滅菌を行う）を終濃度０．３５％になるように添加した。このホルムアルデヒド含有培地５０ｍＬを含む１００ｍＬ三角フラスコに、実施例１のホルムアルデヒド暴露したゴールデンポトスの根圏土壌（約０．１ｇ）を添加し、室温で３０日間振蘯攪拌しながら集積培養を行った。集積培養で生育してきた微生物をさらに２％寒天および０．３５％ホルムアルデヒドを含む基本培地を用いて単離した。単離した菌株はホルムアルデヒドを含まない２％寒天基本培地で継代培養を行った。
集積培養用培地として表２に示す組成の培地（以下基本培地と呼ぶ）を用いた。この培地を１２１℃で２０分間蒸気滅菌を行った後、ホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ試薬特級、３５％溶液として使用、培地添加時は濾過滅菌を行う）を終濃度０．３５％になるように添加した。このホルムアルデヒド含有培地５０ｍＬを含む１００ｍＬ三角フラスコに、実施例１のホルムアルデヒド暴露したゴールデンポトスの根圏土壌（約０．１ｇ）を添加し、室温で３０日間振蘯攪拌しながら集積培養を行った。集積培養で生育してきた微生物をさらに２％寒天および０．３５％ホルムアルデヒドを含む基本培地を用いて単離した。単離した菌株はホルムアルデヒドを含まない２％寒天基本培地で継代培養を行った。
（ホルムアルデヒド存在下又は非存在下でのｐＨ測定）
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物の、ホルムアルデヒド存在下での生育至適ｐＨの検討を行った。０．２１％ホルムアルデヒドを含むｐＨの異なる寒天基本培地（ｐＨの調整は１Ｍ ＮａＯＨおよび１Ｍ ＨＣｌを用いた）の中央部に、基本寒天培地で前培養した菌株から直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた菌体片を植菌して２５℃で培養を行った。経時的に生育したコロニーの直径を測定し、これを菌体の生育量として評価の指標とした。また、基本培地を５倍に希釈し、ホルムアルデヒドを含まない寒天培地についても同様な実験を行った。各ｐＨについて５組で実験を行い、その平均値と標準誤差を求めた。その結果、菌株ＢＤＦ００１は、ホルムアルデヒドの存在下（図２）および非存在下（図３）においてｐＨ３．０〜９．０において生育し、その生育至適ｐＨは４．０〜９．０であった。
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物の、ホルムアルデヒド存在下での生育至適ｐＨの検討を行った。０．２１％ホルムアルデヒドを含むｐＨの異なる寒天基本培地（ｐＨの調整は１Ｍ ＮａＯＨおよび１Ｍ ＨＣｌを用いた）の中央部に、基本寒天培地で前培養した菌株から直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた菌体片を植菌して２５℃で培養を行った。経時的に生育したコロニーの直径を測定し、これを菌体の生育量として評価の指標とした。また、基本培地を５倍に希釈し、ホルムアルデヒドを含まない寒天培地についても同様な実験を行った。各ｐＨについて５組で実験を行い、その平均値と標準誤差を求めた。その結果、菌株ＢＤＦ００１は、ホルムアルデヒドの存在下（図２）および非存在下（図３）においてｐＨ３．０〜９．０において生育し、その生育至適ｐＨは４．０〜９．０であった。
（ホルムアルデヒド存在下又は非存在下での生育温度測定）
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株ＢＤＦ００１）の、ホルムアルデヒド存在下での生育至適温度の検討を行った。０．２１％ホルムアルデヒドを含む寒天基本培地（ｐＨ６．０）の中央部に、基本寒天培地で前培養した菌株から直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた菌体片を植菌して５℃，１０℃，２０℃，２５℃，３７℃および５０℃で培養を行った。経時的に生育したコロニーの直径を測定し、これを菌体の生育量として評価の指標とした。また、基本培地を５倍に希釈し、ホルムアルデヒドを含まない寒天培地についても同様な実験を行った。各温度について５組で実験を行い、その平均値と標準誤差を求めた。その結果、菌株ＢＤＦ００１は、ホルムアルデヒドの存在下では２０℃、２５℃（図４）、またホルムアルデヒド非存在下では２０℃，２５℃、３７℃（図５）でそれぞれ生育を示した。生育至適温度は２５℃周辺であった。
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株ＢＤＦ００１）の、ホルムアルデヒド存在下での生育至適温度の検討を行った。０．２１％ホルムアルデヒドを含む寒天基本培地（ｐＨ６．０）の中央部に、基本寒天培地で前培養した菌株から直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた菌体片を植菌して５℃，１０℃，２０℃，２５℃，３７℃および５０℃で培養を行った。経時的に生育したコロニーの直径を測定し、これを菌体の生育量として評価の指標とした。また、基本培地を５倍に希釈し、ホルムアルデヒドを含まない寒天培地についても同様な実験を行った。各温度について５組で実験を行い、その平均値と標準誤差を求めた。その結果、菌株ＢＤＦ００１は、ホルムアルデヒドの存在下では２０℃、２５℃（図４）、またホルムアルデヒド非存在下では２０℃，２５℃、３７℃（図５）でそれぞれ生育を示した。生育至適温度は２５℃周辺であった。
（生育した菌体によるホルムアルデヒド分解能力測定）
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株ＢＤＦ００１）の、生育した菌体によるホルムアルデヒド分解能力の検討を行った。基本培地（ｐＨ６．０）５０ｍＬに、基本寒天培地で前培養した菌株から直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた菌体５片を植菌後、室温で６日間振蘯培養を行った。菌体がペレット状に生育した培養液にホルムアルデヒドを終濃度０．０３５％になるように添加し、さらに振蘯培養を行った。サンプリングは、０，１，２，３，４，６および８時間後に行い、培養液中の残存ホルムアルデヒド濃度を測定した。実験は５組で行い、その平均値と標準誤差を求めた。培養液中の残存ホルムアルデヒド濃度は経時的に減少し、８時間後でほぼ１００％が分解された（図６）。
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株ＢＤＦ００１）の、生育した菌体によるホルムアルデヒド分解能力の検討を行った。基本培地（ｐＨ６．０）５０ｍＬに、基本寒天培地で前培養した菌株から直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた菌体５片を植菌後、室温で６日間振蘯培養を行った。菌体がペレット状に生育した培養液にホルムアルデヒドを終濃度０．０３５％になるように添加し、さらに振蘯培養を行った。サンプリングは、０，１，２，３，４，６および８時間後に行い、培養液中の残存ホルムアルデヒド濃度を測定した。実験は５組で行い、その平均値と標準誤差を求めた。培養液中の残存ホルムアルデヒド濃度は経時的に減少し、８時間後でほぼ１００％が分解された（図６）。
（菌体の生育に伴うホルムアルデヒド分解能力測定）
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株ＢＤＦ００１）の、菌体の生育に伴うホルムアルデヒドの分解能力の検討を行った。ホルムアルデヒドを終濃度で０．０７％含む基本培地（ｐＨ６．０）５０ｍＬに、基本寒天培地で前培養した菌株から直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた菌体５片を植菌後、室温で７日間振蘯培養を行った。サンプリングは２４時間ごと７日間行い、培養液中の残存ホルムアルデヒド濃度を測定した。実験は５組で行い、その平均値と標準誤差を求めた。培養液中の残存ホルムアルデヒド濃度は菌体の成長とともに減少し、培養３日目でほぼ１００％が分解された（図７）。
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株ＢＤＦ００１）の、菌体の生育に伴うホルムアルデヒドの分解能力の検討を行った。ホルムアルデヒドを終濃度で０．０７％含む基本培地（ｐＨ６．０）５０ｍＬに、基本寒天培地で前培養した菌株から直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた菌体５片を植菌後、室温で７日間振蘯培養を行った。サンプリングは２４時間ごと７日間行い、培養液中の残存ホルムアルデヒド濃度を測定した。実験は５組で行い、その平均値と標準誤差を求めた。培養液中の残存ホルムアルデヒド濃度は菌体の成長とともに減少し、培養３日目でほぼ１００％が分解された（図７）。
（ホルムアルデヒド耐性能力測定）
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株ＢＤＦ００１）の、ホルムアルデヒド耐性能力の検討を行った。ホルムアルデヒドを終濃度でそれぞれ０，０．０７，０．２１，０．３５，０．５，０．６および０．７％含む２％寒天基本培地（ｐＨ６．０）の中央部に、基本寒天培地で前培養した菌株から直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた菌体片を植菌して２５℃で培養を行った。実験は４組で行い、その平均値と標準誤差を求めた。ＢＤＦ００１株は０．６％までのホルムアルデヒド濃度に対して耐性を示したことから、従来、高濃度ホルムアルデヒド耐性株として報告されてきた菌株（０．５％、特許文献６）と同程度以上のホルムアルデヒド耐性を示すことが明らかとなった（図８）。
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株ＢＤＦ００１）の、ホルムアルデヒド耐性能力の検討を行った。ホルムアルデヒドを終濃度でそれぞれ０，０．０７，０．２１，０．３５，０．５，０．６および０．７％含む２％寒天基本培地（ｐＨ６．０）の中央部に、基本寒天培地で前培養した菌株から直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜いた菌体片を植菌して２５℃で培養を行った。実験は４組で行い、その平均値と標準誤差を求めた。ＢＤＦ００１株は０．６％までのホルムアルデヒド濃度に対して耐性を示したことから、従来、高濃度ホルムアルデヒド耐性株として報告されてきた菌株（０．５％、特許文献６）と同程度以上のホルムアルデヒド耐性を示すことが明らかとなった（図８）。
（菌株ＢＤＦ００１の同定）
糸状菌ＢＤＦ００１株のＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域配列解析は以下のように行った。ＢＤＦ００１株をポテト・デキストロース寒天培地（日本製薬、東京）で２５℃２週間培養した検体からＤｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムをテンプレートとして１８Ｓ ｒＤＮＡ３'末端〜２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲはｐｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＮＪ， ＵＳＡ）とプライマーＩＴＳ５およびＮＬ４ を用いてＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）上でサーマルサイクルを行った。得られたＤＮＡフラグメントはＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、サイクルシークエンシグ反応に供した。サイクルシークエンシグ反応はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）上で反応を行った。プライマーとしてＩＴＳ５，ＩＴＳ２，ＩＴＳ３およびＩＴＳ４を用いた。
反応生成物はＤｙｅＥｘＴＭ ２．０ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）で配列解析後、Ａｕｔｏ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて各シークエンス断片を結合して目的配列を得た。
類似の塩基配列を国際データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ）から検索するためにＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、得られた上位２０エントリーの塩基配列に関してＭＥＧＡ ｖｅｒ２．０を用いて系統樹を作成した。系統樹の推定には近隣結合法を用い、各系統枝の信頼度はブーツストラップ法により評価した。
その結果、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓの塩基配列と９９．７〜１００％の相同性を示し、さらに系統樹においてもＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓと同一の系統枝を形成したことからＢＤＦ００１株はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓと同定された。
糸状菌ＢＤＦ００１株のＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域配列解析は以下のように行った。ＢＤＦ００１株をポテト・デキストロース寒天培地（日本製薬、東京）で２５℃２週間培養した検体からＤｎｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムをテンプレートとして１８Ｓ ｒＤＮＡ３'末端〜２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２領域ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲはｐｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＮＪ， ＵＳＡ）とプライマーＩＴＳ５およびＮＬ４ を用いてＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）上でサーマルサイクルを行った。得られたＤＮＡフラグメントはＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、サイクルシークエンシグ反応に供した。サイクルシークエンシグ反応はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）上で反応を行った。プライマーとしてＩＴＳ５，ＩＴＳ２，ＩＴＳ３およびＩＴＳ４を用いた。
反応生成物はＤｙｅＥｘＴＭ ２．０ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）で配列解析後、Ａｕｔｏ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて各シークエンス断片を結合して目的配列を得た。
類似の塩基配列を国際データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ）から検索するためにＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、得られた上位２０エントリーの塩基配列に関してＭＥＧＡ ｖｅｒ２．０を用いて系統樹を作成した。系統樹の推定には近隣結合法を用い、各系統枝の信頼度はブーツストラップ法により評価した。
その結果、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓの塩基配列と９９．７〜１００％の相同性を示し、さらに系統樹においてもＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓと同一の系統枝を形成したことからＢＤＦ００１株はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓと同定された。
（種子の発芽におよぼす影響）
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株ＢＤＦ００１）の、植物種子の発芽に及ぼす影響の検討を行った。直径９０ｍｍのプラスチックシャーレに脱脂綿を敷き、対照区には蒸留水１２ｍＬを、試験区には菌株ＢＤＦ００１の分生子懸濁液（３．０×１０７個/ｍＬ）１２ｍＬを添加した。これに市販の大根種子をそれぞれ１００個播種した。対照区および試験区ともに２個ずつ用意した。発泡スチロールの箱（縦×横×高さ、２０×２３×１５ｃｍ）２個それぞれに、対照区および試験区のシャーレを２個ずつ入れて箱の中が乾燥しないように５０ｍＬのビーカーに水を３０ｍＬ入れた後、ラップ紙で覆って輪ゴムで固定した。発芽は、１６/８時間（明/暗）―照明および２５℃で７日間行った。試験期間中、灌水は毎日脱脂綿が充分水を含むように行った。種子の発芽に対する評価は、経時的に発芽した芽の撮影された写真における比較と、７日目に測定された成長した芽の長さを比較することによって行った。その結果、大根種子に対する菌株ＢＤＦ００１の分生子懸濁液の投与は、種子の発芽ならびに投与後７日間の成長においては全く影響は見られなかった。また、肉眼による観察においても、葉の病変等の異常は観察されなかった（表３）。
以上により、本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、種子の発芽に影響を与えないことが明らかとなった。
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株ＢＤＦ００１）の、植物種子の発芽に及ぼす影響の検討を行った。直径９０ｍｍのプラスチックシャーレに脱脂綿を敷き、対照区には蒸留水１２ｍＬを、試験区には菌株ＢＤＦ００１の分生子懸濁液（３．０×１０７個/ｍＬ）１２ｍＬを添加した。これに市販の大根種子をそれぞれ１００個播種した。対照区および試験区ともに２個ずつ用意した。発泡スチロールの箱（縦×横×高さ、２０×２３×１５ｃｍ）２個それぞれに、対照区および試験区のシャーレを２個ずつ入れて箱の中が乾燥しないように５０ｍＬのビーカーに水を３０ｍＬ入れた後、ラップ紙で覆って輪ゴムで固定した。発芽は、１６/８時間（明/暗）―照明および２５℃で７日間行った。試験期間中、灌水は毎日脱脂綿が充分水を含むように行った。種子の発芽に対する評価は、経時的に発芽した芽の撮影された写真における比較と、７日目に測定された成長した芽の長さを比較することによって行った。その結果、大根種子に対する菌株ＢＤＦ００１の分生子懸濁液の投与は、種子の発芽ならびに投与後７日間の成長においては全く影響は見られなかった。また、肉眼による観察においても、葉の病変等の異常は観察されなかった（表３）。
以上により、本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、種子の発芽に影響を与えないことが明らかとなった。
（BDF００１分生子付着シリカビーズの調製法）
分散媒として７.５％スキムミルクを使用した。スキムミルク粉末（Wako）７.５グラムを１００mLの蒸留水に懸濁したものをオートクレーブにて１２１℃２０分間蒸気滅菌した後１０mLずつ分注し、４℃で保存した。シリカゲル（Wako, 白色、小粒状タイプ）１５グラムをスクリューバイアルパイレックス（登録商標）試験管（２０×１５０mm）に取り、１８０℃で１時間乾熱滅菌を行った後４℃で保存した。上記（本発明のホルムアルデヒド分解微生物の生育条件）に記載したグルコース・ペプトン・酵母抽出末・麦芽抽出末を含む寒天培地上で培養し、充分分生子を形成した菌株BDF００１に１０mLの上記スキムミルクを添加した後、白金耳を用いて寒天培地の表面から丁寧に分生子を掻き取った。この分生子懸濁スキムミルクを氷中で冷却している上記滅菌シリカゲルを含む試験管に約１mLずつ攪拌しながら添加した。この際シリカゲルが発熱するため試験管を適宜氷中で冷却しながら行う。分生子懸濁スキムミルクの添加終了後試験管にシリコ栓をはめて室温で１週間乾燥させた。
分散媒として７.５％スキムミルクを使用した。スキムミルク粉末（Wako）７.５グラムを１００mLの蒸留水に懸濁したものをオートクレーブにて１２１℃２０分間蒸気滅菌した後１０mLずつ分注し、４℃で保存した。シリカゲル（Wako, 白色、小粒状タイプ）１５グラムをスクリューバイアルパイレックス（登録商標）試験管（２０×１５０mm）に取り、１８０℃で１時間乾熱滅菌を行った後４℃で保存した。上記（本発明のホルムアルデヒド分解微生物の生育条件）に記載したグルコース・ペプトン・酵母抽出末・麦芽抽出末を含む寒天培地上で培養し、充分分生子を形成した菌株BDF００１に１０mLの上記スキムミルクを添加した後、白金耳を用いて寒天培地の表面から丁寧に分生子を掻き取った。この分生子懸濁スキムミルクを氷中で冷却している上記滅菌シリカゲルを含む試験管に約１mLずつ攪拌しながら添加した。この際シリカゲルが発熱するため試験管を適宜氷中で冷却しながら行う。分生子懸濁スキムミルクの添加終了後試験管にシリコ栓をはめて室温で１週間乾燥させた。
（分生子の計測）
上記実施例１０で調製した分生子付着シリカビーズ７個に０.１％ Tween 80溶液１mLを添加してボルテックスを用いて充分に攪拌した。この分生子懸濁液を０.１％Tween 80溶液を用いて１０４までの希釈系列を調製した。この希釈系列をそれぞれ０．０５mLずつ上記（本発明のホルムアルデヒド分解微生物の生育条件）に記載したグルコース・ペプトン・酵母抽出末・麦芽抽出末を含む寒天培地に添加し、スプレッダーにて培地上に展開した後２５℃で２４時間培養した。
培地上で発芽した分生子の数を計測し、発芽数１００〜２００を示した希釈率を選択した。再度この希釈率の懸濁液から今度は４点播種し、２４時間後の発芽分生子数を計測した。４点の発芽分生子数を平均し、希釈率ならびに培地に添加した検体量を乗じ、シリカゲル７粒あたりの平均重量で除すことで１ミリグラムのシリカゲルあたりに付着している分生子の数を求めた。その結果、シリカゲル１粒あたりの分生子付着数は、３７４１０７±２６１７９個であった。よって、シリカゲルには十分な分生子が付着していることがわかった。
以上により、本発明のホルムアルデヒド分解微生物をシリカゲルに付着させれば、ホルムアルデヒド分解剤にすることができる。
上記実施例１０で調製した分生子付着シリカビーズ７個に０.１％ Tween 80溶液１mLを添加してボルテックスを用いて充分に攪拌した。この分生子懸濁液を０.１％Tween 80溶液を用いて１０４までの希釈系列を調製した。この希釈系列をそれぞれ０．０５mLずつ上記（本発明のホルムアルデヒド分解微生物の生育条件）に記載したグルコース・ペプトン・酵母抽出末・麦芽抽出末を含む寒天培地に添加し、スプレッダーにて培地上に展開した後２５℃で２４時間培養した。
培地上で発芽した分生子の数を計測し、発芽数１００〜２００を示した希釈率を選択した。再度この希釈率の懸濁液から今度は４点播種し、２４時間後の発芽分生子数を計測した。４点の発芽分生子数を平均し、希釈率ならびに培地に添加した検体量を乗じ、シリカゲル７粒あたりの平均重量で除すことで１ミリグラムのシリカゲルあたりに付着している分生子の数を求めた。その結果、シリカゲル１粒あたりの分生子付着数は、３７４１０７±２６１７９個であった。よって、シリカゲルには十分な分生子が付着していることがわかった。
以上により、本発明のホルムアルデヒド分解微生物をシリカゲルに付着させれば、ホルムアルデヒド分解剤にすることができる。
（菌株BDF００１添加時のポトス（Epipremnum aureum）のホルムアルデヒド除去効果に及ぼす影響）
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株BDF００１）添加時の、ポトス（Epipremnum aureum）のホルムアルデヒド除去効果に及ぼす影響を検討した。
エアコンで室温２２℃に調整した部屋に、容積約３００リットルのアクリルチャンバー（５７５×５１０×１０００ｍｍ）を設置し、その中に被検観葉植物鉢を配置した。太陽光を遮断してチャンバー内は昼白色の蛍光灯によって約１０００ルックスになるように設定した。チャンバー内にホルムアルデヒドを３０ｐｐｍになるようにマイクロシリンジを用いて注入した。チャンバー内のホルムアルデヒド濃度を連続的に酸化スズ系ガスセンサー（Figaro社製、TGS#８００）を用いて測定した。センサーからの信号は1分ごとにパーソナルコンピュータに取り込み、その最大出力値が半値となる時間を求めた。ポトスのホルムアルデヒド除去能はこの半値時間に葉面積を乗じた値で表した。ポトスは、園芸店で市販されている植物体の高さが約５０cmものを購入して用いた。実験終了後、ポトスの葉の長辺と短辺の積にさらに０.７乗じた値をポトスの葉面積とした。
菌株BDF００１の添加は、分生子懸濁液（６.０×１０６個）５mLを被検ポトスの根際に投与した後、充分灌水した。灌水は３日ごとに行い、投与後室温で１週間置いた後に実験に供した。
その結果、菌株BDF００１添加時のポトスのホルムアルデヒド除去効果は、８.７％向上することが判明した（表４）。
以上により、本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、環境中特に室内環境中のホルムアルデヒドを分解することができる。さらに、本発明のホルムアルデヒド分解微生物を添加した植物特にポトスは、ホルムアルデヒド分解に効果がある。
単離したホルムアルデヒド耐性および分解能力を有する微生物（菌株BDF００１）添加時の、ポトス（Epipremnum aureum）のホルムアルデヒド除去効果に及ぼす影響を検討した。
エアコンで室温２２℃に調整した部屋に、容積約３００リットルのアクリルチャンバー（５７５×５１０×１０００ｍｍ）を設置し、その中に被検観葉植物鉢を配置した。太陽光を遮断してチャンバー内は昼白色の蛍光灯によって約１０００ルックスになるように設定した。チャンバー内にホルムアルデヒドを３０ｐｐｍになるようにマイクロシリンジを用いて注入した。チャンバー内のホルムアルデヒド濃度を連続的に酸化スズ系ガスセンサー（Figaro社製、TGS#８００）を用いて測定した。センサーからの信号は1分ごとにパーソナルコンピュータに取り込み、その最大出力値が半値となる時間を求めた。ポトスのホルムアルデヒド除去能はこの半値時間に葉面積を乗じた値で表した。ポトスは、園芸店で市販されている植物体の高さが約５０cmものを購入して用いた。実験終了後、ポトスの葉の長辺と短辺の積にさらに０.７乗じた値をポトスの葉面積とした。
菌株BDF００１の添加は、分生子懸濁液（６.０×１０６個）５mLを被検ポトスの根際に投与した後、充分灌水した。灌水は３日ごとに行い、投与後室温で１週間置いた後に実験に供した。
その結果、菌株BDF００１添加時のポトスのホルムアルデヒド除去効果は、８.７％向上することが判明した（表４）。
以上により、本発明のホルムアルデヒド分解微生物は、環境中特に室内環境中のホルムアルデヒドを分解することができる。さらに、本発明のホルムアルデヒド分解微生物を添加した植物特にポトスは、ホルムアルデヒド分解に効果がある。
ホルムアルデヒド分解菌の屋内での使用が可能になり、かつ植物特に観葉植物が本来有するホルムアルデヒド分解能力も高めることができる。これによって屋内で発生するホルムアルデヒドが原因となるシックハウス症候群の軽減に極めて有意義である。
Claims (9)
- ホルムアルデヒド分解能を有するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する微生物。
- 前記微生物が、トリコデルマ・ヴィレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ）である請求項１に記載の微生物。
- 前記微生物が、以下の菌学的性質を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物。
- 前記微生物が、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０４６０菌株である、請求項１−３のいずれか１に記載の微生物。
- 請求項１−４のいずれか１に記載の微生物を含有するホルムアルデヒド分解剤。
- 請求項１−４のいずれか１に記載の微生物を用いることを特徴とするホルムアルデヒド分解法。
- 室内環境中のホルムアルデヒドを分解することを特徴とする請求項６に記載のホルムアルデヒド分解法。
- 室内環境中のホルムアルデヒドを、植物の根圏に添加した請求項１−４のいずれか１に記載の微生物を用いて分解することを特徴とするホルムアルデヒド分解法。
- 請求項１−４のいずれか１に記載の微生物が根圏に添加されていることを特徴とする植物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005328365A JP2006333864A (ja) | 2005-05-02 | 2005-11-14 | 新規ホルムアルデヒド分解微生物及び該微生物含有ホルムアルデヒド分解剤、並びに該微生物を用いたホルムアルデヒド分解法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005133818 | 2005-05-02 | ||
| JP2005328365A JP2006333864A (ja) | 2005-05-02 | 2005-11-14 | 新規ホルムアルデヒド分解微生物及び該微生物含有ホルムアルデヒド分解剤、並びに該微生物を用いたホルムアルデヒド分解法 |
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|---|---|
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| JP2005328365A Pending JP2006333864A (ja) | 2005-05-02 | 2005-11-14 | 新規ホルムアルデヒド分解微生物及び該微生物含有ホルムアルデヒド分解剤、並びに該微生物を用いたホルムアルデヒド分解法 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100808094B1 (ko) | 2007-12-18 | 2008-02-29 | 주식회사 한성종합기술단건축사사무소 | 새집 증후군의 원인이 되는 포름알데히드 및 휘발성유기화합물을 제거하기 위한 탈취 및 항균성 조성물 |
| DE102006062239A1 (de) * | 2006-12-22 | 2008-06-26 | Lothar Ernst Wilhelm Weber | Mittel zur Absorption von Schad- oder Geruchsstoffen u. a. |
| CN107656013A (zh) * | 2017-08-10 | 2018-02-02 | 中山大学 | 一种水培植物净化甲醛效果评测系统及方法 |
-
2005
- 2005-11-14 JP JP2005328365A patent/JP2006333864A/ja active Pending
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| CN107656013A (zh) * | 2017-08-10 | 2018-02-02 | 中山大学 | 一种水培植物净化甲醛效果评测系统及方法 |
| CN107656013B (zh) * | 2017-08-10 | 2024-06-11 | 中山大学 | 一种水培植物净化甲醛效果评测系统及方法 |
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