CN110760507A - 一种降解三唑类杀菌剂的菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种降解三唑类杀菌剂的菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种降解三唑类杀菌剂的菌剂及其制备方法和应用，所述降解三唑类杀菌剂的菌剂，由以下质量份数的成分制成：1～4份的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ‑2湿菌体、0.5～2份的海藻酸钠、8～12份的聚乙烯醇、1～4份的生物质炭。本发明所用生物质炭、聚乙烯醇、海藻酸钠对微生物无害，载体材料可以为粪产碱杆菌WZ‑2提供适宜生存环境，能较好的保留粪产碱杆菌WZ‑2的降解活性，生产成本低；本发明的菌剂可以快速降解水体及土壤中戊唑醇残留，尤其是在戊唑醇污染的大棚蔬菜田降解修复中，菌液和本发明菌剂两个处理组中，戊唑醇在土壤中半衰期分别为26.8d、17.6d，相同菌量的本发明菌剂和菌液相比，本发明菌剂对戊唑醇的降解效果明显优于菌液。

Description

一种降解三唑类杀菌剂的菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物降解技术领域，特别涉及一种降解三唑类杀菌剂的菌剂及其制备方法和应用的技术领域。
背景技术
三唑类杀菌剂是目前全球杀菌剂类别品种最多的一大类，商品化的品种已达31种。其中戊唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑、腈菌唑在谷物、蔬菜、水果等作物中广泛使用，用于防治担子菌、子囊菌及半知菌三大亚门真菌。一些研究表明，三唑类杀菌剂具有环境激素效应，许多国家已将三唑类杀菌剂列入环境内分泌干扰物重点监测名单。三唑类杀菌剂易残留在土壤和水体中，对环境生物产生不利影响。因此，消除三唑类农药污染变得越来越重要。
三唑类农药的污染修复主要有化学修复、物理修复和生物修复。化学修复和物理修复因修复不彻底、成本高且易造成二次污染等缺点，实际应用并不多。生物修复因其成本低、易操作、无二次污染等优点，已逐渐成为一种主要的环境污染修复技术手段。
粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2是生物修复中的一种新被发现的微生物菌，其对戊唑醇有很好的降解效果。但是，游离的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2投入环境不易定殖，环境适应能力差，易出现污染修复效果下降的现象。如何解决上述技术问题，是目前生物降解技术领域需要解决的技术问题。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提出一种降解三唑类杀菌剂的菌剂及其制备方法和应用。
本发明采用技术方案为：一种降解三唑类杀菌剂的菌剂，由以下质量份数的成分制成：1～4份的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2湿菌体、0.5～2份的海藻酸钠、8～12份的聚乙烯醇、1～4份的生物质炭，所述生物质炭以草本植物和木本植物于200-700℃制得。
在上述方案的基础上，由以下质量份数的成分制成：2份的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2湿菌体、1份的海藻酸钠、10份的聚乙烯醇、2份的生物质炭。
在上述方案的基础上，所述粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15301。
一种降解三唑类杀菌剂的菌剂制备方法，包括以下步骤：
(1)按成分配比，称取小麦秸秆生物质炭，将其加入粪产碱杆菌WZ-2菌悬液中，充分混合2h，制备粪产碱杆菌WZ-2混悬液A；
(2)按成分配比，称取聚乙烯醇和海藻酸钠，将其加入粪产碱杆菌WZ-2混悬液A中，振荡混合均匀，得到粪产碱杆菌WZ-2包埋液；
(3)将粪产碱杆菌WZ-2包埋液滴加到灭菌的4％氯化钙溶液中，4℃交联固化12h，收集菌剂，用无菌水洗涤3次，即可得到降解三唑类杀菌剂的菌剂。
在上述方案的基础上，所述粪产碱杆菌WZ-2菌悬液制备方法如下：
(1)在无菌条件下，用接菌环在固体培养基中接种粪产碱杆菌WZ-2，置于30℃培养箱中避光培养48h，得到活化的粪产碱杆菌WZ-2；
(2)将活化的粪产碱杆菌WZ-2接种于含戊唑醇100mg/L的富集培养液中，30℃，160r/min恒温摇床内培养48h，得到粪产碱杆菌WZ-2菌悬液B；
(3)将粪产碱杆菌WZ-2菌悬液B于12000r/min离心3min，弃去上清液，用无菌水洗涤菌体2次，弃去上清液，得到粪产碱杆菌WZ-2的湿菌体；
(4)将粪产碱杆菌WZ-2的湿菌体重悬于无菌水中得到粪产碱杆菌WZ-2菌悬液。
在上述方案的基础上，所述固定培养基为LB固体培养基，所述LB固体培养基由以下步骤制备：取1000mL的蒸馏水，加入10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl、18g琼脂，调节pH至7.0；121℃灭菌20min。
在上述方案的基础上，所述富集培养液为蛋白胨基础盐液体培养基，所述蛋白胨基础盐液体培养基由以下步骤制备：取1000mL的蒸馏水，加入5g蛋白胨、1.0g NH4NO3、1.5gK2HPO4、0.5g KH2PO4、0.5g NaCl、0.2g MgSO4，调节pH至7.0；121℃灭菌20min。
一种降解三唑类杀菌剂的菌剂应用，所述降解三唑类杀菌剂的菌剂用于三唑类杀菌剂的降解。
在上述方案的基础上，所述降解三唑类杀菌剂的菌剂用于戊唑醇的降解。
本发明的有益效果是：本发明所用生物质炭、聚乙烯醇、海藻酸钠对微生物无害，载体材料可以为粪产碱杆菌WZ-2提供适宜生存环境，能较好的保留粪产碱杆菌WZ-2的降解活性，可直接投入水体和土壤中使用，生产成本低；本发明的菌剂可以快速降解水体及土壤中戊唑醇残留，尤其是在戊唑醇污染的大棚蔬菜田降解修复中，菌液和本发明菌剂两个处理组中，戊唑醇在土壤中半衰期分别为26.8d、17.6d，相同菌量的本发明菌剂和菌液相比，本发明菌剂对戊唑醇的降解效果明显优于菌液；本发明的菌剂可以反复使用3次，对50mg/L戊唑醇的降解率仍保持在30％以上；本发明的菌剂可以降解三唑类杀菌剂：苯醚甲环唑、丙环唑、三唑酮、腈菌唑，可以广泛的应用于修复三唑类杀菌剂残留污染。
附图说明
图1为本发明菌剂实物照片；
图2为本发明菌剂对戊唑醇的降解效果；
图3为本发明菌剂对戊唑醇降解循环利用3次后的降解效果图；
图4为本发明菌剂对室内模拟土壤中戊唑醇的降解实验效果图；
图5为本发明菌剂对棚室环境下土壤中戊唑醇的降解实验效果图；
图6为本发明菌剂对常用三唑类杀菌剂降解性能比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用降解三唑类杀菌剂的菌为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2，NCBI中GenBank中登录号为MG 828834，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15301，保藏日期：2018年1月25日。
实施例1：固定培养基和富集培养液制备方法
1、固定培养基制备方法(所述固定培养基为LB固体培养基)
取1000mL的蒸馏水，加入10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl、18g琼脂，调节pH至7.0；121℃灭菌20min。
2、富集培养液制备方法(所述富集培养液为蛋白胨基础盐液体培养基)
取1000mL的蒸馏水，加入5g蛋白胨、1.0g NH4NO3、1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.5g NaCl、0.2g MgSO4，调节pH至7.0；121℃灭菌20min。
实施例2：降解三唑类杀菌剂的菌剂制备方法
1、粪产碱杆菌WZ-2菌悬液制备方法
(1)在无菌条件下，用接菌环在固体培养基中接种粪产碱杆菌WZ-2，置于30℃培养箱中避光培养48h，得到活化的粪产碱杆菌WZ-2；
(2)将活化的粪产碱杆菌WZ-2接种于含戊唑醇100mg/L的富集培养液中，30℃，160r/min恒温摇床内培养48h，得到粪产碱杆菌WZ-2菌悬液B；
(3)将粪产碱杆菌WZ-2菌悬液B于12000r/min离心3min，弃去上清液，用无菌水洗涤菌体2次，弃去上清液，得到粪产碱杆菌WZ-2的湿菌体；
(4)将粪产碱杆菌WZ-2的湿菌体重悬于无菌水中得到粪产碱杆菌WZ-2菌悬液。
需要说明的是，本实验，粪产碱杆菌WZ-2菌悬液，优选为，制备质量分数为2％的粪产碱杆菌WZ-2菌悬液。
2、降解三唑类杀菌剂的菌剂制备方法
(1)按成分配比，称取小麦秸秆生物质炭，将其加入粪产碱杆菌WZ-2菌悬液中，充分混合2h，制备粪产碱杆菌WZ-2混悬液A；
(2)按成分配比，称取聚乙烯醇和海藻酸钠，将其加入粪产碱杆菌WZ-2混悬液A中，振荡混合均匀，得到粪产碱杆菌WZ-2包埋液；
(3)将粪产碱杆菌WZ-2包埋液滴加到灭菌的4％氯化钙溶液中，4℃交联固化12h，收集菌剂，用无菌水洗涤3次，即可得到降解三唑类杀菌剂的菌剂。
实施例3：最佳包埋材料优化优化正交实验设计
包埋材料、固定剂和菌量等因素影响制备菌剂的物理性能，并影响降解污染物的效率，因此需要对其用量进行优化。选取对菌剂性能影响较大的四个因素(聚乙烯醇、海藻酸钠、生物质炭用量和粪产碱杆菌WZ-2湿菌体菌量)，采用4因素3水平(表1)进行正交实验L9(34)，以菌剂形状、物理性能以及固定化菌剂对戊唑醇的降解效率为指标确定固定化最优条件。其中，戊唑醇浓度为50mg/L。
表1正交实验设计表(L9,34)
Figure BDA0002274779200000061
表2固定化菌剂微球的物理性能及对戊唑醇的降解效率
Figure BDA0002274779200000071
从表2结果可以得到，处理1至处理9分别降解50mg/L戊唑醇降解率为67.5％、88.6％、86.8％、72.4％、92.7％、73.6％、82.3％、75.6％、63.2％，均对戊唑醇有较好的降解效果，但是处理5降解效果最优，同时从本发明菌剂成球情况可以看出，处理5成球最好(图1)，表面光滑，机械强度好，通透性能好。因此确定菌剂最佳组合为湿菌体20g/L、聚乙烯醇100g/L、海藻酸钠10g/L、生物质炭20g/L。
菌剂中粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2的含量为20g/L、聚乙烯醇的含量为100g/L、海藻酸钠的含量为10g/L、活性炭为20g/L。由图1可见，所制备菌剂为规则球形颗粒状，表面光滑，机械强度好，通透性能好。
实施例4：本发明菌剂对戊唑醇的降解实验
1、本发明菌剂对水体中戊唑醇的降解实验
本实验设置两个实验组：本发明菌剂组和空白对照组，每个实验组设置三次重复。空白对照组不加本发明菌剂。
向含有50mg/L戊唑醇的20mL蛋白胨基础盐液体培养基加入制备好的本发明菌剂0.4g，在30℃，160r/min恒温摇床培养0、1、2、3、4、5、6、7、10d后，提取检测戊唑醇残存浓度。
实验结果如图2所示，本发明菌剂对戊唑醇的降解半衰期为1.67天，7d后降解率达到94.5％以上，基本完全降解。
2、本发明菌剂循环利用对水中戊唑醇降解效果影响实验
向含有50mg/L戊唑醇的20mL蛋白胨基础盐液体培养基中，加入制备好的本发明菌剂0.4g，在30℃，160r/min恒温摇床培养5天后，检测其降解效果。
将使用过的本发明菌剂滤除回收，用无菌水洗涤3次，再次使用，检测其降解效果，操作步骤同上。试验结果如图3可知，本发明菌剂循环使用3次后，对戊唑醇的降解率仍能保持在75％以上，在第4次使用后，对戊唑醇的降解率较低，不到30％。
3、本发明菌剂对土壤中戊唑醇的降解实验
(1)本发明菌剂对室内模拟土壤中戊唑醇的降解实验
本实验设置三个实验组：戊唑醇组、菌液+戊唑醇组、本发明菌剂+戊唑醇组，每个实验组设置三次重复。
戊唑醇组：土壤中戊唑醇起始浓度为50mg/kg；
菌液+戊唑醇组：菌液处理为土壤中粪产碱杆菌WZ-2的量为107cfu/g土壤；
本发明菌剂+戊唑醇组：本发明菌剂处理为土壤中加入10％本发明菌剂(相当于土壤中粪产碱杆菌WZ-2的含量107cfu/g土壤)。
所有处理好的土壤均调节含水量至最大持水量的60％，置于30℃恒温培养箱中黑暗培养，实验期间每天调节含水率，使其基本保持恒定。处理后分别于2h、1、3、7、14、21、28、45、60d取样测定土壤中戊唑醇的残留量，计算降解率。
实验结果如图4可知，整体上，随着时间的延长，土壤中戊唑醇残留量逐渐减少。接种粪产碱杆菌WZ-2菌液组和本发明制备的菌剂组均能显著的加速戊唑醇在土壤中降解。戊唑醇组、菌液+戊唑醇组、本发明菌剂+戊唑醇组三个处理中戊唑醇在土壤中的降解半衰期分别为72.6、15.3、16.5d。在室内模拟土壤中，粪产碱杆菌WZ-2菌液降解戊唑醇效果略优于本发明菌剂，这可能与菌液比本发明菌剂对土壤戊唑醇残留接触面稍大有关。
(2)本发明菌剂在大棚蔬菜田戊唑醇污染的修复应用
本实验设置三个实验组组：空白对照组、菌液组、本发明菌剂组，每个实验组设置三次重复。空白对照组不加菌液和本发明菌剂。
试验地为青岛农业大学胶州农业示范园蔬菜大棚，按43％戊唑醇悬浮剂推荐剂量(15mg ai/ha)兑水喷施在土壤上。蔬菜大棚划分多个实验小区，每实验小区面积为10m2，分别在不同的实验小区使用粪产碱杆菌WZ-2菌液和所制备菌剂，根据每小区湿菌体质量相等的原则施入菌液和本发明菌剂。每小区随机采取5个点10cm深的土壤样品，在2h、1、3、7、14、21、28、45、60d采集土壤样品测定戊唑醇残留量，计算降解率。
实验结果由图5可知，与对照相比，菌液组和本发明菌剂组处理的土壤中戊唑醇降解率明显提高，说明菌液和本发明菌剂处理可以较好的降解戊唑醇。对照组、菌液组和本发明菌剂组三个处理中戊唑醇在土壤中半衰期分别为64.5、26.8、17.6d。相同菌量的本发明菌剂和菌液相比，本发明菌剂对戊唑醇的降解效果明显优于菌液。原因可能是菌剂的包埋结构为降解菌提供了定殖的场所，减少了外界环境的干扰，从而提高了粪产碱杆菌WZ-2WZ-2在棚室环境中修复戊唑醇污染的效果。
实施例5：本发明菌剂对其他三唑类杀菌剂的降解实验
分别向含有50mg/L的苯醚甲环唑、丙环唑、三唑酮、己唑醇、腈菌唑、氟硅唑的20mL蛋白胨基础盐液体培养基中，加入制备好的本发明菌剂0.4g，在30℃，160r/min恒温摇床培养5d，提取检测戊唑醇残存浓度。同时设置不加本发明菌剂的空白对照，处理组与空白对照组均设置3个重复。
实验结果如图6所示，本发明菌剂对随苯醚甲环唑、丙环唑、三唑酮、腈菌唑均具有较好的降解效果，5天后降解率均在60％以上，对己唑醇和氟硅唑降解效果较弱，5d后降解率在20％左右。
综上，本发明菌剂对污染环境中大部分三唑类杀菌剂残留降解具有重要的应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种降解三唑类杀菌剂的菌剂，其特征在于，由以下质量份数的成分制成：1～4份的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2湿菌体、0.5～2份的海藻酸钠、8～12份的聚乙烯醇、1～4份的生物质炭。
2.根据权利要求1所述的一种降解三唑类杀菌剂的菌剂，其特征在于，由以下质量份数的成分制成：2份的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2湿菌体、1份的海藻酸钠、10份的聚乙烯醇、2份的生物质炭。
3.根据权利要求1所述的一种降解三唑类杀菌剂的菌剂，其特征在于，所述粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15301。
4.一种权利要求1或2所述的降解三唑类杀菌剂的菌剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按成分配比，称取小麦秸秆生物质炭，将其加入粪产碱杆菌WZ-2菌悬液中，充分混合2h，制备粪产碱杆菌WZ-2混悬液A；
(2)按成分配比，称取聚乙烯醇和海藻酸钠，将其加入粪产碱杆菌WZ-2混悬液A中，振荡混合均匀，得到粪产碱杆菌WZ-2包埋液；
(3)将粪产碱杆菌WZ-2包埋液滴加到灭菌的4％氯化钙溶液中，4℃交联固化12h，收集菌剂，用无菌水洗涤3次，即可得到降解三唑类杀菌剂的菌剂。
5.根据权利要求4所述的降解三唑类杀菌剂的菌剂制备方法，其特征在于，所述粪产碱杆菌WZ-2菌悬液制备方法如下：
(1)在无菌条件下，用接菌环在固体培养基中接种粪产碱杆菌WZ-2，置于30℃培养箱中避光培养48h，得到活化的粪产碱杆菌WZ-2；
(2)将活化的粪产碱杆菌WZ-2接种于含戊唑醇100mg/L的富集培养液中，30℃，160r/min恒温摇床内培养48h，得到粪产碱杆菌WZ-2菌悬液B；
(3)将粪产碱杆菌WZ-2菌悬液B于12000r/min离心3min，弃去上清液，用无菌水洗涤菌体2次，弃去上清液，得到粪产碱杆菌WZ-2的湿菌体；
(4)将粪产碱杆菌WZ-2的湿菌体重悬于无菌水中得到粪产碱杆菌WZ-2菌悬液。
6.根据权利要求5所述的降解三唑类杀菌剂的菌剂制备方法，其特征在于，所述固定培养基为LB固体培养基，所述LB固体培养基由以下步骤制备：取1000mL的蒸馏水，加入10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl、18g琼脂，调节pH至7.0；121℃灭菌20min。
7.根据权利要求5所述的降解三唑类杀菌剂的菌剂制备方法，其特征在于，所述富集培养液为蛋白胨基础盐液体培养基，所述蛋白胨基础盐液体培养基由以下步骤制备：取1000mL的蒸馏水，加入5g蛋白胨、1.0g NH4NO3、1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.5g NaCl、0.2g MgSO4，调节pH至7.0；121℃灭菌20min。
8.一种权利要求1或2所述的降解三唑类杀菌剂的菌剂的应用，其特征在于：所述降解三唑类杀菌剂的菌剂用于三唑类杀菌剂的降解。
9.根据权利要求8所述的降解三唑类杀菌剂的菌剂的应用，其特征在于，所述降解三唑类杀菌剂的菌剂用于戊唑醇的降解。
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