CN108410748B - 一种用于降解三嗪类除草剂的菌剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于降解三嗪类除草剂的菌剂。所述菌剂是以海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭为载体，包埋施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri sp.）aau‑3制成；菌剂中施氏假单胞菌属aau‑3菌的湿菌体含量为20 g/L、聚乙烯醇含量为140 g/L、海藻酸钠的含量为10 g/L；菌剂为球形颗粒状，表面光滑，弹性好，机械强度好，通透性能良好。施氏假单胞菌属aau‑3菌对几种三嗪类除草剂均有良好的降解效果，能快速的降解含氯基团（‑Cl）的莠去津、特丁津等三嗪类除草剂。游离的菌体在环境中易流失、环境适应能力差，为此需将该菌包埋固定成菌剂应用到实际生产中的三嗪类除草剂污染的水体或土壤中，对改善水体及土壤具有很大意义与经济效益。
Description
技术领域
此发明属应用于微生物修复有机污染技术领域，包含了一种三嗪类除草剂降解菌菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
三嗪类除草剂西玛津(2-chloro-4，6-Bis(ethylamino)-1，3，5-triazine)属于内吸选择性除草剂，对动植物有着致畸、影响生长的毒性效果，但是由于其防治农田阔叶草及禾本科草的优良效果，促使其使用量日渐增大，因而由于西玛津造成的环境问题也随之而来。本专利以从农药厂污水中筛选出的一株西玛津高效降解菌进行固定化研究。通过对固定方法、材料的选择，研究了菌剂制备的的最优条件用于重复利用实验及降解谱的测定，希望能作为三嗪类除草剂西玛津污染的水体或土壤的实际修复工作。
经研究证实，在对西玛津的修复过程中，能够选取物理、化学和生物的修复方法，每种方法都有优缺点，物理方法处理见效快、处理效果良好，但是操作比较复杂，价格比较昂贵，对材料的要求也很高，不具有普遍性；化学方法去除西玛津，因为由于化学试剂的应用往往会对环境造成二次污染，届时可能会起到相反的效果，使得被污染的水体或者土壤介入另外的有机污染物导致污染加重，生物降解不仅廉价、处理效果更佳，不会对环境造成二次污染，因此更加适合生产实际中有机污染物的修复工作。
发明内容
为解决三嗪类除草剂残留污染等问题，本发明目的在于提供一种用于降解三嗪类除草剂的菌剂及制备方法。
本发明所述用于降解三嗪类除草剂的菌为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzerisp.)aau-3，NCBI中Genbank登录号为MF184996，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo：13560，保藏日期：2017年1月11日。
一种用于降解三嗪类除草剂的菌剂是以海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭交联产物为载体，包埋施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3制成；
所述菌剂中施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的湿菌体、聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭的配比为1～3∶10～14∶1～3∶1～3，单位为g/L。
进一步限定的技术方案如下：
所述菌剂中施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的湿菌体、聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭的配比为2∶14∶1∶2，单位为g/L。
菌剂为黑色球颗粒状，表面光滑，弹性好，机械强度好，通透性能良好。
制备用于降解三嗪类除草剂的菌剂的操作步骤如下：
(1)将聚乙烯醇和海藻酸钠及活性炭依次加入纯水中，搅拌混匀，在压力101KPa、温度121℃条件下灭菌20min，室温冷却，得到混合液；
(2)在混合液中加入施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的湿菌体，搅拌混匀，得到菌体包埋液；
(3)将包埋液滴加到交联液中，4℃静置24h，洗涤后收集固体颗粒即为用于降解三嗪类除草剂的菌剂。
进一步限定的技术方案如下：
步骤(2)中所述的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的湿菌体具体制备操作如下：
在无菌条件下，将施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3接种于固体培养基中，置于恒温培养箱内避光培养3天，培养温度30±1℃，得到活化菌种；将活化后的菌种接种于含药西玛津100mg/L的1000L富集培养液中，30±1℃，150r/min恒温摇床内培养36h，得到菌悬液；将菌悬液于6000r/min离心10min，弃去上清液，保留沉淀；用灭菌后的生理盐水洗涤沉淀3次，弃去上清液，得到施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的湿菌体。
所述固体培养基为5％蛋白胨基础盐固体培养基：蛋白胨5g、MgSO4·7H2O0.4g L-1、K2HPO40.2g L-1、(NH4)2SO40.2g L-1、CaSO40.08g L-1、FeSO4·7H2O0.002g L-1、1000mL去离子水、琼脂18g，调节pH至7.0，101KPa、121℃灭菌20min。
富集培养液为5％蛋白胨基础盐液体培养基：蛋白胨5g、MgSO4·7H2O0.4g L-1、K2HPO40.2g L-1、(NH4)2SO40.2g L-1、CaSO40.08g L-1、FeSO4·7H2O0.002g L-1、1000mL去离子水、调节pH至7.0，101KPa、121℃灭菌20min。
步骤(3)中所述的交联液由硼酸和氯化钙加入水中混合均匀，在压力101KPa、温度121℃条件下灭菌20min，室温冷却配制成的溶液，硼酸的含量为38g/L，氯化钙的含量为25g/L。
施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3对几种三嗪类除草剂有很好的降解效果，能快速的降解含甲硫基(-SCH3)的几种嗪类除草剂。游离的施氏假单胞菌在环境中易流失、环境适应能力差，因此将该菌包埋固定制成菌剂实际应用到三嗪类除草剂的生物修复技术领域，具有较大的生物修复意义和经济效益。
本发明的有益技术效果具体体现在以下方面：
(1)本发明的菌剂，因其使用的材料(聚乙烯醇、海藻酸钠等)对微生物无害，可以较好的保留施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的降解活性。施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的菌体被包埋于菌剂中，可以避免水体的流动而造成菌体的流失，减少了机械摩擦对菌体造成的伤害。生产成本低，直接投入水体或土壤中即可使用，具有广阔的应用前景。
(2)本发明的菌剂可以快速的降解水体残留的西玛津，50g/L西玛津的降解半衰期为3.7h；
(3)本发明的菌剂可以反复使用4次，对西玛津(50mg/L)的降解率仍然保持在20.0％。
(4)本发明的菌剂可以降解的三嗪类除草剂：西玛津、莠去津、特丁津，可以广泛的用于修复三嗪类除草剂的残留污染。
附图说明
图1为本发明菌剂的物理形状图；菌剂照片(A)与不加菌空白菌剂(B)
图2为本发明菌剂对西玛津降解24h的效果图；
图3为本发明菌剂对西玛津降解的循环利用4次后的降解效果图；
图4为菌剂在污水中降解50mg/L西玛津效果图；
图5为菌剂和菌液对室内模拟土壤中西玛津的降解效果图；
图6为菌剂与菌液降解玉米田西玛津效果图；
图7为菌剂对苯氧羧酸类(2，4-D)、磺酰脲类除草剂(烟嘧磺隆)的降解效果图；
图8为施氏假单胞菌aau-3、04243和19851降解西玛津能力对比效果图。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地说明；但本发明的实施方式并不限于此。以下实施例所用施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：13560，保藏日期：2017年1月11日。
实施例1
制备用于降解三嗪类除草剂的菌剂的操作步骤如下：
(1)制备施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3湿菌体
在无菌条件下，用接菌环蘸取少量施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3接种于固体培养基中，置于恒温培养箱内避光培养3天，培养温度30℃±1℃，得到活化菌种；将活化后的菌种接种两环于含药100mg L-1，100mL液体富集培养基的250mL三角瓶中，30℃±1℃，150r/min恒温摇床内培养36h，得到菌悬液；将此菌悬液接种2mL于装有含药100mg L-1、300mL液体培养液的1000mL三角瓶中，30℃±1℃，150r/min恒温摇床内培养36h，将菌悬液于6000r/min离心10min，弃去上清液，保留沉淀；用生理盐水洗涤沉淀3次，得到施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的湿菌体。
其中固体培养基为5％蛋白胨基础盐固体培养基：蛋白胨5g、MgSO4·7H2O0.4g L-1、K2HPO40.2g L-1、(NH4)2SO40.2g L-1、CaSO40.08g L-1、FeSO4·7H2O0.002g L-1、1000mL去离子水，调节pH至7.0，101KPa、121℃灭菌20min；
液体培养基为5％蛋白胨基础盐液体培养基：蛋白胨5g、MgSO4·7H2O0.4g L-1、K2HPO40.2g L-1、(NH4)2SO40.2g L-1、CaSO40.08g L-1、FeSO4·7H2O0.002g L-1、1000mL去离子水、调节pH至7.0，101KPa、121℃灭菌20min。
(2)制备菌体包埋液
将14g聚乙烯醇、1g海藻酸钠、2g活性炭依次加入100mL水中，搅拌混匀，于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min，室温冷却，得到混合液；
在100mL混合液中加入2g施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的湿菌体，搅拌混匀，得到包埋液。
(3)交联液的配制
将3.8g硼酸和与2.5g氯化钙加入100mL水中溶解，于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min，室温冷却得到交联液。
(4)交联制备三嗪类除草剂降解菌菌剂
将装有100mL交联液的250mL三角瓶置于磁力搅拌器上，将100mL包埋液用注射器缓缓滴入交联液中，4℃条件下固定24h，收集菌剂，用无菌生理盐水洗涤3次，即得到降解三嗪类除草剂的菌剂；菌剂中施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的湿菌体的含量为20g/L、聚乙烯醇的含量为140g/L、海藻酸钠的含量为10g/L、活性炭为20g/L。
由图1可见，菌剂为规则球形颗粒状，表面光滑，弹性好，机械强度好，通透性能好。
实施例1中最佳包埋法聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭菌剂的优化正交实验的设计
包埋材料、固定剂和菌量等因素影响制备菌剂的性能，进而影响其降解污染物效率。应用正交分析的方法对其进行优化。选取对菌剂性能影响较大的四个因素(聚乙烯醇浓度、海藻酸钠浓度、活性炭浓度和湿菌量)，采用4因素3水平(表1)做正交实验L9(34)，以固定化后微生物小球对西玛津的降解半衰期为指标确定固定化最优条件。
表1 L9(34)正交试验设计
表2不同实验组合聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭菌剂降解西玛津一级降解动力学参数
表3不同组合聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭菌剂降解西玛津的正交结果分析
4因素3水平9组正交实验结果表2所示。聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭菌剂的9组实验组合对西玛津均有良好的降解效果。培养12h后，实验组1到实验组9(聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭菌剂不同比例组合)降解50mg·L-1西玛津，其降解率分别为79.4％、85.3％、70.8％、71.6％、73.9％、80.1％、79.5％、68.4％、85.8％；其降解半衰期分别为5.78、5.25、7.07、7.10、6.86、6.58、5.25、7.70h和4.91h。在含50mg·L-1的西玛津基础盐培养基体系中添加制备好的固定化菌剂，对9组实验组合固定化菌剂降解效果进行测定，确定最佳组合条件，结果见表3。针对每个影响因素，均值越小说明该因素对于实验越有利，极差越大，说明该因素对实验的影响越大，由表3可知，因素1中3水平均值最小、因素2中均值1水平最小、因素3中2水平最小，因素4中2水平最小。极差最大的为因素4，表明该因素对实验的影响最大。因此，菌剂PSC最佳组合聚乙烯醇(14g)，海藻酸钠(1g)，活性炭(2g)，湿菌体(2g)；实验中菌体量对实验的影响最大。
实施例2
降解三嗪类除草剂的菌剂对西玛津的降解实验
1菌剂对水体中西玛津的降解实验
(1)无机盐培养基(Mineral Salt Medium，以下简称MSM)制备：
MgSO4·7H2O，0.4克；FeSO4·7H2O，0.002克；K2HP04，0.2克；(NH4)28O4，0.2克；CaSO4，0.08克；蒸馏水1L；pH调至7，121℃、101KPa高压灭菌20min备用。
(2)向含有100.0mg/L西玛津的20mL的MSM中，加入制备好的三嗪类除草剂降解菌菌剂0.5g，在30℃、150r/min摇床上培养0、3、6、9、12、16、24h后，提取检测西玛津残存浓度。同时设置不加湿菌体的本发明菌剂作为空白对照，对照与处理均设3个重复。
实验结果如图2可见，本发明菌剂对西玛津的降解半衰期为3.7h，16h后的降解率达到96.72％以上，基本降解完全。
(3)降解三嗪类除草剂的菌剂的循环利用实验：向含有50.0mg/L西玛津的20mL的MSM中，加入制备好的降解三嗪类除草剂的菌剂0.5g，在30℃、150r/min摇床上培养24h后，将使用过的菌剂滤出，用MSM洗涤3次，再次使用，检测其降解效果，操作步骤同上。
实验结果如图3可见，本发明菌剂在循环使用4次，对西玛津的降解率仍能保持90.0％以上；菌剂在循环使用4次，对西玛津的降解率仍能保持20.0％以上。
(4)实际应用中将本发明菌剂直接加入含药西玛津50mg L-1的20mL污水中，三组污水的pH分别为2.1、5.6、7.5，每组设置三个平行，三个加药不加菌剂对照，分别取0、3、6、9、12、18、24、36h作为取样时间。
实验结果如图4可见，本发明菌剂在pH为2.1的污水中150r/min、30℃摇床培养36h后对西玛津没有降解效果，在pH为5.6的污水中150r/min、30℃摇床培养36h后对50mg/L西玛津的降解为20％以上，在pH为7.5的污水中150r/min、30℃摇床培养36h后完全降解50mg/L西玛津。
2菌剂对土壤中西玛津的降解实验
(1)室内模拟土壤中菌剂对西玛津的降解
称取相当于1.5kg干重的过筛土壤，在土壤中加入西玛津丙酮溶液，使土壤中西玛津起始浓度分别为10mg·kg-1，过2mm筛，使西玛津尽可能均匀分布、丙酮完全挥发。称取0.6g湿菌体，用15mLMSM重悬，加入到相当于300g干土的土壤中(相当于2×106CFU g-1土壤)，调节土壤含水量至土壤最大持水量(WHC)50％(即土壤含水量为20％)，将拌药后的土壤分装至3个500mL三角瓶中，实验期间每隔2d调节含水率，使其基本保持恒定。菌剂处理每个重复取相当于100g干土的土壤，再加入10g菌剂(相当于0.2g湿菌体，即2×106CFUg-1·干土)，混匀，其余步骤同菌液组。在处理后2h、1、3、4、5、7、10、14、21d取5g土壤测定西玛津残留量。设置添加空白菌剂与不加菌液的土壤对照，每个处理3个重复。
实验结果如图5可见，在处理后10d，10mg·kg-1处理菌液对照、菌剂对照的西玛津残留量分别为7.59和4.01mg·kg-1，10d之后其残留量在土壤中变化小。施用菌液和菌剂处理在10d的土壤中西玛津残留量为0和1.9mg·kg-1，相比于各自对照，西玛津降解百分率分别为100％和52.9％；在培养7d、21d，菌液和菌剂PSC处理的西玛津已完全去除。西玛津菌液和菌剂处理在土壤中消解半衰期分别为1.55d、4.62d。可见，在室内模拟土壤中，菌液降解西玛津效果优于菌剂，这可能是药剂和菌液通过均匀拌土后接触面增大有关，而菌剂与药剂的接触面积相对于菌液来说要小。
(2)菌剂对玉米田中西玛津污染的修复应用
在合肥市三十岗乡谢岗村玉米田中，在玉米播种覆土后，按50％西玛津可湿性粉剂推荐剂量(0.45g ai·m-2)兑水喷施在小区土壤上，每小区面积为30m2，分别在不同小区施用200g(4g湿菌体)PVA-SA-活性炭菌剂、4.8L OD600＝0.6的菌液(≈4g湿菌体)，设置不含Pseudomonas stutzeri aau-3的PVA-SA-活性炭菌剂作为空白对照。每小区随机采取15个点10cm深土壤样品，在0、1、3、5、7、10、14、21、30、45、60d采取土壤样品测定西玛津残留量。
实验结果如图6可见，菌剂和菌液均能较好地降解西玛津，施药后21d，菌液和菌剂降解了38.8％和56.3％的西玛津，其田间降解符合一级动力学，消解半衰期为22.7d、15.7d，相同菌量的固定化菌剂PSC和菌液，菌剂对西玛津的降解明显优于菌液。菌剂的包埋结构为吸附在固定化小球内部的降解菌提供了屏障，减少了外界环境的干扰，从而提高了Pseudomonas stutzeri aau-3在玉米田中修复西玛津污染的效果。
实施例3
(1)菌剂对其它三嗪类除草剂的降解实验
分别向含有50.0mg/L莠去津、特丁津、扑灭津、莠灭净、扑灭净、莠去通、特丁通的20mL MSM中，加入降解三嗪类除草剂的菌剂0.5g，在30℃、150r/min摇床上分别培养2、4d后，提取检测三嗪类除草剂残存浓度。同时设置不加湿菌体的本发明菌剂作为空白对照，对照与处理均设3个重复。
表4菌剂对其它三嗪类除草剂的降解
结果见表4，降解三嗪类除草剂的菌剂对莠去津、特丁津、扑灭津有良好的降解效果，2d后，莠去津降解率达到99％，特丁津、扑灭津的降解率超过64％；4d后，莠去津、特丁津、扑灭津的降解率均达到96％以上。对“通”、“净”类三嗪类除草剂的降解无明显降解作用。因此本发明菌剂对污染环境中的三嗪类“津”类除草剂残留污染降解具有重要的应用价值。
实施例4
菌剂对苯氧羧酸类(2，4-D)、磺酰脲类除草剂(烟嘧磺隆)的降解
分别向含有50.0mg/L西玛津、扑灭津、2，4-D和烟嘧磺隆的20mL MSM中，加入施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)菌剂0.5g，在30℃、150r/min摇床上分别培养6、24、48h后，提取检测西玛津、扑灭津、2，4-D和烟嘧磺隆的残存浓度。同时设置不加湿菌体的空白菌剂对照，对照与处理均设3个重复。
实验结果如图7可见，菌剂对西玛津、扑灭津的48h降解率分别为99.4％％和71％，对烟嘧磺隆和2，4-D基本无降解效果。由此可见，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzerisp.)aau-3菌剂降解农药的专一性强。
实施例5
施氏假单胞菌aau-3、04243和19851降解西玛津能力对比实验
分别向含有50.0mg/L西玛津的20mL MSM中，加入施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri sp.)04243、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)19851和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3的菌悬液各0.6mL(OD600＝0.6)，在30℃、150r/min摇床上分别培养6、24、48h后，提取检测西玛津的残存浓度。同时设置不加湿菌体的空白对照，对照与处理均设3个重复。
由图8可知，接种相同菌量后，培养6h后，Pseudomonas stutzeri sp.aau-3对50mg/L的西玛津降解率可达94％，而Pseudomonas stutzeri sp.04243和Pseudomonasstutzeri sp.19851仅降解了5.5％和9.2％的西玛津；培养48h后，菌株aau-3完全降解西玛津(100％)，而菌株04243和19851对西玛津的降解小于13％。由此可见，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)aau-3降解西玛津能力显著优于施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri sp.)04243和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)19851。
Claims (10)
1.一种用于降解三嗪类除草剂中津类除草剂的菌剂，其特征在于：所述菌剂是以海藻酸钠、聚乙烯醇、活性炭交联产物为载体，包埋施氏假单胞菌aau-3制成；所述施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri sp.）aau-3菌保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：13560，保藏日期：2017年1月11日。
2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri sp.）aau-3的湿菌体、聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭的配比为1~3：10~14：1~3：1~3，单位为g/L。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri sp.）aau-3的湿菌体、聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭的配比为2： 14：1：2，单位为g/L。
4.制备权利要求1-3中任一项所述用于降解三嗪类除草剂中津类除草剂的菌剂的方法，其特征在于：操作步骤如下：
（1）将聚乙烯醇和海藻酸钠及活性炭依次加入纯水中，搅拌混匀，在压力101 KPa、温度121 ℃条件下灭菌20 min，室温冷却，得到混合液；
（2）在混合液中加入施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri sp.）aau-3的湿菌体，搅拌混匀，得到菌体包埋液；
（3）将包埋液滴加到交联液中，4 ℃静置24 h，洗涤后收集固体颗粒即为用于降解三嗪类除草剂的菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri sp.）aau-3的湿菌体具体制备操作如下：
在无菌条件下，将施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri sp.）aau-3接种于固体培养基中，置于恒温培养箱内避光培养3天，培养温度30±1 ℃，得到活化菌种；将活化后的菌种接种于含药西玛津100mg/L的1000 L富集培养液中，30±1 ℃，150 r/min 恒温摇床内培养36 h，得到菌悬液；将菌悬液于6000 r/min离心10 min，弃去上清液，保留沉淀；用灭菌后的生理盐水洗涤沉淀3次，弃去上清液，得到施氏假 单胞菌（Pseudomonas stutzeri sp.）aau-3的湿菌体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述固体培养基为5‰蛋白胨基础盐固体培养基。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述富集培养液为5‰蛋白胨基础盐液体培养基。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的交联液由硼酸和氯化钙加入水中混合均匀，在压力101 KPa、温度121 ℃条件下灭菌20 min，室温冷却配制成的溶液，硼酸的含量为38 g/L，氯化钙的含量为25 g/L。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的菌剂在降解三嗪类除草剂中津类除草剂上的应用。
10.根据权利要求9所述的菌剂在降解三嗪类除草剂上的应用，其特征在于：所述三嗪类除草剂中津类除草剂为西玛津、莠去津、特丁津、扑灭津。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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