CN103013885A - 苯系物复合降解菌和固定化苯系物复合菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及苯系物复合降解菌和固定化苯系物复合菌剂及其制备方法，苯系物复合降解菌为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）RW10S2 、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ND6和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）BIRD-1的混合物，将苯系物复合降解菌固定在可漂浮易降解的固定化载体上，得固定化苯系物复合菌剂，制备方法简单，制得的固定化苯系物复合菌剂对苯系物降解效果好，在两天内对苯系物的降解率在90%以上，可以广泛应用于去除垃圾渗滤液中的苯系物，还可以用于治理苯系物污染的水体。
Description
技术领域
本发明涉及环境污染治理领域，具体涉及苯系物复合降解菌，还涉及固定化苯系物复合菌剂及其制备方法。
背景技术
BTEX（苯系物）是一类易挥发的单环芳香烃化合物，包括苯（benzene）、甲苯（toluene）、乙苯（ethylbenzene）和二甲苯（xylene），主要存在于原油和石油产品中，又作为工业原料广泛应用于农药、塑料和纤维合成等行业中。由于BTEX本身具有致癌性和致突变性，即使是在很低的浓度下也会产生生物毒性，所以这类化合物已经成为环境关注的焦点。这类化合物具有挥发性，容易进入大气中，参与光化学反应，促进臭氧生成，进一步加剧了光化学烟雾的形成。因此BTEX化合物不仅对大气环境造成严重污染，还会因地下油罐和输油管线腐蚀渗漏等原因污染土壤和地下水源。
到目前为止，BTEX生物降解的研究主要集中在代谢途径，动力学模型等方面，主要研究单一菌种对BTEX的降解，但单菌通常不能同时快速地降解所有污染物。且单菌对环境的适应能力较差，抗环境冲击能力较弱，当环境中pH、温度、盐度等发生变化时，单菌容易失去降解能力。混菌中各种菌产生的酶在降解有机物的过程中具有互补效应和协同增效效应，S.Boonchan报道了青毒菌属真菌与细菌共培养对多聚芳香烃化合物具有良好的降解和矿化作用。Karthiga Nagarajan将一株恶臭假单胞菌、一株红球菌和一株斯氏假单胞菌混合培养，对BTEX的降解率明显高于纯培养条件下的降解率，但是不能降解BTEX中的邻二甲苯。
微生物固定化技术是从20世纪60年代开始迅速发展起来的一项新术，它是通过一定的技术手段将菌体固定在载体上，避免菌体流失，提高菌体利用率，从而简化处理工艺，提高处理效率。固定化微生物在废水处理中的应用是十分广泛的，它的优势主要是：l）浓度高，容积小，处理负荷大幅提高；2）污泥产量低；3）有利于优势菌种的固定，提高降解效率；4）对有毒物质的承受能力强；5）稳定性好。但是，传统的固定化方法存在载体颗粒易破碎、传质阻力大、产气上浮和微生物活性丧失大的缺陷。
发明内容
本发明的目的之一在于提供苯系物复合降解菌，对苯系物的降解效果好；本发明的目的之二在于提供一种固定化苯系物复合菌剂，本发明的目的之三在于提供固定化苯系物复合菌剂的制备方法，本方法简单，条件可控，便于工业化生产。
苯系物复合降解菌，所述苯系物复合降解菌为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）RW10S2、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ND6和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）BIRD-1的混合物。
优选的，所述苯系物复合降解菌为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）RW10S2、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ND6和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）BIRD-1按重量比为1:1:1:1混合。
本发明中苯系物复合降解菌的选育方法，包括如下步骤：
（1）取垃圾填埋场渗滤液，置于装有玻璃珠和蒸馏水的三角瓶中，在30℃、115 rpm条件下培养12小时，取菌悬液接种于含有总浓度为50 mg/L BTEX的筛选培养基中，在30℃、115 rpm条件下培养7天。
（2）取步骤（1）所得菌液，在10000 rpm离心7 分钟，用灭菌的生理盐水洗涤2-3次，接种到含50 mg/L BTEX的筛选培养基中，在30℃，115 rpm摇床里培养4天，再次传代，共驯化10次，驯化过程中BTEX总浓度依次递加，第1、2代BTEX总浓度50 mg/L；第3、4代BTEX总浓度100 mg/L；第5、6代BTEX总浓度150 mg/L；第7、8代BTEX总浓度175 mg/L；第9、10代BTEX总浓度200 mg/L。
其中筛选培养基为：Na2HPO4·12H2O 3.8g/L、KH2PO4 1.0g/L、KCl 3.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、NH4NO3 1.15 g/L，微量元素溶液1mL/L。
微量元素溶液：CaCl2·2H2O 5 g/L，EDTA·2H2O 1 g/L，FeSO4·7H2O 1 g/L，MnCl2·4H2O 160 mg/L，ZnSO4·7H2O 40 mg/L，H3BO3 30 mg/L，CoCl2·2H2O 40 mg/L，CuCl2·2H2O 40 mg/L，NiCl2·H2O 4.6 mg/L，NaMoO4·2H2O 40 mg/L。
2.含有所述苯系物复合降解菌的固定化苯系物复合菌剂。
3.所述固定化苯系物复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：将固定化载体与溶液A混合，加入所述苯系物复合降解菌，混合均匀，得混合物，然后将混合物平铺于容器中，再将溶液B均匀喷淋于所得混合物上，至溶液B完全覆盖所述混合物，密封，进行成膜反应，得固定化苯系物复合降解菌剂；
所述溶液A是将聚乙烯醇配制成浓度为200g/L-250 g/L的溶液，再加入甘油至甘油体积分数为1%-5%而得；所述溶液B为1.0 mol/L-1.5 mol/L的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液。
优选的，所述固定化载体是粒径为0.5-1.0 mm的木屑。
优选的，所述固定化载体与溶液A的体积比为1:1。
优选的，所述苯系物复合降解菌的加入量为加入后混合物中苯系物复合降解菌的终浓度为1 g/L -2 g/L。
更优选的，所述成膜反应为将混合物置于30℃，10 rpm的摇床中培养20 分钟，取出静置40分钟；再次放入30℃，10 rpm的摇床中培养20 分钟，取出静置40 分钟；再次放入30℃，10 rpm的摇床中培养20分钟，取出后于30℃，避光静止培养24小时。
本发明的有益效果：本发明公开了苯系物复合降解菌，以垃圾渗滤液为菌源，利用浓度梯度的苯系物进行筛选驯化，得到的复合降解菌对苯系物的降解效果好，24小时内对200 mg/L 的BTEX降解率为90.11%；本发明还将筛选的复合降解菌进行固定化，并公开了固定化的方法，本方法简单，原料易得，以木屑为固定化载体，然后与聚乙烯醇混合，同时加入甘油做保护剂，最后加入KH2PO4-K2HPO4缓冲液进行固定化，经过固定化的载体可以根据反应器的需要切割成需要的尺寸，可广泛应用于各类型反应器中，避免了填料尺寸带来的反应器堵塞等问题，并且应用本方法得到的固定化载体，不易破碎，孔隙率大，微生物密度高，传质阻力小，木屑还可以为微生物提供一定的营养物质，大大提高了微生物活性。
本发明中使用的聚乙烯醇(PVA) 是一种无毒、价廉、抗微生物分解、机械强度高的高分子材料，被认为是酶及微生物的有效固定化载体之一。聚乙烯醇优异的亲水性可为微生物代谢提供良好的微环境；聚乙烯醇材料经过化学交联或硬化改性处理后机械强度及化学稳定性会显著提高，抗生物降解性能也随之增强等。本发明中利用聚乙烯醇与KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液能够发生成膜反应，克服了固定化载体易破碎、传质阻力大、产气上浮及微生物活性丧失等缺陷。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但所述的实施方式举例不构成对本发明的限制。
实施例1 BTEX复合降解菌剂的选育
BTEX复合降解菌剂的选育，包括如下步骤：
（1）菌种的筛选，取垃圾填埋场渗滤液20 mL，置于装有玻璃珠和80 mL蒸馏水的三角瓶中，在30℃、115 rpm条件下培养12小时，取3 mL菌悬液接种于含有总浓度为50 mg/L BTEX的筛选培养基中，在30℃、115 rpm条件下培养7天。
（2）取步骤（1）所得菌液3 mL，10000 rpm离心7 分钟，用灭菌的生理盐水洗涤2-3次，接种到含50 mg/L BTEX的筛选培养基中，在30℃，115 rpm摇床里培养4天，再次传代，共驯化10次，驯化过程中BTEX总浓度依次递加，第1、2代BTEX总浓度50 mg/L；第3、4代BTEX总浓度100 mg/L；第5、6代BTEX总浓度150 mg/L；第7、8代BTEX总浓度175 mg/L；第9、10代BTEX总浓度200 mg/L。
其中筛选培养基为：Na2HPO4·12H2O 3.8g/L、KH2PO4 1.0g/L、KCl 3.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、NH4NO3 1.15 g/L，微量元素溶液1mL/L。
微量元素溶液：CaCl2·2H2O 5 g/L，EDTA·2H2O 1 g/L，FeSO4·7H2O 1 g/L，MnCl2·4H2O 160 mg/L，ZnSO4·7H2O 40 mg/L，H3BO3 30 mg/L，CoCl2·2H2O 40 mg/L，CuCl2·2H2O 40 mg/L，NiCl2·H2O 4.6 mg/L，NaMoO4·2H2O 40 mg/L。
本发明选育的BTEX降解混菌经过分离纯化，共得到4株降解单菌，菌种鉴定如下表1所示。
表1.菌株的鉴定结果
| 菌株编号 | 菌株名称 |
| 1 | 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida strain）RW10S2 |
| 2 | 施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri） |
| 3 | 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） ND6 |
| 4 | 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） BIRD-1 |
经鉴定，恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida strain）RW10S2与Rokni-Zadeh,H.等公开的恶臭假单胞菌RW10S2菌种相同（见Rokni-Zadeh，H．et al. Genetic and Functional Characterization of Cyclic Lipopeptide White-Line-Inducing Principle (WLIP) Production by Rice Rhizosphere Isolate Pseudomonas putida RW10S2. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2012，78(14)：4826-4834．）；施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）与李慧等公开的施氏假单胞菌菌种相同（见高效石油烃降解菌的分离鉴定及降解特性．哈尔滨工业大学学报，2007，39(10)：1664-1668．）；恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ND6与赵化冰等公开的恶臭假单胞菌ND6菌种相同（见赵化冰等．恶臭假单胞菌ND6 菌株catA 基因的克隆和表达及其儿茶酚裂解途径探讨．微生物学报，2007，47(3)：387-391．）；恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）BIRD-1与Matilla等公开的恶臭假单胞菌BIRD-1菌株菌种相同（见Matilla．Complete Genome of the Plant Growth-Promoting Rhizobacterium Pseudomonas putida BIRD-1．JOURNAL OF BACTERIOLOGY，2011，193(5)：1290-1290．）
将鉴定的4种菌株按重量比为1:1:1:1混合，即苯系物复合降解菌。取0.1g苯系物复合降解菌加入含有200 mg/L BTEX的100 mL 筛选培养基中，在30℃、115 rpm摇床里培养，每隔12小时测定BTEX浓度，测定结果如表2所示。
表2. 复合菌对BTEX的降解率
降解率按如下方法计算：
降解率= (苯系物减少量--苯系物挥发量) / (苯系物总量—苯系物挥发量) ×100 %
即：降解率= (对照组浓度—实验组浓度) /对照组浓度 ×100 %
由表2可知，12小时对BTEX的降解率为35.42%，24小时对BTEX的降解率为90.11%。因此，本发明获得的苯系物复合降解菌24小时内对BTEX的降解率为90.11%，为苯系物的高效降解菌群。
实施例2 固定化苯系物复合菌剂的制备方法
材料准备：
将聚乙烯醇配置成浓度为250 g/L的溶液，再加入甘油至甘油体积分数为1%，记为溶液A。
配制1.0 mol/L的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，记为溶液B，备用。
将木屑粉碎成粒径为0.5 mm-1.0 mm作固定化载体。
将实施例1中制备的BTEX复合降解菌，取0.1g混合菌体加入含有200 mg/L BTEX的100 mL筛选培养基中，混合菌体终浓度1 g/L，培养至OD600=0.8，然后在12000×g条件下离心10 min，收集沉淀，用生理盐水洗涤2-3次，再在12000×g条件下离心10 min，收集沉淀；
BTEX复合菌剂固定化方法，包括如下步骤：
将固定化载体与溶液A按体积比为1:1混合，然后加入菌体至菌体终浓度为2g/L，混合均匀；然后加入溶液B覆盖混合物，密封，然后置于30℃，10 rpm的摇床中培养20 分钟，取出静置40分钟，再次放入30℃，10 rpm的摇床中培养20 分钟，取出静置40 分钟，再次放入30℃，10 rpm的摇床中培养20分钟，取出后于30℃，避光静止培养24小时，然后取出，得固定化BTEX复合菌剂，使用时根据需要切割成不同尺寸。
本实施例中，溶液A配制中，将聚乙烯醇配制成浓度为200g/L-250 g/L的溶液，再加入甘油至甘油体积分数为1%-5%均可获得相同效果的固定化苯系物复合菌剂；溶液B为1.0 mol/L-1.5 mol/L的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液同样能够实现发明目的；加入菌体时菌体终浓度为1 g/L -2 g/L范围内均可实现发明目的。
实施例3
固定化BTEX复合菌剂对垃圾渗滤液中BTEX的降解效果：
将1 g 实施例2制得的固定化的载体置于含有200 mg/L BTEX的100 mL 筛选培养基的中，在30℃，115 rpm摇床里培养，每隔12 小时测定BTEX浓度，如表3所示。
表3. 复合菌剂对BTEX的降解率
由表3所示，混菌2天内对BTEX的降解率在90%以上。因此本发明获得的固定化BTEX复合菌剂具有高效、快速降解BTEX的特点，适用于垃圾渗滤液中BTEX的去除以及被BTEX污染的水体的治理。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (8)
1.苯系物复合降解菌，其特征在于：所述苯系物复合降解菌为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）RW10S2、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ND6和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）BIRD-1的混合物。
2.根据权利要求1所述的苯系物复合降解菌，其特征在于：所述苯系物复合降解菌为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）RW10S2、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ND6和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）BIRD-1按重量比为1:1:1:1混合。
3.含有权利要求1或2所述苯系物复合降解菌的固定化苯系物复合菌剂。
4.权利要求3所述固定化苯系物复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将固定化载体与溶液A混合，加入所述苯系物复合降解菌，混合均匀，得混合物，然后将混合物平铺于容器中，再将溶液B均匀喷淋于所得混合物上，至溶液B完全覆盖所述混合物，密封，进行成膜反应，得固定化苯系物复合降解菌剂；
所述溶液A是将聚乙烯醇配制成浓度为200g/L-250 g/L的溶液，再加入甘油至甘油体积分数为1%-5%而得；所述溶液B为1.0 mol/L-1.5 mol/L的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液。
5.根据权利要求4所述固定化苯系物复合降解菌的制备方法，其特征在于：所述固定化载体是粒径为0.5-1.0 mm的木屑。
6.根据权利要求4所述固定化苯系物复合降解菌的制备方法，其特征在于：所述固定化载体与溶液A的体积比为1:1。
7.根据权利要求4所述固定化苯系物复合降解菌的制备方法，其特征在于：所述苯系物复合降解菌的加入量为加入后混合物中苯系物复合降解菌的终浓度为1 g/L -2 g/L。
8.根据权利要求4-7任一项所述固定化苯系物复合降解菌的制备方法，其特征在于：所述成膜反应为将混合物置于30℃，10 rpm的摇床中培养20 分钟，取出静置40分钟；再次放入30℃，10 rpm的摇床中培养20 分钟，取出静置40 分钟；再次放入30℃，10 rpm的摇床中培养20分钟，取出后于30℃，避光静止培养24小时。
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