CN104686794A - 利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法 - Google Patents

利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法 Download PDF

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施丰成
肖克毅
薛芳
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Abstract

本发明公开了一种利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，先将烟杆粉碎，然后喷洒烟杆末质量5％～25％的纤维素酶溶液，再喷洒烟杆末质量5％～10％的具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌液，或者二者同时喷洒，混合均匀后在遮阴、排水通畅的角落堆放3～5天获得饲料配料，再将饲料配料按照牲畜饲料质量10％～30％的比例添加到牲畜饲料中喂养牲畜。本发明合理利用了烟草废弃物，利用纤维素酶将烟杆中的纤维素部分降解为纤维二糖和葡萄糖，利用降烟碱微生物对烟叶中的烟碱进行降解，所得饲料配料按照10％～30％添加到常规饲料中对牲畜进行饲养，对照组比空白组牲畜体重平均增加5％～10％，节约经济成本8％～25％。

Description

利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法
技术领域
本发明的实施方式涉及烟田废弃物回收再利用技术领域，更具体地，本发明的实施方式涉及一种利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法。
背景技术
我国是世界上烤烟产量最高、种植面积最大的国家，2014年度全国烤烟原烟调拨量达到4100万担(一担为50公斤)，种植面积约为2000万亩。烟草植株一生经历苗期、团棵期、旺长期和成熟期，除了具有工业适用性的烟叶叶片外，烟草植株其他部位，如烟杆、烟根、烟花、烟杈、腋芽、打叶除掉的顶叶和脚叶作为烟草废弃物，大量丢弃在田间，既造成了污染，也是巨大的浪费。
烟杆作为烟草植株的副产物，重量基本占了整个烟草植株的一半，然而根据田间实际调查表明，目前相当多的烤烟烟杆被堆积于田头、水沟、河流旁，部分烟杆随水流走，部分被烟农用水浸泡晒干后作为燃料，还有部分烟杆被直接焚烧，未得到合理的利用。未被利用的烟杆在自然环境下腐解释放的氮、磷、钾养分在雨水的淋洗作用下进入水体，可能对水体环境产生较大的污染(烤烟茎杆对水体环境的影响及其堆肥化利用的研究，福建农林大学硕士论文，2007)。
发明内容
本发明的目的是有效利用烟草田间废弃物，主要针对重量占整个烟草植株一半的烟杆，利用其纤维素含量高的特点，用纤维素酶对其纤维素进行降解，使之部分转化为纤维二糖和葡萄糖，能被牲畜高效地转化利用，当牲畜食用含烟杆的饲料后，能增强其饱腹感，减少饲料的喂养量，降低饲养成本，同时，利用降烟碱微生物将烟碱代谢转化为氨基酸和其他含氮化合物，提高其安全性。本发明提供了上述这种利用纤维素酶处理大田烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法：
一种利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，它包括以下步骤：
(1)将废弃的烟杆粉碎得到粉碎料，粉碎料的直径为0.75～0.85cm；
(2)将纤维素酶与水按照质量比1:50～200混合后得到混合液，按照步骤(1)所述粉碎料质量5％～25％的喷施比例将混合液喷洒在所述粉碎料的表面；
(3)将具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养使菌液中菌体浓度达到107～1010cfu/ml，然后按照步骤(1)所述粉碎料质量5％～10％的喷施比例将菌液喷洒在所述粉碎料的表面；
(4)将喷洒了纤维素酶和菌液的粉碎料混合均匀后在遮阴、排水通畅的角落堆放3～5天获得饲料配料；
(5)将所述饲料配料按照牲畜饲料质量10％～30％的比例添加到牲畜饲料中喂养牲畜。这里的牲畜是指兔子、猪、牛、羊、鸡等。步骤(2)和(3)可以同时进行，也可以先后进行。
步骤(2)所述的混合液和步骤(3)所述的菌液可以同时喷洒在粉碎料上，也可以先喷洒步骤(2)所述的混合液，再喷洒步骤(3)所述的菌液，或者先喷洒步骤(3)所述的菌液，再喷洒步骤(2)所述的混合液。
根据本发明的一种实施方式，步骤(2)所述纤维素酶与水按照质量比1：50～55混合后按照步骤(1)所述粉碎料质量8％的喷施比例将混合液喷洒在所述粉碎料的表面。
根据本发明的另一种实施方式，步骤(2)所述纤维素酶与水按照质量比1：150～155混合后按照步骤(1)所述粉碎料质量20％的喷施比例将混合液喷洒在所述粉碎料的表面。
纤维素酶优选使用宁夏夏盛纤维素酶。选择合适的稀释比例和喷施比例有利于对纤维素酶充分利用，从而达到较好的酶解效果。具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株能够降低烟叶废料中的烟碱，从而减少烟碱对牲畜的影响，增加适口性。
进一步的技术方案是：所述具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株的制备方法是：
A、制备培养基
富集培养基的制备：按照蛋白胨5.0g/L、NaCl1.0g/L、K2HPO41.0g/L、琼脂1.5g/L溶解于水中，调pH为7.0，灭菌，冷却后加入烟碱2000mg/L；
初筛培养基和复筛培养基的制备：按照K2HPO41.0g/L、MgSO40.5g/L、浓度0.1％的MnSO4溶液1ml/L、浓度0.1％的FeSO4溶液3ml/L、琼脂1.5g/L溶解于水中，调pH为6.0～7.0，灭菌，若冷却后加入烟碱4000mg/L得到初筛培养基，若冷却后加入烟碱2000mg/L得到复筛培养基；
种子培养基的制备：按照牛肉膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、NaCl3.0g/L溶解于水中，调pH为7.0，灭菌；
发酵培养基的制备：将50g烟叶盛于三角瓶中，灭菌；
B、初筛
在烟叶基地取烟田土壤10g，加入100ml富集培养基中，30℃静置培养48h获得富集培养液，然后取1ml富集培养液接种于装有50℃初筛培养基的培养皿中，混合均匀，凝固后于30℃恒温培养箱7天，挑取菌落划线分离纯化三次后保藏备用；
C、复筛
将初筛得到的菌株接种于复筛培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养96小时，HPLC检测发酵液中烟碱的含量，挑选出烟碱含量降低的培养基，获得其中的菌株；
D、烟叶发酵
将复筛得到的菌株接种于种子培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养18小时，转接入发酵培养基，于30℃静置培养30天，检测到烟碱含量降低，该复筛得到的菌株即为具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株。
更进一步的技术方案是：所述灭菌的条件是121℃灭菌30分钟。
更进一步的技术方案是：步骤(3)所述菌液的喷施比例为步骤(1)所述粉碎料质量的8％～10％。
烟杆中含有丰富的纤维素，约占38％～45％，且纤维质量好，牲畜在食用纤维素后，能增加饱腹感。纤维素在纤维素酶的作用下，可以部分降解为纤维二糖和葡萄糖，其中，小分子、可溶性的葡萄糖是大多数生物优先利用的碳源营养物质，被牲畜食用后，可以直接地被高效转化利用。此外，烟杆中的糖分、蛋白质、无氮浸出物等营养物质均较丰富，烟碱含量低，符合作为牲畜饲料的要求。
与现有技术相比，本发明的有益效果之一是：本发明合理利用了烟草废弃物，即是对废弃资源的回收再利用，又是对环境污染的有效控制。将大田被扔弃的烟杆利用生物手段，即利用纤维素酶将烟杆中的纤维素部分降解为纤维二糖和葡萄糖，其中葡萄糖作为大多数生物优先利用的碳源营养物质被牲畜高效地转化利用，利用降烟碱微生物对烟叶中的烟碱进行降解，得到产物为氨基酸和其他含氮化合物，提高了其安全性。在此过程中，废弃烟杆被粉碎为直径0.8cm左右的碎末，提高了纤维素酶和降烟碱菌株的作用效果，发酵后的烟杆碎末按照10％～30％的比例添加到牲畜常用的饲料中，既能增加牲畜的饱腹感，又可提高碳水化合物的有效利用率，节约了牲畜饲养成本。
将本专利处理得到的烟杆碎末按照10％～30％添加到常规饲料中对牲畜进行饲养，对照组比空白组牲畜体重平均增加5％～10％，节约经济成本8％～25％。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株的分离纯化
富集培养基：将蛋白胨5.0g、NaCl1.0g、K2HPO41.0g、琼脂1.5g和水定容为1L，pH7.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱2000mg。
初筛培养基：将K2HPO41.0g、MgSO40.5g、浓度0.1％的MnSO4溶液1ml、浓度0.1％的FeSO4溶液3ml、琼脂1.5g与水定容为1L，pH6.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱4000mg得到初筛培养基。
复筛培养基的制备：将K2HPO41.0g、MgSO40.5g、浓度0.1％的MnSO4溶液1ml、浓度0.1％的FeSO4溶液3ml、琼脂1.5g与水定容为1L，pH6.0，121℃灭菌30min，冷却后加入烟碱2000mg得到复筛培养基；
种子培养基：将牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、NaCl3.0g水定容为1L，pH7.0，121℃灭菌30min。
发酵培养基：将50g烟叶盛于三角瓶中，121℃灭菌30min。
7月在重庆丰都太平烟叶基地采集烟田土壤10g，加入100ml富集培养基中，30℃静置培养48h获得富集培养液，然后取1ml富集培养液接种于装有50℃初筛培养基的培养皿中，混合均匀，凝固后于30℃恒温培养箱7天，挑取菌落划线分离纯化三次，接种于复筛培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养96小时，HPLC检测发酵液中烟碱的含量，挑选出烟碱含量降低最多的培养基，获得其中的菌株；将该菌株接种于种子培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养18小时，转接入发酵培养基，于30℃静置培养30天，检测烟碱含量是否降低，若明显降低则复筛得到的菌株即为具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株，该菌株用于制备牲畜饲料。
实施例1
将大田废弃的烟杆100kg用粉碎机制备成大小均一，直径为0.8cm左右的颗粒末；将培养好的菌体浓度达到1010cfu/ml的具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株，按照8％的添加比例喷施到烟杆颗粒末表面；同时将纤维素酶粉末(宁夏夏盛实业集团有限公司生产)按照1:150的质量比与水混合，按照烟杆颗粒末质量20％的添加比例喷施到已经喷施过菌液的烟杆颗粒末表面，在喷施过程中，尽量翻堆，保证均一喷施；然后将烟杆颗粒末堆放在遮阴、排水通畅的角落，经过5天，排干发酵液体；将发酵好的烟杆碎末按照24％的比例添加到鸡常用的饲料中，对鸡进行喂养，喂养70天后，对照组比空白组鸡的体重平均增加9.7％，节约经济成本25％左右。
实施例2
将大田废弃的烟杆100kg用粉碎机制备成大小均一，直径为0.8cm左右的颗粒末；将培养好的菌体浓度达到109cfu/ml的具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株，按照8％的添加比例喷施到烟杆颗粒末表面；将纤维素酶粉末(宁夏夏盛实业集团有限公司生产)按照1:80的质量比与水混合，按照烟杆颗粒末质量15％的添加比例喷施到已经喷施过菌液的烟杆颗粒末表面，在喷施过程中，尽量翻堆，保证均一喷施；然后将烟杆颗粒末堆放在遮阴、排水通畅的角落，经过4天，排干发酵液体；将发酵好的烟杆碎末按照16％的比例添加到羊常用的饲料中，对羊进行喂养，喂养70天后，对照组比空白组羊的体重平均增加6％，节约经济成本12％左右。
实施例3
将大田废弃的烟杆100kg用粉碎机制备成大小均一，直径为0.8cm左右的颗粒末；将纤维素酶粉末(宁夏夏盛实业集团有限公司生产)按照1:55的质量比与水混合，按照烟杆颗粒末质量8％的添加比例喷施到粉碎的烟杆颗粒末表面，在喷施过程中，尽量翻堆，保证均一喷施；将培养好的菌体浓度达到108cfu/ml的具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株，按照10％的添加比例喷施到喷施过纤维素酶的烟杆颗粒末表面；然后将烟杆颗粒末堆放在遮阴、排水通畅的角落，经过3天，排干发酵液体；将发酵好的烟杆碎末按照20％的比例添加到猪常用的饲料中，对猪进行喂养，喂养70天后，对照组比空白组猪的体重平均增加8％，节约经济成本15％左右。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (6)

1.一种利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)将废弃的烟杆粉碎得到粉碎料，粉碎料的直径为0.75～0.85cm；
(2)将纤维素酶与水按照质量比1:50～200混合后，按照步骤(1)所述粉碎料质量5％～25％的喷施比例将混合液喷洒在所述粉碎料的表面；
(3)将具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株活化后发酵培养使菌液中菌体浓度达到107～1010cfu/ml，然后按照步骤(1)所述粉碎料质量5％～10％的喷施比例将菌液喷洒在所述粉碎料的表面；
(4)将喷洒了纤维素酶和菌液的粉碎料混合均匀后在遮阴、排水通畅的角落堆放3～5天获得饲料配料；
(5)将所述饲料配料按照牲畜饲料质量10％～30％的比例添加到牲畜饲料中喂养牲畜。
2.根据权利要求1所述的利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于步骤(2)所述纤维素酶与水按照质量比1：50～55混合后按照步骤(1)所述粉碎料质量8％的喷施比例将混合液喷洒在所述粉碎料的表面。
3.根据权利要求1所述的利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于步骤(2)所述纤维素酶与水按照质量比1：150～155混合后按照步骤(1)所述粉碎料质量20％的喷施比例将混合液喷洒在所述粉碎料的表面。
4.根据权利要求1所述的利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于所述具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株的制备方法是：
A、制备培养基富集培养基的制备：按照蛋白胨5.0g/L、NaCl1.0g/L、K2HPO41.0g/L、琼脂1.5g/L溶解于水中，调pH为7.0，灭菌，冷却后加入烟碱2000mg/L；初筛培养基和复筛培养基的制备：按照K2HPO41.0g/L、MgSO40.5g/L、浓度0.1％的MnSO4溶液1ml/L、浓度0.1％的FeSO4溶液3ml/L、琼脂1.5g/L溶解于水中，调pH为6.0～7.0，灭菌，若冷却后加入烟碱4000mg/L得到初筛培养基，若冷却后加入烟碱2000mg/L得到复筛培养基；
种子培养基的制备：按照牛肉膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、NaCl3.0g/L溶解于水中，调pH为7.0，灭菌；
发酵培养基的制备：将50g烟叶盛于三角瓶中，灭菌；
B、初筛
在烟叶基地取烟田土壤10g，加入100ml富集培养基中，30℃静置培养48h获得富集培养液，然后取1ml富集培养液接种于装有50℃初筛培养基的培养皿中，混合均匀，凝固后于30℃恒温培养箱7天，挑取菌落划线分离纯化三次后保藏备用；
C、复筛
将初筛得到的菌株接种于复筛培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养96小时，HPLC检测发酵液中烟碱的含量，挑选出烟碱含量降低的培养基，获得其中的菌株；
D、烟叶发酵
将复筛得到的菌株接种于种子培养基中，30℃、120rpm条件下振荡培养18小时，转接入发酵培养基，于30℃静置培养30天，检测到烟碱含量降低，该复筛得到的菌株即为具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌株。
5.根据权利要求4所述的利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于所述灭菌的条件是121℃灭菌30分钟。
6.根据权利要求1所述的利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，其特征在于步骤(3)所述菌液的喷施比例为步骤(1)所述粉碎料质量的8％～10％。
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