CN107937357A - 复合微生物制剂高效降解黄曲霉毒素b1的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过分别将分支杆菌、恶臭假单胞菌、少根根霉的微生物发酵液离心、细胞破碎、再加入上清液混合搅拌均匀、离心、过滤的方法获得的提取液，各自以特定的组分比混合制成一种高效降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的复合微生物制剂，属于微生态制剂领域。以上三种提取液，取任意两种提取液混合时，使两者各自所占组分比在20～80%，之和为1；或三种提取液混合时，使三者各自所占组分比在20～60%，之和为1。利用国标法（编号：GB/T 17480‑2008）检测残余毒素，得出复合微生物制剂能够将50～1000ppb的AFB1高效降解，降解区间为75～88%。探索复合微生物制剂的最适条件，发现与三组分单独降解AFB1效率相比，复合微生物制剂在相同条件下降解AFB1时，降解效率提升20%以上。

Description

复合微生物制剂高效降解黄曲霉毒素B1的制备方法

技术领域

本发明属于微生态制剂领域，具体涉及一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合微生物制剂的制备方法。

背景技术

黄曲霉毒素是真菌的次级代谢产物，主要由黄曲霉、寄生曲霉等产生。最典型的是黄曲霉毒素B1，其具有很强的致癌、致畸和致突变作用，危害人类和动物的健康。黄曲霉毒素的泛滥会给全世界带来巨大的经济损失。目前采用物理方法以及化学方法处理黄曲霉毒素存在很多缺陷，比如去除黄曲霉毒素不彻底，在处理过程中产生副产物，处理过后的产品品质下降以及处理中发生其他的污染等。生物法降解黄曲霉毒素成为了当今的热点。据报道当前已经有很多微生物能够对黄曲霉毒素进行降解作用，其中一部分是能够降解黄曲霉毒素的真菌和细菌产生酶的作用效果。

国内外已报道的能够降解黄曲霉毒素B1的微生物可以分为真菌生物以及细菌生物两个大类，据报道孢霉能够生化降解黄曲霉毒素B1环戊烷环上的酮羰基。黄曲霉毒素B1同样可被少根根霉生物降解成异构羟基化合物。细菌降解黄曲霉毒素B1的报道也很多，研究认为解毒作用多源于胞外代谢产物。国内外对降解黄曲霉毒素B1的细菌进行了大量研究，比如分支杆菌、红串红球菌、橙色黄杆菌、枯草芽孢杆菌、橙红色黏球菌等等。王宁等对橙红色粘球菌的培养基和发酵产酶条件进行优化，在最佳发酵条件下粘球菌对黄曲霉毒素B1的降解率达到78.2%。中国农业大学动物营养国家重点实验室从动物肠道分离出1株枯草芽胞杆菌，其发酵液能同时降解溶液中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素M1达80%以上。生物法降解黄曲霉毒素B1以其降解率高、污染小的优越性逐渐被越来越多的研究人员所重视。但是生物法降解黄曲霉毒素B1主要是以一株菌及其产物进行的，以不同的种类的菌株发酵生产液进行处理，将处理之后的提取液以不同的组分百分比结合在一起发挥共同降解作用的研究甚少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合微生物制剂的制备方法。

本发明采用的分支杆菌、恶臭假单胞菌、少根根霉来自于本实验室保藏。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合微生物制剂：由分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉的提取液按照任意两种提取液或者三种提取液各自按照一定的组分百分比混合而成。

进一步在制备复合微生物制剂时，由分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉的提取液以任意两者提取液混合，保证两者各自所占组分百分比在区间20%～80%以内，并且两组分之和为100%。

进一步在制备复合微生物制剂时，由分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉的提取液三者混合而成时，保证三者各自所占组分百分比在区间20%～60%以内，并且三组分百分比之和为100%。

本发明高效降解黄曲霉毒素B1的复合微生物制剂的制备方法包括以下步骤：

（1）分别发酵培养分支杆菌、恶臭假单胞菌以及少根根霉，将三者的发酵液分装在离心管中，8000rpm离心20分钟，将上清液与下层菌体分开，将菌体于冰浴下超声波破碎，破碎之后，将之前分离的上清液再次加入到破碎后的细胞溶液当中，充分搅拌并混合均匀之后，再经过8000rpm离心20分钟，取离心后的上清液通过0.22µm的滤膜过滤，得到分支杆菌、恶臭假单胞菌以及少根根霉的提取液。

（2）将上述分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉提取液任意两种混合制成复合微生物制剂，其中两种提取液都满足所占组分百分比在区间20%～80%以内，并且两组分之和为100%。将上述分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉提取液三者混合制成复合微生物制剂，其中三种提取液都满足所占组分百分比在区间20%～60%以内，并且三组分之和为100%。

本发明之一种提升黄曲霉毒素B1降解效率20%以上的方法，其中，将上述分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉提取液三者混合制成复合微生物制剂，其中三种提取液都满足所占组分百分比在区间20%～60%以内，并且三组分之和为100%。之后将此复合微生物制剂进行超滤浓缩，浓缩之后使其作用于黄曲霉毒素B1时，控制其在降解黄曲霉毒素B1的温度为35℃～37℃，PH为5.5～6.5。

进一步，在步骤（11）中，将复合微生物制剂进行超滤浓缩，浓缩之后使其作用于黄曲霉毒素B1时，控制其在降解黄曲霉毒素B1的温度为36℃，PH为6.5。

本发明主要是考虑到将不同种类降解功能降黄曲霉毒素B1菌株的提取液进行混合，发挥提取液复配之后产生的协同效应。考虑到不同提取液中所含酶的化学性质和作用位点的不同，将不同种类细菌和真菌的提取液进行配比混合，使不同种类的降解酶汇聚在相同的环境里，发挥不同种类的酶之间相互作用，从而提升混合液的降解效率。

不同的酶对黄曲霉毒素的降解能力以及作用位点存在差异。分支杆菌以脱氮黄素辅因子 F₄₂₀H₂为辅酶的还原酶体系能催化黄曲霉毒素B1的α,β-不饱和酯的还原，激发黄曲霉毒素B1内酯环不饱和双键自发水解成一种新的降解产物。恶臭假单胞菌能够将黄曲霉毒素B1降解为低毒性的黄曲霉毒素Ｄ1、黄曲霉毒素D2和黄曲霉毒素D3，通过裂解黄曲霉毒素B1内酯环结构从而达到降解毒性效果，因此推测其能够降解黄曲霉毒素的氧杂萘邻酮环中芳香内酯部分。少根根霉经报道能够降解黄曲霉毒素B1，并且已经确定其能够作用于AFB1环戊烷环上的酮羰基，并将AFB1生物降解为异构羟基化合物。

本发明复合微生物制剂中，分支杆菌和恶臭假单胞菌属于细菌，并且其提取液包含酶的作用位点不同。少根根霉属于真菌，其提取液降解机理与两种细菌存在差异。将两者提取液或三者提取液以一定组分百分比混合，使不同种属的微生物提取液结合起来，发挥不同种类酶的作用位点互补作用，从而使复合微生物制剂具有多方位降解黄曲霉毒素B1的作用效果，充分提升混合液的降解黄曲霉毒素B1的效率。

本发明高效降解黄曲霉毒素的微生物制剂特点在于，采用三种不同菌株的发酵液进行处理，经过离心、过滤、细胞破碎、再加入上清液混合搅拌均匀、离心、过滤的方式得到三种不同的提取液。将两种提取液混合或者三种提取液混合而成的微生物制剂。由于本复合微生物制剂中包含大量的胞外酶以及胞内酶，其对黄曲霉毒素B1的降解起到很重要的作用。其次，在进行细胞破碎的同时引入了一些细胞器和细胞膜碎片等，这些细胞内容物质和细胞膜碎片会对黄曲霉毒素B1起到一定的物理吸附作用，同时二者的结合在整体上提升对黄曲霉毒素B1的降解作用。

本发明在研究复合微生物制剂降解黄曲霉毒素效率的过程中，充分考虑了各部分环境因素对降解效率的影响。经研究发现，在控制微生物制剂体系的降解温度，降解过程中体系的PH都是影响降解效率的重要因素。在保证相同的温度、PH以及浓度的情况下，与分支杆菌的提取液、恶臭假单胞菌的提取液以及少根根霉的提取液分别单独降解黄曲霉毒素B1的效率相比，复合微生物制剂在相同条件下降解同等浓度的黄曲霉毒素B1时，降解效率提升20%以上。

复合微生物制剂在处理饲料中黄曲霉毒素B1中的应用。

本发明之复合微生物制剂污染小，降解黄曲霉毒素B1降解率高，并且经过条件优化能够高效率降解黄曲霉毒素B1，在生物法降解饲料中的黄曲霉毒素具有广阔的前景。实验证明，分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉提取液，在任意两者提取液混合时，保证两者各自所占组分百分比在区间20%～80%以内，并且两组分之和为100%，或者任意三者提取液混合时，保证三者各自所占组分百分比在区间20%～60%以内，并且三组分百分比之和为100%，所制成的微生物复合制剂能够将50ppb～1000ppb浓度的黄曲霉毒素B1高效率的降解，其降解率区间为75%～88%。通过对复合微生物制剂的浓度，以及最适温度36℃，最适PH6.5研究，发现与相同条件下三者单独降解黄曲霉毒素B1效率相比，复合微生物制剂在相同条件下降解同等浓度的黄曲霉毒素B1时，降解效率提升20%以上。

附图说明

图1为混合微生物制剂在浓缩后，在36℃，PH6.5的条件下将黄曲霉毒素B1（100ppb）降解50%所需时间示意图。图中1、2、3分别代表分支杆菌、恶臭假单胞菌以及白腐真菌的提取液分别单独将黄曲霉毒素B1（100ppb）降解50%所需的时间。4、5、6代表将分枝杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉的提取液分别以组分百分比（20%，20%，60%），（40%，40%。20%），（30%，30%，40%）制成复合微生物制剂，其将黄曲霉毒素B1（100ppb）降解50%所需的时间。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体的实施方式进一步详细描述。以下实施例是用来进一步说明本发明的内容，而不限制本发明的保护范围。对于本发明所涉及的相关内容及所做的修改，均属于本发明保护范围。

实施例1

将分支杆菌、恶臭假单胞菌和少根根霉分别接种在发酵培养基上培养，之后将三者发酵培养液分装于离心管中，8000rpm离心20分钟，将上清液与菌体分离，之后对分离的菌体进行细胞破碎，采用细胞破碎仪并在冰浴的环境下操作。将上清液再次倒入破碎好的细胞液里，混合之后再次以8000rpm离心20分钟。取上清液再于0.22µm的滤膜过滤，收集分支杆菌、恶臭假单胞菌和少根根霉的提取液。备用。

将恶臭假单胞菌提取液（所占组分百分比20%）与分支杆菌提取液（所占组分百分比80%）混合制成复合微生物制剂，取50ml复合微生物制剂，将复合微生物制剂与黄曲霉毒素B1标准溶液混合使黄曲霉毒素B1初始浓度为1000ppb。37℃下培养72小时后利用国标法（编号：GB/T 17480-2008）检测剩余黄曲霉毒素B1的含量。

黄曲霉毒素B1降解率利用以下公式计算:

降解率=(1-样品中AFB1峰面积/空白对照中AFB1的峰面积)× 100%

经检测，剩余黄曲霉毒素B1浓度为196ppb，黄曲霉毒素初始浓度1000ppb为对照组，复合微生物制剂的降解率达到了80.4%。

实施例2

在实施例1的制备提取液的基础上，将分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液和少根根霉提取液分别以20%、20%、60%的组分百分比混合制备复合微生物制剂。将复合微生物制剂与黄曲霉毒素B1标准溶液混合使黄曲霉毒素B1初始浓度为100ppb。37℃下培养72小时后利用国标法（编号：GB/T 17480-2008）检测剩余黄曲霉毒素B1的含量。

黄曲霉毒素B1降解率利用以下公式计算:

降解率=(1-样品中AFB1峰面积/空白对照中AFB1的峰面积)× 100%

经检测，剩余黄曲霉毒素B1浓度为15ppb，黄曲霉毒素B1初始浓度100ppb为对照组，复合微生物制剂的降解率达到了85%。

实施例3

在实施例1的制备提取液的基础上，将分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉提取液分别以40%、40%、20%的组分百分比混合制备复合微生物制剂。将复合微生物制剂超滤浓缩三倍体积之后，取50ml并加入黄曲霉毒素B1标准品，使黄曲霉毒素B1初始浓度为100ppb，控制培养温度为36℃，PH为6.5，检测黄曲霉毒素剩余含量为50ppb时所需要的降解时间。同样，将分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉提取液分别以相同的条件进行处理，同样经过超滤浓缩三倍体积之后，取50ml加入黄曲霉毒素B1标准品，使黄曲霉毒素B1初始浓度为100ppb，控制培养温度为36℃，PH为6.5，检测黄曲霉毒素剩余含量为50ppb时所需要的降解时间。

降解效率提升百分比=实际缩短的降解时间/单独作用时所消耗的时间×100%

如图1所示，当检测黄曲霉毒素B1剩余含量为50ppb时，复合微生物制剂用了8h，相比单独分支杆菌提取液所需的13小时效率提升了38.46%，相比恶臭假单胞菌提取液所需15小时效率提升了46.67%，相比少根根霉提取液所需13.5小时效率提升了40.74%。复合微生物制剂能够更快的降解相同浓度的黄曲霉毒素，缩短了降解毒素的时间从而提高了降解效率。

Claims (6)

1.一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合微生物制剂：由分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉的提取液按照任意两种提取液或者三种提取液各自按照一定的组分百分比混合而成。

2.如权利要求1所述一种高效降解黄曲霉毒素B1的复合微生物制剂，其特征在于进一步在制备复合微生物制剂时，由分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉提取液以任意两者提取液混合，保证两者各自所占组分百分比在区间20%～80%以内，并且两组分之和为100%。

3.如权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于由分支杆菌提取液、恶臭假单胞菌提取液以及少根根霉提取液三者混合而成时，保证三者各自所占组分百分比在区间20%～60%区间以内，并且三组分百分比之和为100%。

4.一种提升黄曲霉毒素B1降解效率20%以上的方法，其特征在于，优化权利要求3所述的复合微生物制剂，控制其在降解黄曲霉毒素B1的温度为35℃～37℃，PH为5.5～6.5，并浓缩。

5.权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于，复合微生物制剂包含酶的作用位点不同。

6.权利要求2所述的复合微生物制剂或权利要求3所述的复合微生物制剂以及权利要求4优化过的复合微生物制剂，其在处理饲料中黄曲霉毒素B1中的应用。