CN106133143A

CN106133143A - 用于生产3‑羟基丙酸的酯的方法

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Publication number: CN106133143A
Application number: CN201580007725.6A
Authority: CN
Inventors: 艾琳·芬尼根
Original assignee: Verdant Bioproducts Ltd
Current assignee: Verdant Bioproducts Ltd
Priority date: 2014-02-07
Filing date: 2015-02-06
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2035-02-06
Also published as: US20160348137A1; WO2015118341A1; US10131925B2; JP6838968B2; GB201402173D0; CN106133143B; EP3102689A1; JP2017505133A; BR112016018102A2

Abstract

描述了用于生产3‑羟基丙酸的酯的方法，所述方法包括：在含有大于1g/升的水平的磷酸根的生长培养基中培养罗旺醋杆菌(Acetobacter lovaniensis)细菌，其中所述细菌的培养产生所述3‑羟基丙酸的酯。

Description

用于生产3-羟基丙酸的酯的方法

发明领域

本发明涉及通过在特定生长条件下培养醋杆菌属(Acetobacter)微生物而生产3-羟基丙酸的酯的方法。这些酯可以水解形成3-羟基丙酸(3HP)。

发明背景

已经证明多种微生物产生羟基羧酸，如3-羟基丙酸(Andreeken,B.，和Steinbuchel，A.，Applied and Environmental Microbiology(2010)，76，4919-4925)，3-羟基丁酸(Aslim，B.，Caliskan，F.，Beyatli，Y.和Gunduz，U.，FEMS Microbiol.Lett(1998)，159，293-297)，3-羟基戊酸(Steinbuchel，A.，Debzi，E-M.，Marchessault，R.H和Timm，A.，Applied Microbiology and Biotechnology(1993)，39，443-449)以及它们的聚链烷酸酯形式的聚合物(US20120129232)。通常，羟基羧酸及其对应的聚链烷酸酯响应营养限制性生长条件产生(Brigham，C.J.，Kurosawa，K.，Rha，C.，和Sinskey，A.J.，S3Microbialand Biochemical Technology(2011))。羟基羧酸，特别是3-羟基丙酸的产生具有商业重要性，原因在于其容易被转化为丙烯酸和其他化学品。作为结果，3-羟基丙酸(CAS号503-66-2)是一种有价值的平台化学品。

通过遗传修饰的微生物生产3-羟基丙酸已经成为许多专利(US20090325248，US20100021978，WO2012/0301935，US2012244588和US20110125118)的焦点。这些专利记载了发酵工艺，其中，通过已知的修饰的途径，将碳水化合物(如糖或甘油)源转化为3HP。产量以多种形式记载，WO2012/0301935给出了0.97g 3HP/克加入的甘油的结果，US20110125118描述了0.05g/g细胞干重/小时或0.05g/升/小时的结果。

最近以来，记载了在激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)中的二氧化碳向3-羟基丙酸的转化(WO2013/067326)。已改造该生物体通过无细胞提取物或重组菌株的全细胞利用二氧化碳和氢气产生3HP。然而，该生物体被遗传修饰，并且需要70至73℃的生长温度。

收集的3HP通过充分确定的化学方法转化为丙烯酸。然而，所有生物学方法的主要问题是，尽管3HP的产量在商业有用的水平，但是该分子难以从用过的细菌培养基中存在的其他物质的背景中提取并且成本昂贵。另外，起始原料的成本也妨碍生物3HP生产的商业化。

WO2013/011292记述了能够产生长链脂族羧酸的微生物。该文件记述了一种称为罗旺醋杆菌(Acetobacter lovaniensis)FJ1的特定菌株，其保藏号为NCIMB 41808(根据布达佩斯条约的规定，于2011年1月12日保藏在NCIMB Ltd.(Ferguson Building，CraibstoneEstate，Bucksburn，Aberdeen，AB21 9YA))。

发明概述

已经令人惊讶地发现，WO2013/011292记载的罗旺醋杆菌菌株能够产生3-羟基丙酸的酯。之前并不知晓该微生物能够产生此类产物。

本发明涉及一种利用WO2013/011292中记述的微生物生产3-羟基丙酸的酯的方法。WO2013/011292的公开内容完全结合在本文中。已经表明，该微生物具有在富含磷酸根的生长方案中生产羟基羧酸酯和酸的能力。

在第一方面，本发明提供一种生产3-羟基丙酸的酯的方法，所述方法包括：在含有大于1g/升的水平的磷酸根的生长培养基中培养罗旺醋杆菌细菌，其中该细菌的培养产生3-羟基丙酸的酯。

优选地，3-羟基丙酸的酯是3-羟基丙酸乙酯。作为结果，所述方法用于生产3-羟基丙酸乙酯，所述方法包括：在含有大于1g/升的磷酸根的生长培养基中培养罗旺醋杆菌细菌，其中该细菌的培养产生3-羟基丙酸乙酯。

罗旺醋杆菌细菌在含有大于1g/升的磷酸根的生长培养基中培养。1g/升是生长培养基中磷酸根离子(PO₄ ^3-)的量而不是生长培养基中包含磷酸根的化合物的量。例如，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)具有136的相对分子量。其磷酸根部分具有95的相对分子量。因此，如果将136克KH₂PO₄加入到100升水中，则在水中有1.36g/升的KH₂PO₄，而水中的磷酸根将为0.95g/升。

在一些实施方案中，生长培养基优选地含有大于2g/升水平的磷酸根。在其他实施方案中，生长培养基含有大于3g/升的磷酸根。在进一步的实施方案中，生长培养基含有大于4g/升的磷酸根。在具体的实施方案中，生长培养基含有大于5g/升的磷酸根。在一些实施方案中，生长培养基含有大于6g/升的磷酸根。在其他实施方案中，生长培养基含有大于7g/升的磷酸根。在进一步的实施方案中，生长培养基含有大于8g/升的磷酸根。在具体的实施方案中，生长培养基含有大于9g/升的磷酸根。在一些实施方案中，生长培养基含有大于10g/升的磷酸根。在其他实施方案中，生长培养基含有大于11g/升的磷酸根。在进一步的实施方案中，生长培养基含有大于12g/升的磷酸根。在优选的实施方案中，生长培养基含有大于13g/升的磷酸根。在另一个优选的实施方案中，生长培养基含有大于14g/升的磷酸根。

在一些实施方案中，生长培养基含有小于150g/升的水平的磷酸根。在其他实施方案中，生长培养基含有小于100g/升的磷酸根。在进一步的实施方案中，生长培养基含有小于80g/升的磷酸根。在多个实施方案中，生长培养基含有小于70g/升的磷酸根。在具体的实施方案中，生长培养基含有小于60g/升的磷酸根。在一些实施方案中，生长培养基含有小于50g/升的磷酸根。在其他实施方案中，生长培养基含有小于45g/升的磷酸根。在进一步的实施方案中，生长培养基含有小于40g/升的磷酸根。在具体的实施方案中，生长培养基含有小于35g/升的磷酸根。在一些实施方案中，生长培养基含有小于30g/升的磷酸根。在其他实施方案中，生长培养基含有小于25g/升的磷酸根。在进一步的实施方案中，生长培养基含有小于20g/升的磷酸根。在具体的实施方案中，生长培养基含有小于15g/升的磷酸根。

在一些实施方案中，生长培养基含有在1至150g/升之间的水平的磷酸根。在其他实施方案中，生长培养基含有2至100g/升之间的磷酸根。在进一步的实施方案中，生长培养基含有3至80g/升之间的磷酸根。在多个实施方案中，生长培养基含有4至70g/升之间的磷酸根。在具体的实施方案中，生长培养基含有5至60g/升之间的磷酸根。在一些实施方案中，生长培养基含有6至50g/升之间的磷酸根。在其他实施方案中，生长培养基含有7至45g/升之间的磷酸根。在进一步的实施方案中，生长培养基含有8至40g/升之间的磷酸根。在具体的实施方案中，生长培养基含有9至35g/升之间的磷酸根。在一些实施方案中，生长培养基含有10至30g/升之间的磷酸根。在其他实施方案中，生长培养基含有11至25g/升之间的磷酸根。在进一步的实施方案中，生长培养基含有12至20g/升之间的磷酸根。在具体的实施方案中，生长培养基含有13至15g/升之间的磷酸根。

生长培养基可以是允许罗旺醋杆菌细菌生长和繁殖并且产生3-羟基丙酸的酯的任意适当的生长培养基。生长培养基可以包含多种允许细菌生长和繁殖的成分/营养物。生长培养基可以包含下述添加剂中的一种或多种：钾盐，镁盐，锰盐，铁盐，铜盐，钴盐，钠盐，锌盐，钙盐，钼盐，氯化物，硫酸盐，钼酸盐和碳酸盐。这些添加剂通常以0.01至2g/升之间存在于生长培养基中。

在一些实施方案中，生长培养基可以具有下述指定量的一种或多种添加剂：

成分	g/1000ml
		磷酸一氢钾	10-30
氯化镁	0.1-2
		氯化锰	0.01-0.1
三氯化铁	0.01-0.1
		硫酸铜	0.01-0.1
氯化钴	0.01-0.1
		钼酸钠	0.01-0.1
氯化锌	0.1-1

在具体的实施方案中，生长培养基具有下述组成：

成分	g/1000ml
		磷酸一氢钾	20
氯化镁	1
		氯化锰	0.05
三氯化铁	0.05
		硫酸铜	0.05
氯化钴	0.05
		钼酸钠	0.05
氯化锌	0.5

优选地，生长培养基不包含外源性氮源。由于该细菌能够固定溶解在生长培养基中的来自大气的氮，因此这是不需要的。

所述细菌能够固定二氧化碳。因此，除溶解在生长培养基中的来自大气的二氧化碳，生长培养基不需要外源性碳源。然而，在一些实施方案中，在培养细菌之前或在培养过程中，二氧化碳可以在生长培养基中鼓泡，以增加溶解在生长培养基中的二氧化碳的量。细菌可以使用二氧化碳作为唯一的碳源。

在一些实施方案中，向生长培养基中加入甘油作为另外的碳源。优选地，这在所述细菌开始生长和繁殖后进行。

生长培养基可以具有3.5至9之间的pH。优选地，生长培养基具有4至7之间的pH。由于酸性条件可能使得3HP的酯水解成为3HP，而可能减少回收产量，因此，生长培养基的pH优选不太低。在具体的实施方案中，生长培养基的pH约是4.5。

生长培养基优选地是水性的，以使营养物/添加剂溶解在水中。

所述细菌通常在0℃至60℃之间的温度培养。优选地，所述细菌在10℃至40℃之间的温度培养。在一些实施方案中，所述细菌在15℃至30℃之间的温度培养。

所述细菌通常培养至生长培养物达到在600nm测量的0.75至1.00之间的光密度(OD₆₀₀)。

在培养过程中，培养物可以用另外的生长培养基稀释，以增加培养物的体积。因此，当需要提取3HP的酯时，培养物应该具有0.75至1.00之间的最终光密度。

所述细菌可以培养12至36小时之间。在一些实施方案中，细菌可以培养18小时-30小时。

通过培养罗旺醋杆菌细菌而产生3-羟基丙酸的酯。所述细菌可以是能够产生3-羟基丙酸的酯的任意合适的罗旺醋杆菌细菌。这包括菌株FJ1(保藏号为NCIMB 41808)和与FJ1相关或衍生于FJ1的相似的菌株。术语“衍生于”意指可以将FJ1修饰或突变，以产生另外的细菌。例如，可以插入基因或从FJ1去除基因。衍生于FJ1的细菌应该与FJ1功能等同，并且应该能够产生3-羟基丙酸的酯。此外，衍生的细菌应该能够在与FJ1相同的条件下生长。优选地，所述细菌是保藏号为NCIMB 41808的菌株FJ1。细菌可以通过本领域技术人员公知的方法鉴定为罗旺醋杆菌细菌，例如，通过使用16S rDNA分析进行鉴定。

细菌在其生长时产生3-羟基丙酸的酯，因此，当完成细菌的培养时，在生长培养基中将存在3-羟基丙酸的酯。然后，如果需要，可以提取3-羟基丙酸的酯。

所述方法可以进一步包括从生长培养基中分离3-羟基丙酸的酯的步骤。这可以是第一分离步骤。这可以以任意适当的方式进行，并且多种方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。

例如，3-羟基丙酸的酯可以利用蒸馏分离，包括标准蒸馏，分馏，真空蒸馏，用夹带剂蒸馏，溶剂萃取然后用蒸馏回收，和连续蒸馏。其他分离方法包括膜灌注、电化学分离或使用临界二氧化碳。

如果在1大气压下进行蒸馏(而不是如真空蒸馏那样在减压下进行)，例如，使用侧臂冷凝器进行，3HP酯将包含在前10-15％的馏出物中，并且在95℃至100℃之间的温度收集，具体地，在约98℃收集。通常，作为共沸物收集3HP酯。

当分离了3-羟基丙酸的酯时，可以将其转化为3HP。这包括酯键的分解，从而产生3HP。用于其的适当方法是本领域技术人员公知的。例如，3HP的转化可以通过酸化包含3-羟基丙酸的酯的样品引起该酯酸水解而进行。这可以通过向3HP酯中加入酸进行。适当的酸包括盐酸和硫酸。备选地，3HP酯可以用碱水解。这将产生3-羟基丙酸盐，该盐可以转化为酸形式，例如，使用浓酸转化。

一旦转化为3HP，然后可以发生第二分离步骤，以从在转化过程后存在的任意其他产物(例如醇)中分离3HP。该第二分离可以使用任意适当的方法进行。例如，3HP可以利用蒸馏分离，蒸馏包括标准蒸馏，分馏，真空蒸馏，用夹带剂蒸馏，溶剂萃取然后用蒸馏回收，和连续蒸馏。其他分离方法包括膜灌注、电化学分离或使用临界二氧化碳。

如果在1大气压下进行蒸馏(而不是如真空蒸馏那样在减压下进行)，例如，使用分馏柱进行，3HP将95℃至100℃之间的温度馏出，典型地在约98℃馏出。通常，3HP作为共沸物收集。

在第二分离步骤后，产生相对纯的3HP样品，通常是水溶液形式。

一旦分离，可以将3HP干燥，以去除一些水。这可以使用试剂(诸如，但不限于，氯化物盐(钙或钠))或分子筛3A进行。

如上文所示，3HP是一种平台化学品，因此，然后可以将其进一步加工成其他的化学品，诸如3-羟基丙酸盐(包括3-羟基丙酸的铵盐、钠盐和钙盐)、3-羟基丙酸酯(例如，甲酯、丙酯和丁酯)、丙烯酸、丙烯酸酯/盐(丙烯酸及其衍生物的盐、酯和共轭碱)、聚丙烯酸、丙烯酸酯聚合物、丙烯腈、丙烯酰胺、丙烯醛、1,3-丙二醇和Reuterin。

在具体的实施方案中，提供用于生产3-羟基丙酸的方法，所述方法包括：

在包含10至30g/升之间的水平的磷酸根的生长培养基中培养保藏号为NCIMB41808的罗旺醋杆菌菌株FJ1，其中所述细菌的培养产生3-羟基丙酸乙酯；

从生长培养基中分离所述3-羟基丙酸乙酯；

将3-羟基丙酸乙酯转化为3-羟基丙酸；和

分离所述3-羟基丙酸。

在这一实施方案中，磷酸根水平记述为10至30g/升之间。然而，在该具体实施方案中，可以使用上述任一水平。例如，磷酸根水平可以大于1g/升，或磷酸根水平可以为13至15g/升之间，或者是介于之间的任意实施方案。

认为负责产生3HP酯的酶在所述细菌的细胞外。这些酶起作用，而不管是否存在细菌的细胞。因此，在本发明的另一方面，提供用于生产3HP的酯的方法，所述方法包括：提供包含在含有大于1g/升的水平的磷酸根的生长培养基中培养的罗旺醋杆菌细菌的无细胞提取物的水性培养基，其中在所述水性培养基中产生3HP酯。

以上对于本发明第一方面的方法所描述的步骤，例如，涉及分离3HP酯等，同等适用于本发明的这一方面。

所述培养基可以通过将所述细菌培养一段时间以允许在培养基中产生酶系统而产生。可以通过在培养后从培养基中去除细菌的细胞，例如，通过反复超滤去除，而制备无细胞提取物。

在本发明的另一方面，提供包含在含有大于1g/升的水平的磷酸根的生长培养基中培养的罗旺醋杆菌细菌的无细胞提取物的水性培养基。

发明详述

现在将仅参考附图通过实施例的方式详细描述本发明，在所述附图中：

图1是显示通过罗旺醋杆菌FJ1合成3HP酯(在存在升高的磷酸根水平的条件下，依赖二氧化碳生长)及其后续的回收的流程图。

概述

在存在富集的磷酸根水平的条件下，并且任选地在不存在外源性氮源和碳源的条件下，罗旺醋杆菌FJ1产生不同的代谢物组合，其包括，但不限于羟基羧酸。3-羟基丙酸以商业可用水平生产(无需进行氮限制)，并且其在体内转化为乙酯。

不希望困于具体的理论，认为在存在升高的磷酸根水平的条件下，存在经由羟基丙酸酯循环向二氧化碳固定的代谢转换(Tabita，F.J.，PNAS(2009)，106，21015-21016；Strauss，G.和Fuchs.G.，Eur.J.Biochem(1993)，215，633-643)。另外，经由固氮酶型复合物的氮固定导致产生氢(Tamagnini P.，Axelssen R.，Lindberg P.，Oxelfelt F.，Wenschiers R.和Lindblad P.，Microbiology and Molecular Biology Reviews(2002)，66，11-20)，其由氢化酶利用并且平衡生物体的氧化还原系统。尽管在其他的生物体中注意到碳和氮同化作用(Levican G.，Ugalde J.A.，Ehrenfeld M.，Maass A.，和Parada P.，BMCGenomics(2008)，581，1186；Dubbs J.M.和Tabita F.R.，Fems Microbiol Rev.(2004)，28，353-356；McKinlay J.B.和Harwood C.S.，PNAS(2010)，1073，1-7)，利用二氧化碳作为经由固氮酶系统的氧化还原循环机制之前仅在不产生氧的光养性细菌(诸如非硫紫菌)中注意到，其中二氧化碳经由Calvin Benson Basham循环被还原。醋杆菌属(Acetobacter)物种可以能够利用该作用。尽管不具有功能性Calvin Benson Basham循环，它们确实保留该循环的遗传元件，或者利用3HP循环产生相同的作用。除此之外，可以如在罗旺醋杆菌中观察到的那样操纵3HP的质子动力依赖性流出系统(Matsushita K.，Inoue T.，Adachi O.，和Toyama H.J.，Bacteriol.(2005)，187，4346-4352)。

在罗旺醋杆菌FJ1中注意到酯的合成。除此之外，认为3HP的酯化起源于借助罗旺醋杆菌FJ1的乙酸到乙醇的转化，之后与3HP酯化。这是一种新的酯化途径，产生3HP乙酯。与3HP本身相比，该产物更经济地从用过的细菌培养基中回收。例如，回收可以通过利用在约98℃在酯和水之间形成的共沸物的简单的蒸馏实现。这种回收的容易性使得提取3HP酯相对便宜。然后，可以将3HP的酯进一步转化成多种商业可用的产物，如3HP，3HP的钠盐、钙盐和铵盐，丙烯酸，丙烯酸酯/盐，丙烯酰胺，丙烯醛和1,3-丙二醇。

生产3-羟基丙酸乙酯-CAS号623-72-3的过程

将罗旺醋杆菌FJ1(保藏号：NCIMB 41808)在极限盐培(minimal salt media)养基上生长，其中排除了氮源，并且其中磷酸根水平升高。该培养基的组成显示在下表中。

表1：用于生长罗旺醋杆菌FJ1的极限盐培养基的组成

成分	g/1000ml
		磷酸一氢钾	20.00
氯化镁	1.00
		氯化锰	0.05
三氯化铁	0.05
		硫酸铜	0.05
氯化钴	0.05
		钼酸钠	0.05
氯化锌	0.50

将该培养基溶解在水中并过滤。所用的水可以是蒸馏水或自来水。微生物可以在非无菌条件下生长，并且不需要通过高压灭菌或一些其他适当的方法对培养基和设备进一步灭菌。

将微生物接种在摇瓶或其他适当的容器中的两升量的培养基中，并且生长至A600为0.75至1.00之间。然后，将两升培养基在新鲜培养基中稀释至10升的体积，并且再培养至A600为0.75至1.0之间。通过培养物的反复分裂，将培养基的体积增加至需要的体积。

可以将用过的细菌培养基储存多至12个月的延长的时间段。

将用过的细菌培养基蒸馏，以利用图1所示的一般过程回收目标产物。

可以使用标准蒸馏设置，其使用烧瓶、加热器罩，用或不用分馏柱和具有冷凝器的蒸馏头。然而，其他蒸馏方法，如真空蒸馏、用夹带剂蒸馏、溶剂萃取然后用蒸馏回收，和连续蒸馏，也是适用的。也可以使用其他用于回收代谢物的方法，诸如膜灌注、电化学分离或利用临界二氧化碳回收。

3HP乙酯可以作为在98℃与水形成的共沸物收集。然后将汇集的产物水解成亲本酸(3HP)和乙醇。乙醇可以在约84℃馏出。然后，3HP再次与水形成共沸物，并且在98℃在该第一馏分之后在第二馏分中馏出。产物可以用试剂(诸如，但不限于，氯化物盐(钙或钠))或分子筛3A进一步干燥。

在多种预纯化方法(如薄层层析和管形式的固相吸附剂)后，对回收进行测量。固相吸附罐典型地是各种管尺寸的Cleanert C18吸附型的。物质吸附到C18上，并且洗涤去除污染物，然后用丙酮或包含0.1％HCl(v/v)的乙醇洗脱。

3HP酯和3HP的浓度可以通过高压液相色谱(HPLC)测量。典型地，使用25cm ODS-H，4.6mm柱，使用90％乙醇:10％水的移动相，专一性洗脱3HP。

可以使用质谱法，依据样品的来源和类型，在使用或不使用衍生作用的情况下鉴定个体产物。对于需要衍生的样品，将材料提取到适当的溶剂中，然后用BSTFA(N,O-二(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺)和TMS(三甲基甲硅烷基)处理。仪器典型地以80℃的注入温度然后每分钟升高7℃直到达到300℃的完全温度而运行。然后，将该柱在该温度保持5分钟。使用基本的库搜索(basic library search)来鉴定峰。在典型的运行中，20.8分钟的主峰证明是3HP。

实施例：

实施例1：在不存在外源添加的氮的条件下，生物体依赖二氧化碳作为唯一的碳源的生长

当在存在升高的磷酸根水平的条件下，生物体典型地具有72小时的生长周期，并且在20℃达到0.07g/l/h细胞干重。在这些条件下，生物体获得0.178g 3HP/l/h/g生物体细胞干重的产率。

实施例2：通过简单的两步蒸馏法产生3-羟基丙酸

3HP可以以简单的两步蒸馏法回收。

1.将用过的细菌培养基在简单的蒸馏罐中蒸馏，不使用分馏柱，但是使用侧臂冷凝器。在前10％馏出物中收集在98℃形成共沸物的3HP酯馏分。这为“蒸馏A”。

2.将汇集的来自蒸馏A的馏分在使用10升反应烧瓶和填装的分馏柱的蒸馏单元中再次蒸馏。在蒸馏之前，将汇集的来自蒸馏A的馏分用适当的无机酸酸化，水解酯内容物。在蒸馏B中，然后在75℃至85℃之间移除包含乙醇和其他挥发性馏分的前5％(馏分1)。然后，在98℃蒸馏20体积％的富含3HP的第二馏分(馏分2)。馏分2典型地包含30％的纯度不小于88％的3HP。该物质对应可商购的3HP的浓度。然后，可以如下述实施例所示进一步处理该产物。

实施例3：合成3HP的碱土盐

在实施例2中获得的3HP水溶液可以通过用氢氧化钠或氢氧化钙中和而进一步分别转化为钠盐或钙盐。可溶的钠盐可以通过蒸发或冻干回收。不溶性的钙盐可以通过简单的过滤回收。

实施例4：合成3HP的铵盐

可以通过如US20100099910所述的那些的盐分裂方法制备3HP的铵盐。

实施例5：3HP转化为丙烯酸

通过转化为铵盐，然后用固体氧化物脱水催化剂处理(例如，参见美国专利号8338145)或其他方法，如反应性蒸馏(例如，参见美国专利号8198481)，可以将3HP转化为丙烯酸。

实施例6：备选底物的利用，甘油转化为3-羟基丙酸乙酯

通过使用细菌培养物作为外源性催化剂，可以将甘油，包括来自生物柴油制备的甘油废料，转化为3-羟基丙酸或丙烯酸。将细菌生长至在A600测量为0.75的细胞密度，然后加入10％的甘油溶液，其可以是在水中的纯化的甘油或是在水中稀释的生物柴油废料，有效浓度为10％甘油。生物柴油废料不需要预处理。甘油向3HP的转化可以用UV可见光谱法、IR光谱法监测，并且用HPLC和GC质谱法分析终产物。

实施例7：3HP转化为Reuterin

Reuterin是一种抑制几种类型的细菌的抗微生物剂(3-羟基丙醛，其二聚体和水合物)。该化合物通常由依赖甘油生长的罗伊乳杆菌(L.reuteri)产生。由罗旺醋杆菌FJ1产生的3-羟基丙酸乙酯或3-羟基丙酸可以进一步通过用适当的催化剂处理或通过在适当的条件下使用的适当的酶作用(诸如醇脱氢酶)而转化成该化合物。

实施例8：3HP酶转化为丙烯酸和丙烯酸酯

利用脱氢酶，在本领域技术人员所用的适宜条件下，可以将在上述过程中产生的3-羟基丙酸转化为丙烯酸。通过加入摩尔比例的酸和略微过量的各种醇，然后在本领域技术人员所用的适宜条件下用脂肪酶处理，可以合成3-羟基丙酸的酯产物，如甲酯、丙酯和丁酯。可以通过任意适当的蒸馏方法从用过的细菌培养基中回收乙酯。

Claims

1.一种用于生产3-羟基丙酸的酯的方法，所述方法包括：

在含有大于1g/升的水平的磷酸根的生长培养基中培养罗旺醋杆菌(Acetobacterlovaniensis)细菌，

其中所述细菌的培养产生所述3-羟基丙酸的酯。

2.权利要求1的方法，其中所述3-羟基丙酸的酯是3-羟基丙酸乙酯。

3.权利要求1或2的方法，其中所述生长培养基含有大于10g/升的磷酸根。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生长培养基含有大于13g/升的磷酸根。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生长培养基含有10至30g/升之间的磷酸根。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生长培养基不包含外源性氮源。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生长培养基不包含外源性碳源。

8.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述生长培养基含有甘油。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生长培养基具有4至7之间的pH。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细菌在15℃至30℃之间的温度培养。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中培养所述细菌直到所述生长培养基达到0.75至1.00之间的OD₆₀₀。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细菌是保藏号为NCIMB41808的菌株FJ1。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法还包括从所述生长培养基中分离所述3-羟基丙酸的酯的步骤。

14.权利要求13的方法，其中所述方法还包括将3-羟基丙酸的酯转化为3-羟基丙酸的步骤。

15.权利要求14的方法，其中所述方法还包括分离所述3-羟基丙酸的步骤。

16.权利要求15的方法，其中所述方法还包括干燥所述3-羟基丙酸的步骤。

17.权利要求15或权利要求16的方法，其中所述方法还包括将3-羟基丙酸加工成其他的化学品，诸如3-羟基丙酸盐(包括3-羟基丙酸的铵盐、钠盐和钙盐)、3-羟基丙酸酯(包括甲酯、丙酯和丁酯)、丙烯酸、丙烯酸酯/盐、聚丙烯酸、丙烯酸酯聚合物、丙烯腈、丙烯酰胺、丙烯醛、1,3-丙二醇和Reuterin的步骤。

18.权利要求1的方法，其中所述方法用于生产3-羟基丙酸，所述方法包括：

在包含10至30g/升之间的水平的磷酸根的生长培养基中培养保藏号为NCIMB 41808的罗旺醋杆菌菌株FJ1，其中所述细菌的培养产生3-羟基丙酸乙酯；

从生长培养基中分离所述3-羟基丙酸乙酯；

将3-羟基丙酸乙酯转化为3-羟基丙酸；

分离所述3-羟基丙酸；和

任选地干燥所述3-羟基丙酸。

19.一种用于生产3-羟基丙酸的酯的方法，所述方法包括：

提供包含在含有大于1g/升的水平的磷酸根的生长培养基中培养的罗旺醋杆菌细菌的无细胞提取物的水性培养基，其中在所述水性培养基中产生所述3-羟基丙酸的酯；和

任选地，从所述水性培养基中分离所述3-羟基丙酸的酯。

20.一种水性培养基，其包含在含有大于1g/升的水平的磷酸根的生长培养基中培养的罗旺醋杆菌细菌的无细胞提取物。