CN101875907B - 一种可水解3-羟基丁腈的微生物菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的提供了一种微生物菌株Arthrobacter nitroguajacolicus及其斜面、发酵培养基及菌株的应用。本发明提供的菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的斜面培养基配方为：碳源：0.2～2.0wt％；氮源：0.2～2.0wt％；微量金属离子：以金属盐的量计为0.01～0.5wt％；琼脂粉：1.0～3.0wt％；pH：6.4～7.5。发酵培养基配方为(wt)：碳源0.5～3.0％；氮源0.2～3.0％；微量金属离子：以金属盐的量计为0.01～0.5％；半胱氨酸盐酸盐或半胱氨酸0.01～0.1％；有机腈0.01～0.1％；pH6.4～7.5。本发明提供的菌株可用于生产腈水解酶，利用该菌株生产的腈水解酶可催化3-羟基丁腈生产3-羟基丁酸。使用上述方法制备3-羟基丁酸，具有原料便宜易得，水解副产物少，反应条件温和等优点，因此，具有很高的工业化生产潜力。

Description

一种可水解3-羟基丁腈的微生物菌株
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地说，涉及一种可水解3-羟基丁腈的微生物菌株。
背景技术
3-羟基丁酸，俗称β-羟基丁酸，含有两种光学活性对映体，分别是(R)-3-羟基丁酸和(S)-3-羟基丁酸，是重要的制药原料及药理学试剂；其中，(S)-(+)-3-羟基丁酸是高血脂治疗药物(R)-4-羟基-3-羟基丁酸[(R)-GABOB]，脑新陈代谢的促进剂(S)-Oxiracetam(奥拉西坦)，艾滋病药物，安定剂以及最新一代抗菌药物的关键中间体；而(R)-3-羟基丁酸不仅具有营养功能，还能治疗如神经紊乱疾病，神经退化性疾病，供氧不足，心绞痛，心肌梗塞和糖代谢紊乱等疾病。
3-羟基丁酸可以通过分子间的酯化反应生成聚3-羟基丁酸酯(PHB)，由于PHB具有生物降解性、生物相容性、光学活性、压电性、抗紫外性等优良性质，故PHB不仅仅用来制备生物完全降解塑料，在电子、光学、生物医学等其它高科技领域也有很广的用途。
有关3-羟基丁酸的化学合成方法的报道很多，主要包括以下几种方法：(1)β-丁内酯的水解法；(2)利用Reformatsky反应法；(3)乙酰乙酸乙酯还原法；(4)由丁烯酸水合制备法；(5)以乙醛和乙酸为原料、萘锂为催化剂制备；(6)环氧丙烷水解法；(7)乙醛经羟醛缩和生成3-羟基丁醛氧化法(山东科学，2001，14(1)：43-49)。虽然有多种3-羟基丁酸的化学合成路线，但是化学合成工艺复杂，反应条件比较苛刻，对设备要求高，而且金属催化剂价格昂贵，易造成污染，对环保不利；而且得到的产物为外消旋体，很难获得具有光学活性的3-羟基丁酸单体。
而生物法由于方法简单、条件温和、反应较快，日益获得广泛的关注，现有使用的生产3-羟基丁酸的生物法主要包括：
Ottaway TH(Biochem J，1962，84：11～12)利用微生物合成聚D-(-)-3-羟基丁酸，然后降解该聚合物得到D-(-)-3-羟基丁酸单体，如利用芽苞杆菌属中的Bacillus megaterium和Bacillus cereu在含有适当能源的适宜介质中生长产生聚-3-羟基丁酸颗粒，将生成的聚3-羟基丁酸再通过酶催化或酸条件下水解生成自由酸。但是此方法工艺复杂，生产投入大，分离纯化困难，使D-(-)-3-羟基丁酸的成本较高。
陈国强等(CN1217001C，CN1357629C)利用基因工程手段将合成聚(R)-3-羟基丁酸(PHB)的前体基因phbA、phbB和ptb、buk克隆到质粒载体中构建出重组质粒，再将其转到大肠杆菌中构建DNA重组菌株，发酵培养含这四个基因片段的重组大肠杆菌获取(R)-3-羟基丁酸。但是重组的大肠杆菌在生产过程中质粒容易丢失，所以将基因工程菌用于大规模生产还处于进一步探索之中。
而利用细胞或酶催化乙酰乙酸乙酯不对称还原制备光学活性的3-羟基丁酸酯后，将其产物水解也是获得光学活性的3-羟基丁酸的一种方法(化学反应工程与工艺，2007，23(2)：173-177；J.Fennen.Bioeng.，1993，76：33-37；J.Biosci.Bioeng.，2001，91(4)：368-372)。但是该方法中的底物乙酰乙酸乙酯难溶于水，在有机相中反应细胞或酶容易失活，限制了产物的时空产率，而且在还原过程中需要等化学计量的辅酶。
现有的这些生产3-羟基丁酸的生物方法，普遍存在产量低、成本高、价格昂贵等缺点，影响了在工业上的研究，开发和应用推广。
发明内容
本发明的发明人发现了一种微生物菌株Arthrobacter nitroguajacolicus，该菌株经培养后，获得的反应液能用于生物催化生产3-羟基丁酸。
因此，本发明的目的在于，提供一种微生物菌株Arthrobacter nitroguajacolicus。
本发明还有一个目的在于，提供菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的一种斜面培养基。
本发明还有一个目的在于，提供一种用于Arthrobacter nitroguajacolicus发酵的培养基。
本发明还有一个目的在于，提供菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的应用。
本发明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
根据本发明，菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的保藏号为CGMCC No.2405
本发明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的斜面培养基的配方如下：碳源：0.2～2.0wt％；氮源：0.2～2.0wt％；微量金属离子：以金属盐的量计为0.01～0.5wt％；琼脂粉：1.0～3.0wt％；pH：6.4～7.5。
本发明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的发酵培养基的配方如下：碳源：0.5～3.0wt％；氮源：0.2～3.0wt％；微量金属离子：以金属盐的量计为0.01～0.5wt％；半胱氨酸盐酸盐或半胱氨酸：0.01～0.1wt％；有机腈：0.01～0.1v/v％；pH：6.4～7.5。
本发明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的应用为用于生产腈水解酶或用于生物催化生产3-羟基丁酸。
根据本发明，催化生产3-羟基丁酸包括以下步骤：
A、对菌株Arthrobacter nitroguajacolicus进行发酵；
B、对步骤A中获得的发酵液进行预处理，获得细胞浓缩液；
C、利用步骤B中获得的细胞浓缩液水解3-羟基丁腈，得到3-羟基丁酸。
根据本发明的一个优选实施例，对发酵液进行的预处理包括固液分离步骤，其中固液分离的方法为中空纤维微滤膜、中空纤维超滤膜、陶瓷膜、卷式微滤膜、卷式超滤膜、平板Utro-flo膜系统、碟片离心分离或管式离心分离。
本发明的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405的发酵产物能够水解3-羟基丁腈生成3-羟基丁酸，因而具有工业化生产3-羟基丁酸的潜力。使用上述方法制备3-羟基丁酸，具有原料便宜易得，水解副产物少，反应条件温和等优点，因此，具有很高的工业化生产潜力。
附图说明
图1为水解产物的红外光谱检测结果。
图2为水解产物的紫外可见(200-500nm)吸收光谱检测结果。
图3为水解产物的1HNMR检测结果。
图4A为水解产物的质谱分析图谱，图4B为质谱图的分析数据。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
以下实施例中，所使用的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus，已于2008年3月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCCNo.2405。
以下实施例中，采用高效液相色谱法测定水解产物3-羟基丁酸的含量，具体过程如下：
检测条件：色谱柱为150mm×4.6mm，不锈钢柱，内装Kromasil ODS C18、5u的填充物；流动相为磷酸二氢钠缓冲液∶乙腈＝95∶5(V/V)；流速为0.5ml/min；检测波长为210nm；柱温为30℃；进样量为20μL。
检测方法：称取3-羟基丁酸标准品0.1g，置于50mL容量瓶中，用流动相溶解，摇匀。称取约含3-羟基丁酸0.1g的样品，置于50mL容量瓶中，用流动相溶解，摇匀。
在上述色谱条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标准品溶液，待相邻两针标准品溶液峰面积的响应值变化小于1.0％时，按照标样、样品、样品、标样的顺序进行测定。将测得的两针样品以及前后两针标样的峰面积进行平均。试样的质量分数X％按以下公式计算：
X = m 1 × A 2 m 2 × A 1 × P
其中，
A1为标准品溶液中3-羟基丁酸峰面积的平均值；
A2为样品溶液中3-羟基丁酸峰面积的平均值；
m1为称取3-羟基丁酸标准品的质量，g；
m2为称取试样的质量，g；
P为标准品中3-羟基丁酸标准品的质量分数，％。
以下实施例中，采用使用HPLC(岛津公司，Shim-packVP-ODS)分析测定产物光学纯度，具体过程如下：
流动相为1mM CuSO4，流速为0.8mL/min，检测波长为254nm，柱温为20℃；S和R构型的3-羟基丁酸含量利用手性柱(Chiralcel OA，日本Sumichral公司)测定，以确定产物的对映体过量值((ee，％)＝(CS-CR)/(CS+CR)×100％，其中，CS和CR分别表示S和R构型对映体的浓度)。
实施例1、斜面培养基的配制
分别按照表1所示的配方配制斜面培养基，获得斜面培养基1-5。
表1、斜面培养基配方(wt％)
  1   2   3   4   5
  碳源   葡萄糖0.4％   葡萄糖1.0％   葡萄糖2.0％   葡萄糖1.8％   葡萄糖1.2％
  氮源   酵母膏0.2％   酵母膏0.3％   酵母膏0.7％   酵母膏1.2％   酵母膏1.8％
  微量金属离子(金属盐)   NaCl：0.05％K2HPO4·3H2O：0.05％MgSO4·7H2O：0.05％   NaCl：0.1％K2HPO4·3H2O：0.02％MgSO4·7H2O：0.02％   NaCl：0.1％K2HPO4·3H2O：0.05％MgSO4·7H2O：0.05％   NaCl：0.05％K2HPO4·3H2O：0.08％MgSO4·7H2O：0.08％   NaCl：0.15％K2HPO4·3H2O：0.1％MgSO4·7H2O：0.1％
  琼脂粉   1.8％   2.0％   2.0％   1.5％   2.5％
  pH   7.0   6.7   7.2   7.1   7.4
实施例2、发酵培养基的配制
分别按照表2所示的配方配制发酵培养基，获得发酵培养基1-5。
表2、发酵培养基配方(wt％)
  1   2   3   4   5
  碳源   葡萄糖0.7％   葡萄糖1.5％   葡萄糖2.0％   葡萄糖1.8％   葡萄糖2.5％
氮源 蛋白胨0.5％ 蛋白胨1.0％ 酵母膏1.5％ 酵母膏2.5％   酵母膏0.6％蛋白胨0.7％
微量金属离子(金属盐)   K2HPO4·3H2O：0.07％KH2PO4：0.07％MgSO4·7H2O：0.02％   K2HPO4·3H2O：0.05％KH2PO4：0.05％MgSO4·7H2O：0.05％   K2HPO4·3H2O：0.1％KH2PO4：0.1％MgSO4·7H2O：0.03％   K2HPO4·3H2O：0.08％KH2PO4：0.08％MgSO4·7H2O：0.05％   K2HPO4·3H2O：0.02％KH2PO4：0.02％MgSO4·7H2O：0.1％
  半胱氨酸或其盐酸盐   0.025％   0.015％   0.03％   0.05％   0.075％
有机腈(v/v)   苯甲腈0.015％   苯甲腈0.025％   苯甲腈0.075％   苯甲腈0.05％   苯甲腈0.045％
  pH   6.7   7.0   7.0   7.5   7.2
实施例3、Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405的发酵培养
将Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405分别接种至实施例1中配制的斜面培养基1-5上，于28℃培养3～4天，获得培养斜面1-5。
然后，从培养斜面1-5上挑取Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405相应接种到实施例2中配制的发酵培养基1-5中，于28℃，220rpm培养4天，获得发酵液1-5。
实施例4、使用Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405的细胞悬浮液水解3-羟基丁腈
将发酵液1-5分别进行固液分离(离心分离)，去离子水洗涤细胞。然后，用去离子水悬浮收集的细胞，获得细胞悬浮液1-5。
分别向细胞悬浮液1-5中加入3-羟基丁腈至终浓度为1％(W/V)，然后于28℃反应24h，获得反应液1-5。
反应结束后，分别将反应液1-5离心，收集离心上清。
然后，取部分离心上清，送华东理工大学分析中心进行以下检测：红外光谱检测、紫外可见(200-500nm)吸收光谱检测、1HNMR检测和低分辨率EI-MS测定，以确定水解产物。
检测获得的谱图分别如图1-4所示。上述谱图与标准的3-羟基丁酸的相应谱图相符，因此，可确定水解产物为3-羟基丁酸。
同时，取部分离心上清，进行液相色谱分析，以确定反应液1-5中3-羟基丁酸的含量，并计算其转化率，同时测定光学纯度，结果如表3所示。
表3、反应液检测结果
    反应编号     ee(％)   3-羟基丁酸含量(％)     转化率(％)
    1     90   1.0     85
    2     95   1.1     93.5
    3     85   0.9     76.5
    4     34   0.71     60.4
    5     28   0.69     58.6
表3的结果显示，Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405能用于水解3-羟基丁腈，获得3-羟基丁酸，且其转化率较高，可用于工业化生产。
同时，根据表3的数据，以斜面培养基2和发酵培养基2培养的细胞活性最高，其转化率和产物3-羟基丁酸的光学纯度都优于其他几组培养基培养的细胞。斜面培养基2和发酵培养基2为最优培养基。
实施例5、Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405的16S rDNA序列测定测序
取Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405细胞送中科院北京微生物研究所检测，并测定其16s rDNA，其16s rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例6、Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405的发酵产物的预处理方法
以实施例3的培养条件以及实施例4确定的最优培养基培养获得Arthrobacternitroguajacolicus CGMCC No.2405的发酵液，然后取相同量的发酵液分别以中空纤维微滤膜、中空纤维超滤膜、陶瓷膜、卷式微滤膜、卷式超滤膜、平板Utro-flo膜系统、碟片离心分离以及管式离心分离的处理方法进行固液分离，得到相应的细胞悬浮液6-13。
细胞悬浮液6-13以实施例5所述方法进行3-羟基丁腈的水解反应和数据测定，结果如表4所示。
表4、反应液检测结果
    反应编号     ee(％)   3-羟基丁酸含量(％)     转化率(％)
    6     95   1.1     93.5
    7     95   1.1     93.5
    8     90   1.08     91.8
    9     95   1.1     93.5
    10     95   1.1     93.5
    11     95   1.2     100
    12     90   1.08     91.8
    13     90   1.08     91.8
表4的数据显示，发酵液经上述固液分离的方法处理后，细胞的活性破坏较少，能达到良好的分离效果。
综上所述，本发明的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405的发酵产物能够水解3-羟基丁腈生成3-羟基丁酸，因而具有工业化生产3-羟基丁酸的潜力。使用上述方法制备3-羟基丁酸，具有原料便宜易得，水解副产物少，反应条件温和等优点，因此，具有很高的工业化生产潜力。
序列表
<110>上海市农药研究所
<120>一种可水解3-羟基丁腈的微生物菌株
<130>P5091016
<160>1
<170>PatentIn version                                                3.1
<210>1
<211>1395
<212>DNA
<213>Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No.2405
<400>1
ccttcgacgg ctccccccac aagggttagg ccaccggctt cgggtgttac caactttcgt    60
gacttgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcagcgt tgctgatctg    120
cgattactag cgactccgac ttcatggggt cgagttgcag accccaatcc gaactgagac    180
cggctttttg ggattagctc cacctcacag tatcgcaacc ctttgtaccg gccattgtag    240
catgcgtgaa gcccaagaca taaggggcat gatgatttga cgtcgtcccc accttcctcc    300
gagttgaccc cggcagtctc ctatgagtcc ccgccataac gcgctggcaa catagaacga    360
gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat    420
gcaccacctg taaaccgacc gcaagcgggg cacctgtttc caggtctttc cggttcatgt    480
caagccttgg taaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg    540
cgggcccccg tcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcggggcac    600
ttaatgcgtt agctacggcg cggaaaacgt ggaatgtccc ccacacctag tgcccaacgt    660
ttacggcatg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccatgcttt cgctcctcag    720
cgtcagttac agcccagaga cctgccttcg ccatcggtgt tcctcctgat atctgcgcat    780
ttcaccgcta caccaggaat tccagtctcc cctactgcac tctagtctgc ccgtacccac    840
tgcagaaccg gagttgagcc ccggtctttc acagcagacg cgacaaaccg cctacgagct    900
ctttacgccc aataattccg gataacgctt gcgccctacg tattaccgcg gctgctggca    960
cgtagttagc cggcgcttct tctgcaggta ccgtcacttt cgcttcttcc ctactgaaag    1020
aggtttacaa cccgaaggcc gtcatccctc acgcggcgtc gctgcatcag gcttgcgccc    1080
attgtgcaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag    1140
tgtggccggt caccctctca ggccggctac ccgtcgtcgc cttggtaggc cattacccca    1200
ccaacaagct gataggccgc gagtccattc aaaaccacaa aagctttcca ccaccatgac    1260
atgcgccaga tggtcgtatc cggtattaga cccagtttcc caggcttatc ccagagtcaa    1320
gggcaggtta ctcacgtgtt actcacccgt tcgccactaa tcccccagca agctgggatc    1380
atcgttcgac ttgca                                                     1395

Claims (4)

1.一种微生物菌株Arthrobacter nitroguajacolicus，其特征在于：该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示，该菌株的保藏号为CGMCC No.2405。
2.如权利要求1所述的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的应用，其特征在于：用于生物催化生产3-羟基丁酸。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生物催化生产3-羟基丁酸包括以下步骤：
A、对菌株Arthrobacter nitroguajacolicus进行发酵；
B、对步骤A中获得的发酵液经固液分离，去离子水洗涤细胞后，用去离子水悬浮收集的细胞，获得细胞悬浮液；
C、利用步骤B中获得的细胞悬浮液水解3-羟基丁腈，得到3-羟基丁酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述固液分离的方法为中空纤维微滤膜、中空纤维超滤膜、陶瓷膜、卷式微滤膜、卷式超滤膜、平板Utro-flo膜系统、碟片离心分离或管式离心分离。
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Non-Patent Citations (2)

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Title
腈水合酶产生菌发酵条件的优化及其酶学性质研究;赵霞等;《新疆农业大学学报》;20061231;第29卷(第1期);40-43 *
赵霞等.腈水合酶产生菌发酵条件的优化及其酶学性质研究.《新疆农业大学学报》.2006,第29卷(第1期),40-43.

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