BR112016018102B1 - Método para produzir ésteres do ácido 3-hidroxipropiônico - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR ÉSTERES DO ÁCIDO 3-HIDROXIPROPIÔNICO. A presente invenção descreve um método para produzir um éster do ácido 3-hidroxipropiônico, o método compreendendo: cultivar uma bactéria Acetobacter lovaniensis em um meio de crescimento contendo fosfato a um nível superior a 1 g/L, em que o cultivo da bactéria produz o éster do ácido 3- hidroxipropiônico.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um método para produzir ésteres do ácido 3-hidroxiypropiônico pelo cultivo de um microrganismo Acetobacter sob condições de crescimento particulares. Esses ésteres podem ser hidrolisados para formar o ácido 3-hidroxiypropiônico (3HP).

Antecedentes da Invenção

[002] Foi demonstrado que muitos microrganismos produzem ácidos hidroxicarboxílicos, como o ácido 3- hidroxipropiônico (Andreeken, B., e Steinbuchel, A., Applied and Environmental Microbiology (2010), 76, 4919 4925), o ácido 3-hidroxibutírico (Aslim, B., Caliskan, F., Beyatli, Y. e Gunduz, U., FEMS Microbiol. Lett (1998), 159, 293-297), o ácido 3-hidroxivalérico (Steinbuchel, A., Debzi, E-M., Marchessault, R.H e Timm, A., Applied Microbiology and Biotechnology (1993), 39, 443-449) e os seus polímeros na forma de polialcanoatos (US20120129232). Geralmente, os ácidos hidroxicarboxílicos e seus polialcanoatos correspondentes são produzidos em resposta às condições de crescimento limitadas em termos de nutrientes (Brigham, C.J., Kurosawa, K., Rha, C., e Sinskey, A.J., S3 Microbial and Biochemical Technology (2011)). A produção dos ácidos hidroxicarboxílicos, em particular, do ácido 3-hidroxipropiônico, é de importância comercial, uma vez que ele é facilmente convertido em ácido acrílico e em outros produtos químicos. Como resultado, o ácido 3-hidroxipropiônico (número CAS 503-66-2) é uma plataforma química valiosa.

[003] A produção do ácido 3-hidroxipropiônico por microrganismos geneticamente modificados tem sido o foco de várias patentes (US20090325248, US20100021978, WO2012/0301935, US2012244588 e US20110125118). Essas patentes descrevem processos de fermentação, pelos quais as fontes de carboidrato, como açúcares ou glicerol, são convertidas em 3HP através de vias modificadas conhecidas. Os rendimentos são descritos em vários formatos, o documento WO2012/0301935 fornece resultados de 0,97 g de 3HP por grama de glicerol adicionado e o documento US20110125118 descreve rendimentos em termos de 0,05 g/g de peso de célula seca/hora ou 0,05 g/litro/hora.

[004] Mais recentemente, a conversão de dióxido de carbono em ácido 3-hidroxipropiônico foi descrita em Pyrococcus furiosus (WO2013/067326). Esse organismo foi manipulado para usar gás hidrogênio e dióxido de carbono para produzir 3HP por extratos isentos de células ou células inteiras da cepa recombinante. No entanto, esse organismo é geneticamente modificado e requer uma temperatura de crescimento de 70 a 73 °C.

[005] O 3HP coletado é convertido em ácido acrílico através de procedimentos químicos bem estabelecidos. No entanto, o principal problema com todos os processos biológicos é que, enquanto os rendimentos de 3HP estão em níveis comercialmente úteis, a molécula é cara e difícil de extrair para extrair da base ou de outro material presente no meio bacteriano utilizado. Além disso, o custo de estoques iniciais de alimentação também proíbe a comercialização da produção de 3HP de origem biológica.

[006] O documento WO2013/011292 descreve um microrganismo que é capaz de produzir ácidos carboxílicos alifáticos de cadeia longa. Esse documento descreve uma cepa particular, referida como FJ1 de Acetobacter lovaniensis, com o número de registro NCIMB 41808 (depositada em NCIMB Ltd. (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA) em 12 de janeiro de 2011, ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste).

Sumário da Invenção

[007] Foi surpreendentemente verificado que a cepa de Acetobacter lovaniensis descrita no documento WO2013/011292 pode produzir ésteres do ácido 3- hidroxipropiônico. Não se sabia antes que este microrganismo poderia produzir tais produtos.

[008] A presente invenção refere-se a um método para produzir ésteres do ácido 3-hidroxipropiônico usando o microrganismo descrito no documento WO2013/011292. A divulgação do documento WO2013/011292 é incorporada nesse documento em sua totalidade. Foi demonstrado que esse microrganismo tem a capacidade de produzir ésteres e ácidos hidroxicarboxílicos em um regime de crescimento enriquecido com fosfato.

[009] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir um éster do ácido 3- hidroxipropiônico, o qual compreende: cultivar uma bactéria Acetobacter lovaniensis em um meio de crescimento contendo fosfato a um nível superior a 1 g/L, em que o cultivo da bactéria produz o éster do ácido 3-hidroxipropiônico.

[0010] Preferencialmente, o éster do ácido 3- hidroxipropiônico é 3-hidroxipropionato de etila. Como resultado, o método é para a produção de 3- hidroxipropionato de etila, o qual compreendendo: cultivar uma bactéria Acetobacter lovaniensis em um meio de crescimento contendo mais de 1 g/L de fosfato, em que o cultivo da bactéria produz 3-hidroxipropionato de etila.

[0011] A bactéria Acetobacter lovaniensis é cultivada em um meio de crescimento contendo mais de 1 g/L de fosfato. 1 g/litro é a quantidade de íon fosfato (PO43-) no meio de crescimento, em vez da quantidade do composto contendo fosfato no meio de crescimento. Por exemplo, o di- hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) tem massa molecular relativa igual a 136. A sua parte fosfato tem massa molecular relativa igual a 95. Portanto, se 136 gramas de KH2PO4 fossem adicionados a 100 litros de água, haveria 1,36 g/litro de KH2PO4 na água, no entanto, haveria 0,95 g/L de fosfato na água.

[0012] Em algumas modalidades, o meio de crescimento contém, de preferência, fosfato a um nível que é maior que 2 g/litro. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém mais de 3 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém mais de 4 g/L de fosfato. Em modalidades particulares, o meio de crescimento contém mais de 5 g/L de fosfato. Em algumas modalidades, o meio de crescimento contém mais de 6 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém mais de 7 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém mais de 8 g/L de fosfato. Em modalidades particulares, o meio de crescimento contém mais de 9 g/L de fosfato. Em algumas modalidades, o meio de crescimento contém mais de 10 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém mais de 11 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém mais de 12 g/L de fosfato. Em uma modalidade preferencial, o meio de crescimento mais de 13 g/L de fosfato. Em outra modalidade preferencial, o meio de crescimento contém mais de 14 g/L de fosfato.

[0013] Em algumas modalidades, o meio de crescimento contém fosfato a um nível que é menor que 150 g/litro. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém menos de 100 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém menos de 80 g/L de fosfato. Em várias modalidades, o meio de crescimento contém menos de 70 g/L de fosfato. Em modalidades particulares, o meio de crescimento contém menos de 60 g/L de fosfato. Em algumas modalidades, o meio de crescimento contém menos de 50 g/litro de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém menos de 45 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém menos de 40 g/L de fosfato. Em modalidades particulares, o meio de crescimento contém menos de 35 g/L de fosfato. Em algumas modalidades, o meio de crescimento contém menos de 30 g/litro de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém menos de 25 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém menos de 20 g/L de fosfato. Em modalidades particulares, o meio de crescimento contém menos de 15 g/L de fosfato.

[0014] Em algumas modalidades, o meio de crescimento contém fosfato a um nível entre 1 e 150 g/litro. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém entre 2 e 100 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém entre 3 e 80 g/L de fosfato. Em várias modalidades, o meio de crescimento contém entre 4 e 70 g/L de fosfato. Em modalidades particulares, o meio de crescimento contém entre 5 e 60 g/L de fosfato. Em algumas modalidades, o meio de crescimento contém entre 6 e 50 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém entre 7 e 45 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém entre 8 e 40 g/L de fosfato. Em modalidades particulares, o meio de crescimento contém entre 9 e 35 g/L de fosfato. Em algumas modalidades, o meio de crescimento contém entre 10 e 30 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém entre 11 e 25 g/L de fosfato. Em outras modalidades, o meio de crescimento contém entre 12 e 20 g/L de fosfato. Em modalidades particulares, o meio de crescimento contém entre 13 e 15 g/L de fosfato.

[0015] O meio de crescimento pode ser qualquer meio de crescimento adequado que permita que a bactéria Acetobacter lovaniensis cresça e se reproduza, e que produza o éster do ácido 3-hidroxipropiônico. O meio de crescimento pode conter vários ingredientes/nutrientes para permitir que a bactéria cresça e se reproduza. O meio de crescimento pode conter um ou mais dos seguintes aditivos: um sal de potássio, um sal de magnésio, um sal de manganês, um sal de ferro, um sal de cobre, um sal de cobalto, um sal de sódio, um sal de zinco, um sal de cálcio, um sal de molibdênio, um cloreto, um sulfato, um molibdato e um carbonato. Estes aditivos estão geralmente presentes no meio de crescimento entre 0,01 e 2 g/litro.

[0016] Em algumas modalidades, o meio de crescimento pode conter um ou mais dos aditivos a seguir, nas quantidades especificadas:

[0017] Em uma modalidade particular, o meio de crescimento tem a seguinte composição:

[0018] Preferencialmente, o meio de crescimento não contém uma fonte de nitrogênio exógena. Isto não é necessário, uma vez que a bactéria pode fixar nitrogênio, que é dissolvido no meio de crescimento a partir da atmosfera.

[0019] A bactéria pode fixar dióxido de carbono. Portanto, o meio de crescimento não requer uma fonte de carbono exógena além do dióxido de carbono dissolvido no meio de crescimento a partir da atmosfera. No entanto, em algumas modalidades, antes que a bactéria seja cultivada ou durante o cultivo, dióxido de carbono pode ser borbulhado através do meio de crescimento para aumentar a quantidade de dióxido de carbono dissolvido no meio de crescimento. A bactéria pode usar dióxido de carbono como a única fonte de carbono.

[0020] Em algumas modalidades, glicerol é adicionado ao meio de crescimento como uma fonte adicional de carbono. Preferencialmente, isso é feito após a bactéria começar a crescer e a se reproduzir.

[0021] O meio de crescimento pode ter um pH entre 3,5 e 9. Preferencialmente, o meio de crescimento tem um pH entre 4 e 7. O pH do meio de crescimento não é, preferencialmente, muito baixo, pois as condições ácidas podem fazer com que o éster de 3HP hidrolise em 3HP, que pode reduzir o rendimento da recuperação. Em uma modalidade particular, o pH do meio de crescimento é igual a cerca de 4,5.

[0022] O meio de crescimento é, preferencialmente, aquoso, de modo que os nutrientes/aditivos são dissolvidos na água.

[0023] A bactéria geralmente é cultivada a uma temperatura compreendida entre 0 °C e 60 °C. Preferencialmente, a bactéria é cultivada a uma temperatura entre 10 °C e 40 °C. Em algumas modalidades, a bactéria é cultivada a uma temperatura entre 15 °C e 30 °C.

[0024] A bactéria é geralmente cultivada até a cultura de crescimento atingir uma densidade óptica, quando medida a 600 nm (OD600), de entre 0,75 e 1,00.

[0025] Durante o cultivo, a cultura pode ser diluída com meio de crescimento adicional para aumentar o volume da cultura. Portanto, quando se deseja extrair o éster do 3HP, a cultura deve ter uma densidade óptica final entre 0,75 e 1,00.

[0026] A bactéria pode ser cultivada entre 12 e 36 horas. Em algumas modalidades, a bactéria pode ser cultivada entre 18 horas e 30 horas.

[0027] O éster do ácido 3-hidroxipropiônico é produzido por uma bactéria Acetobacter lovaniensis. A bactéria pode ser qualquer bactéria Acetobacter lovaniensis adequada, que pode produzir um éster do ácido 3- hidroxipropiônico. Isso inclui a cepa FJ1 (com número de registro NCIMB 41808) e cepas semelhantes, que são relacionados com ou derivadas de FJ1. O termo "forma derivada" significa que FJ1 pode ser modificada ou sofrer uma mutação para produzir outras bactérias. Por exemplo, genes podem ser inseridos ou removidos da FJ1. As bactérias que são derivadas da FJ1 devem ser funcionalmente equivalentes à FJ1 e devem ser capazes de produzir um éster do ácido 3-hidroxipropiônico. Além disso, as bactérias derivadas devem ser capazes de crescer nas mesmas condições que a FJ1. Preferencialmente, a bactéria é a cepa FJ1 com o número de registro NCIMB 41808. Uma bactéria pode ser identificada como uma bactéria Acetobacter lovaniensis por métodos que são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, por exemplo, usando análise de rDNA 16S.

[0028] A bactéria produz o éster do ácido 3- hidroxipropiônico à medida que cresce, então, uma vez que o cultivo da bactéria foi concluído, o éster do ácido 3- hidroxipropiônico estará presente no meio de crescimento. O éster do ácido 3-hidroxipropiônico pode, em seguida, ser extraído, se desejado.

[0029] O método pode compreender ainda a etapa de separar o éster do ácido 3-hidroxipropiônico do meio de crescimento. Isso pode ocorrer em uma primeira etapa de separação. Isso pode ser feito de qualquer forma adequada, e vários métodos serão evidentes para uma pessoa versada na técnica.

[0030] Por exemplo, o éster do ácido 3- hidroxipropiônico pode ser separado usando destilação, incluindo destilação padrão, destilação fracionada, destilação a vácuo, destilação por arraste, extração com solvente seguido por recuperação com destilação, e destilação contínua. Outros métodos de separação incluem perfusão de membrana, separação eletroquímica ou o uso de dióxido de carbono crítico.

[0031] Se a destilação for realizada a 1 atmosfera (ao invés de sob pressão reduzida, como na destilação a vácuo) usando, por exemplo, um condensador com saída lateral, o éster de 3HP estará contido nos primeiros 10 a 15% do destilado e será coletado a uma temperatura entre 95 °C e 100 °C, em particular, a cerca de 98 °C. Geralmente, o éster de 3HP é coletado como um azeótropo.

[0032] Uma vez que o éster do ácido 3- hidroxipropiônico tenha sido separado, ele pode ser convertido em 3HP. Isso envolve a quebra da ligação éster para produzir 3HP. Métodos adequados para isso são bem conhecidos para uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, a conversão em 3HP pode ser feita por acidificação da amostra contendo o éster do ácido 3-hidroxipropiônico, para causar a hidrólise ácida do éster. Isso pode ser feito adicionando um ácido ao éster de 3HP. Ácidos adequados incluem ácido clorídrico e ácido sulfúrico. Alternativamente, o éster de 3HP pode ser hidrolisado usando uma base alcalina. Isso irá produzir um sal de 3- hidroxipropionato, que pode ser convertido para a forma de ácido, por exemplo, usando um ácido concentrado.

[0033] Uma vez convertido para 3HP, uma segunda etapa de separação pode, então, ocorrer para separar o 3HP de quaisquer outros produtos que estejam presentes após o processo de conversão, por exemplo, álcool. Esta segunda separação pode ser realizada usando qualquer método adequado. Por exemplo, o 3HP pode ser separado usando destilação, incluindo destilação padrão, destilação fracionada, destilação a vácuo, destilação por arraste, extração com solvente seguido por recuperação com destilação e destilação contínua. Outros métodos de separação incluem perfusão de membrana, separação eletroquímica ou o uso de dióxido de carbono crítico.

[0034] Se a destilação for realizada a 1 atmosfera (ao invés de sob pressão reduzida, como na destilação a vácuo) usando, por exemplo, uma coluna de fraccionamento, o 3HP vai destilar a uma temperatura entre 95 °C e 100 °C, em particular, a cerca de 98 °C. Geralmente, o 3HP é coletado como um azeótropo.

[0035] Após a segunda etapa de separação, uma amostra relativamente pura de 3HP é produzida, geralmente como uma solução aquosa.

[0036] Uma vez separada, o 3HP pode ser seca para remover parte da água. Isso pode ser feito com os agentes tais como, mas sem se limitar, aos sais de cloreto (cálcio ou sódio) ou com peneira molecular 3A.

[0037] Como indicado acima, 3HP é uma plataforma química, de modo que ele pode ser adicionalmente transformado em outros produtos químicos, como sais de 3- hidroxipropionato (incluindo 3-hidroxipropionato de amônio, sódio e cálcio), ésteres de 3-hidroxipropionato (por exemplo, ésteres de metila, propila e butila), ácido acrílico, acrilatos (sais, ésteres e bases conjugadas do ácido acrílico e seus derivados), ácido poliacrílico, polímeros de acrilato, acrilonitrila, acrilamida, acroleína, 1,3-propanodiol e reuterina.

[0038] Em uma modalidade particular, é fornecido um método para produzir o ácido 3-hidroxipropiônico, o qual compreende: cultivar a cepa FJ1 de Acetobacter lovaniensis com o número de registro NCIMB 41808 em um meio de crescimento contendo fosfato a um nível entre 10 e 30 g/L, em que o cultivo da bactéria produz 3-hidroxipropionato de etila; separar o 3-hidroxipropionato de etila do meio de crescimento; converter o 3-hidroxipropionato de etila em ácido 3-hidroxipropiônico; e separar o ácido 3-hidroxipropiônico.

[0039] Nessa modalidade, o nível de fosfato é descrito como sendo entre 10 e 30 g/litro. No entanto, qualquer um dos níveis descritos acima pode ser usado nessa modalidade particular. Por exemplo, o nível de fosfato pode ser maior que 1 g/litro, ou o nível de fosfato pode ser entre 13 e 15 g/L, ou qualquer um das modalidades entre eles.

[0040] Acredita-se que as enzimas responsáveis pela produção do éster de 3HP sejam extracelulares da bactéria. Essas enzimas funcionam independentemente se as células da bactéria estão presentes. Portanto, em outro aspecto da invenção, é fornecido um método para produzir um éster de 3HP, o qual compreende: fornecer um meio aquoso contendo um extrato isento de células de uma bactéria Acetobacter lovaniensis cultivada em um meio de crescimento contendo fosfato a um nível maior que 1 g/L, em que o éster do ácido 3-hidroxipropiônico é produzido no meio aquoso.

[0041] As etapas descritas acima para o método do primeiro aspecto da invenção, por exemplo, relativas à separação do éster de 3HP, etc. são igualmente aplicáveis a este aspecto da invenção.

[0042] O meio pode ser produzido pelo cultivo da bactéria por um período de tempo para permitir que os sistemas de enzima sejam produzidos no meio. O extrato isento de células pode ser preparado removendo as células da bactéria do meio após o cultivo, por exemplo, por ultrafiltração repetida.

[0043] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um meio aquoso contendo um extrato isento de células de uma bactéria Acetobacter lovaniensis cultivada em meio de crescimento contendo fosfato a um nível superior a 1 g/litro.

Descrição Detalhada da Invenção

[0044] A invenção agora será descrita em detalhes apenas a título de exemplo, como referência às figuras, em que:

[0045] A figura 1 é um fluxograma, mostrando a síntese dos ésteres de 3HP por Acetobacter lovaniensis FJ1 (cultivado em dióxido de carbono na presença de níveis elevados de fosfato) e sua posterior recuperação.

Visão geral

[0046] Na presença de níveis enriquecidos de fosfato e, opcionalmente, na ausência de uma fonte de nitrogênio e carbono exógena, o Acetobacter lovaniensis FJ1 produz um diferente conjunto de metabolitos incluindo, mas sem se limitar, aos ácidos hidroxicarboxílicos. O ácido 3- hidroxipropiônico é produzido em um nível comercialmente útil (sem a necessidade de limitação de nitrogênio), e ele é convertido em éster etílico in vivo.

[0047] Sem desejar se ater a uma teoria particular, acredita-se que há um deslocamento metabólico para a fixação de dióxido de carbono através do ciclo do hidoxilpropionato (Tavares, FJ, PNAS (2009), 106, 2101521016; Strauss, G. e Fuchs. G., Eur. J. Biochem (1993), 215, 633-643) na presença de níveis elevados de fosfato. Além disso, a fixação de nitrogênio através de um complexo tipo enzima nitrogenase resulta na geração de hidrogênio (Tamagnini P., Axelssen R., Lindberg P., Oxelfelt F., Wenschiers R. e Lindblad P., Microbiology and Molecular Biology Reviews (2002), 66, 11-20), que é utilizado pelas enzimas hidrogenase e equilibra o sistema redox do organismo. Embora a assimilação de carbono e nitrogênio tenha sido observada em outros organismos (Levican G., Ugalde J.A., Ehrenfeld M., Maass A., e Parada P., BMC Genomics (2008), 581, 1186; Dubbs J.M. e Tabita F.R., Fems Microbiol Rev. (2004), 28, 353-356; McKinlay J.B. e (Levican G., Ugalde J.A., Ehrenfeld M., Maass A., and Parada P., BMC Genomics (2008), 581, 1186; Dubbs J.M.), o uso da fixação de dióxido de carbono como um mecanismo de reciclagem através de um sistema nitrogenase só foi observado anteriormente em bactérias fototróficas anoxigênicas, como em bactérias púrpuras não sulfurosas, onde o dióxido de carbono é reduzido através do ciclo de Calvin Benson Basham. Espécies de Acetobacter podem ser capazes de aproveitar este efeito. Apesar de não terem um ciclo de Calvin Benson Basham funcional, elas retêm elementos genéticos do mesmo, ou o ciclo do 3HP é usado para o mesmo efeito. Além disso, um sistema de efluxo dependente da força próton motriz para o 3HP pode operar como observado em Acetobacter aceti (Matsushita K., Inoue T., Adachi O., e Toyama H.J., Bacteriol. (2005), 187, 43464352).

[0048] A síntese de ésteres é observada em Acetobacter lovaniensis FJ1. Além disso, acredita-se que a esterificação do 3HP decorra da conversão do ácido acético em etanol pela Acetobacter lovaniensis FJ1, seguido por esterificação com 3HP. Esta é uma nova via de esterificação, resultando no éster etílico do 3HP. Este produto é mais econômico para recuperar do meio bacteriano usado do que o 3HP em si. Por exemplo, a recuperação pode ser realizada por destilação simples, aproveitando o azeótropo formado entre o éster e água a cerca de 98 °C. Esta facilidade de recuperação torna a extração do éster de 3HP relativamente barata. O éster de 3HP pode, então, ser adicionalmente convertido em vários produtos comercialmente úteis, como 3HP e sais de sódio, cálcio e amônio do 3HP, ácido acrílico, acrilatos, acrilamida, acroleína e 1,3- propanodiol.

Processo para a produção de 3-hidroxipropionato de etila - número CAS 623-72-3

[0049] A Acetobacter lovaniensis FJ1 (número de registro: NCIMB 41808) é cultivada em um meio de sal mínimo, no qual as fontes de nitrogênio são excluídas e em que o nível de fosfato é elevado. A composição desse meio é mostrada na tabela abaixo. Tabela 1: Composição do meio de sal mínimo usado para o cultivo de Acetobacter Lovaniensis FJ1

[0050] O meio é dissolvido em água e filtrado. A água usada pode ser água destilada ou água da torneira. O microrganismo pode ser cultivado em condições não estéreis e, além disso, a esterilização dos meios e equipamentos por autoclavagem ou qualquer outro método adequado não é necessária.

[0051] O microrganismo é inoculado em quantidades de dois litros de meio em frascos de agitação ou outros recipientes adequados, e cultivado a uma A600 entre 0,75 e 1,00. Dois litros de meio de cultura são, em seguida, diluídos em meio fresco até um volume de 10 litros e, novamente, cultivados até uma A600 entre 0,75 e 1,0. O volume do meio de cultura aumenta até o volume desejado pela repetida divisão da cultura.

[0052] O meio bacteriano utilizado pode ser armazenado por longos períodos de tempo, até doze meses.

[0053] O meio bacteriano usado é destilado para recuperar os produtos de interesse, usando o processo geral mostrado na figura 1.

[0054] Uma configuração de destilação padrão pode ser usada utilizando um balão, uma manta de aquecimento, com ou sem coluna de fracionamento e cabeça de destilação com condensador. No entanto, outros métodos de destilação, como destilação a vácuo, destilação por arraste, extração com solvente seguido por recuperação com destilação e destilação contínua também são aplicáveis. Outros procedimentos para a recuperação dos metabolitos, perfusão de membrana, separação eletroquímica ou recuperação por meio do uso de dióxido de carbono crítico também podem ser utlizados.

[0055] O 3HP de etila pode ser coletado como um azeótropo que se forma com a água a 98 °C. O produto agrupado é, em seguida, hidrolisado até o ácido original (3HP) e etanol. O etanol pode ser removido por destilação a cerca de 84 °C. O 3HP, então, novamente forma um azeótropo com água e destila depois dessa primeira fração, em uma segunda fração a 98 °C. Os produtos podem ser adicionalmente secos com agentes tais como, mas sem se limitar, aos sais de cloreto (de cálcio ou de sódio) ou com peneira molecular 3A.

[0056] As recuperações são medidas após vários métodos de pré-purificação, como por cromatografia de camada fina e adsorventes de fase sólida em formatos de tubo. Os tubos adsorventes de fase sólida são tipicamente o adsorvente Cleanert C18, em vários tamanhos de tubo. O material é adsorvido no C18 e lavado de modo a ficar isento de contaminantes e, em seguida, ele é eluído com acetona ou etanol contendo HCl 0,1% (v/v).

[0057] A concentração do éster de 3HP e 3HP pode ser medida por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Normalmente, o 3HP é isocraticamente eluído usando uma coluna de 25 cm ODS-H, de 4,6 mm, com fase móvel de etanol:água 90%:10.

[0058] Os produtos individuais podem ser identificados usando espectroscopia de massa, com e sem derivatização, dependendo da fonte e do tipo de amostra. Para amostras onde a derivatização é necessária, o material é extraído em um solvente adequado e, em seguida, tratado com BSTFA (N,O-bis(trimetilsilil)trifluoracetamida) e TMS (trimetilsilila). O instrumento é normalmente operado com temperatura de injeção de 80 °C, seguido por um aumento de temperatura de 7 °C por minuto até atingir a temperatura máxima de 300 °C. A coluna é, em seguida, mantida durante 5 minutos nesta temperatura. Uma pesquisa de biblioteca básica foi utilizada para identificar os picos. Em uma análise típica, foi demonstrado que um pico principal em 20,8 minutos era 3HP.

EXEMPLOS: Exemplo 1: O crescimento do organismo na ausência de nitrogênio exogenamente adicionado e em dióxido de carbono como a única fonte de carbono

[0059] O organismo normalmente tem um ciclo de crescimento de 72 horas quando é cultivado na presença de níveis elevados de fosfato, e alcança 0,07 g/L/h de peso de célula seca a 20 °C. Nestas condições, o organismo alcança a produção de 0,178 g de 3HP/L/h/g de peso de célula seca do organismo.

Exemplo 2: Produção do ácido 3-hidroxipropiônico por um simples processos de destilação de duas etapas

[0060] O 3HP pode ser recuperado em um processo de destilação simples de duas etapas. 1. O meio bacteriano usado é destilado em um recipiente de destilação simples sem uma coluna de fracionamento, porém utilizando um condensador com saída lateral. As frações do éster de 3HP que formam um azeótropo a 98 °C são coletadas nos primeiros 10% do destilado. Esta é a "destilação A". 2. As frações agrupadas da destilação A são redestiladas em uma unidade de destilação que utiliza um frasco reacional de 10 litros e uma coluna de fracionamento empacotada. Antes da destilação, a fração agrupada da destilação A é acidificada com um ácido mineral adequado, para hidrolisar o conteúdo de éster. Na destilação B, o 5% inicial contendo etanol e outras fracções voláteis é, em seguida, removido entre 75 °C e 80 °C (fração 1). Uma segunda fração (fração 2) de 20% em volume, enriquecida de 3HP, é em seguida destilada a 98 °C. A fração 2 normalmente contém 30% de 3HP, com pureza não inferior a 88%. Este material corresponde à concentração de 3HP comercialmente disponível. Este produto pode, em seguida, ser adicionalmente processado, conforme mostrado nos exemplos a seguir.

Exemplo 3: Síntese dos sais alcalino-terrosos de 3HP

[0061] A solução aquosa de 3HP, obtida no exemplo 2, pode ser ainda convertida no sal de sódio ou cálcio por meio da neutralização com hidróxido de sódio ou hidróxido de cálcio, respectivamente. O sal de sódio solúvel pode ser recuperado por evaporação ou liofilização. O sal de cálcio insolúvel pode ser recuperado por filtração simples.

Exemplo 4: Síntese do sal de amônio de 3HP

[0062] O sal de amônio do 3HP pode ser preparado por processos de decomposição de sal, como aqueles descritos no documento US20100099910.

Exemplo 5: Conversão do 3HP em ácido acrílico

[0063] O 3HP pode ser convertido em ácido acrílico pela conversão no sal de amônio, seguido por um tratamento com um catalisador de desidratação de óxido (por exemplo, consulte a patente Norte-Americana No. 8338145) ou outros métodos, como a destilação reativa (por exemplo, consulte a patente Norte-Americana No. 8198481).

Exemplo 6: Uso de substratos alternativos, conversão de glicerol em 3-hidroxipropionato de etila

[0064] O glicerol, incluindo os resíduos de glicerol provenientes da fabricação de biodiesel, pode ser convertido em ácido 3-hidroxipropiônico ou em ácido acrílico, utilizando a cultura bacteriana como catalisador exógeno. A bactéria é cultivada até uma densidade celular igual a 0,75, quando medido a A600 e, em seguida, é adicionada em uma solução de glicerol a 10%, que pode ser glicerol purificado em água ou resíduo de biodiesel diluído em água, até uma concentração efetiva de 10% de glicerol. O resíduo de biodiesel não requer tratamento prévio. A conversão de glicerol em 3HP pode ser monitorada usando espectroscopia de UV visível, espectroscopia de IV e os produtos finais analisados com HPLC e CG-espectroscopia de massa.

Exemplo 7: Conversão do 3HP em reuterina

[0065] A reuterina é um agente antimicrobiano (3- hidroxipropionaldeído, seu dímero e hidrato) inibitório para vários tipos de bactérias. Este composto é geralmente produzido por L. reuteri cultivada em glicerol. O éster etílico do ácido 3-hidroxipropiônico ou o ácido 3- hidroxipropiônico produzido por Acetobacter lovaniensis FJ1 pode ser adicionalmente convertido neste composto por tratamento com um catalisador adequado, ou pela ação de uma enzima apropriada, como um álcool desidrogenase, usada sob condições adequadas.

Exemplo 8: Conversão enzimática de 3HP em ácido acrílico e em ésteres do ácido acrílico

[0066] O ácido 3-hidroxipropiônico produzido no processo acima pode ser convertido em ácido acrílico pelo uso de uma enzima desidratase sob condições apropriadas, usadas pelas pessoas versadas na técnica. Os produtos de éster do ácido 3-hidroxipropiônico, como metila, propila e butila, podem ser sintetizados pela adição da razões molares do ácido e do álcool respectivo em ligeiro excesso, seguido pelo tratamento com uma enzima lipase sob condições apropriadas, conforme utilizado pelas pessoas versadas na técnica. O éster etílico pode ser recuperado do meio bacteriano usado por qualquer método de destilação adequado.

Claims (21)

1. Método para produzir um éster do ácido 3- hidroxipropiônico caracterizado pelo fato de compreender: cultivar uma bactéria Acetobacter lovaniensis em um meio de crescimento contendo fosfato a um nível entre 1 e 150 g/L, em que o cultivo da bactéria produz o éster do ácido 3-hidroxipropiônico.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o éster do ácido 3- hidroxipropiônico é 3-hidroxipropionato de etila.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento contém mais de 2 g/L de fosfato.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento contém mais de 10 g/L de fosfato.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento contém mais de 13 g/L de fosfato.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento compreende entre 1 e 30 g/L de fosfato.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento contém entre 10 e 30 g/L de fosfato.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento é isento de fontes de nitrogênio exógenas.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento é isento de fontes de carbono exógenas.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento contém glicerol.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento tem pH entre 4 e 7.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a bactéria é cultivada a uma temperatura entre 15 °C e 30 °C.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a bactéria é cultivada até o meio de crescimento atingir uma DO600 entre 0,75 e 1,00.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a bactéria é a cepa FJ1 com número de registro NCIMB 41808.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda uma etapa de separar o éster do ácido 3-hidroxipropiônico do meio de crescimento.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma etapa de conversão do éster do ácido 3-hidroxipropiônico em ácido 3- hidroxipropiônico.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda uma etapa de separar o ácido 3-hidroxipropiônico.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a etapa de secar o ácido 3-hidroxipropiônico.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda uma etapa de transformar o ácido 3-hidroxipropiônico em outros produtos químicos, como os sais de 3- hidroxipropionato (incluindo 3-hidroxipropionato de amônio, sódio e cálcio), ésteres de 3-hidroxipropionato (incluindo os ésteres metílico, propílico e butílico), ácido acrílico, acrilatos, ácido poliacrílico, polímeros de acrilato, acrilonitrila, acrilamida, acroleína, 1,3- propanodiol e reuterina.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método é para produzir o ácido 3-hidroxipropiônico, o método compreendendo: cultivar a cepa FJ1 de Acetobacter lovaniensis com o número de registro NCIMB 41808 em um meio de crescimento contendo fosfato a um nível entre 10 e 30 g/L, em que o cultivo da bactéria produz 3-hidroxipropionato de etila; separar o 3-hidroxipropionato de etila do meio de crescimento; converter o 3-hidroxipropionato de etila em ácido 3- hidroxipropiônico; separar o ácido 3-hidroxipropiônico; e opcionalmente secar o ácido 3-hidroxipropiônico.

21. Método para produzir um éster do ácido 3- hidroxipropiônico, caracterizado pelo fato de compreender: fornecer um meio aquoso contendo um extrato isento de células de uma bactéria Acetobacter lovaniensis cultivada em um meio de crescimento contendo fosfato a um nível entre 1 e 150 g/L, em que o éster do ácido 3-hidroxipropiônico é produzido no meio aquoso; e opcionalmente, separar o éster do ácido 3- hidroxipropiônico do meio aquoso.