CN102443547B

CN102443547B - 一株粘红酵母及其制备（s）-n-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法

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Publication number: CN102443547B
Application number: CN201010509822.4A
Authority: CN
Inventors: 吴中柳; 汤传根; 张超; 杨涛; 刘章琴; 林晖
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2030-10-15
Also published as: CN102443547A

Abstract

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一株粘红酵母以及应用该菌种转化N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生产抗抑郁药度洛西汀的关键手性中间体(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法。本发明粘红酵母（Rhodotorulaglutinis）CY12，保藏号为：CCTCCM2010180。用本发明粘红酵母在30℃温度下培养8~48小时，离心收集菌体，经磷酸盐缓冲液洗涤2次后，获得湿菌体作为生物催化剂，重悬于磷酸盐缓冲液制成菌悬液，转化体系中加入底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺，并加入1%的葡萄糖作为辅酶再生底物，经生物转化获得产物(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。本发明粘红酵母菌体易于制备，反应条件温和，产物收率高，易于工业化。

Description

一株粘红酵母及其制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一株粘红酵母以及应用该菌种转化N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生产抗抑郁药度洛西汀的关键手性中间体(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法。

背景技术

度洛西汀是第三代抗抑郁药，是市场销售最主要的抗抑郁药，能有效地抑制5-羟色氨和去甲肾上腺素的再摄取(Wong D T et al.Life Sci,1988,43:2049-2057.)，高效，安全，副作用小，对其他症状如全身疼痛和胃肠道紊乱也有疗效(Bymaster FP et al.Neuropsychopharmacology,2001,25:871-880.)。该药还被批准用于糖尿病引起的神经疼痛以及女性尿失禁的治疗(NortonPA et al.Am J Obstet Gynecol,2002,187:40-48.)。2007年，其全球销售额已达到21亿美元，较前一年增长60%，2008年，其全球销售额为30亿美元，市场预计其销售额将继续大幅增长。

度洛西汀含有一个手性中心，研究表明仅(S)构型的对映体具有药物活性。(S)-度洛西汀的合成关键步骤为(S)构型手性醇中间体的获得。目前对(S)构型手性醇中间体的获得主要通过化学途径，但存在诸多问题，如化学拆分需要使用大量的拆分剂，反应步骤长，能耗高以及废物排放量大等；基于过渡金属手性配体催化氢化体系，由于产品光学纯度不高以及重金属残留等问题，导致其难以应用于医药中间体的生产。

与化学方法相比，生物催化过程具有高度的化学、区域和立体选择性，反应条件温和，后处理容易，能耗较低，是一种环境友好的合成方法，也是当今化工生产和相关领域发展一大潮流。其中生物催化不对称还原已经发展成为全球各大医药公司研发部门的重要组成部分(Carballeira JD et al.Biotechnology Advances,2009,27:686-714.)。如先灵葆雅公司系统研究了300多种菌株催化的数十种苯基酮为骨架的底物的不对称还原；默克公司对含氟苯基酮的不对称还原研究。然而，迄今为止的绝大部分研究集中于苯基酮为骨架的底物，而以杂芳环酮为骨架的底物研究较少见，其中与度洛西汀手性中间体合成相关的更是屈指可数(Wada M,etal.Biosci Biotechnol Biochem,2004,68:1481-1488;Stürmer R,et al.US,2008,0318288A1)。Soni等人2005年报道的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)催化的(S)-度洛西汀关键醇中间体合成，虽然该生物转化在底物浓度为1g/l时，能以高的转化率以及高的对映体过量得到(S)-度洛西汀关键醇中间体，但是该微生物菌株的转化率和对映体过量均会随着底物浓度的增加而迅速降低，该弊端严重阻碍其在(S)-度洛西汀工业生产的应用。使用醇脱氢酶进行不对称还原，如Exiguobacterium sp.F42中的短链脱氢酶以及Thermoanaerobacter中的醇脱氢酶，虽然能有效的获得(S)-度洛西汀关键醇中间体，但这两种方法必须外加昂贵的辅酶NADH或NADPH，使得(S)-度洛西汀关键醇中间体的生产成本大大提高，该弊端阻碍这两种方法在(S)-度洛西汀关键醇中间体工业生产的应用（ada,M.;Yoshizumi,A.;Furukawa,Y.;Kawabata,H.;Ueda,M.;Takagi,H.;Nakamori,S.Biosci.Biotechnol.Biochem.2004,68:1481-1488.;Breuer,M.WO2007074060A1）。(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺是(S)-度洛西汀的一种关键醇中间体，目前，尚未有微生物转化制备该关键手性醇中间体的报道。

发明内容

本发明的目的是公开一种粘红酵母，该菌于2010年7月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC M2010180，分类命名：粘红酵母Rhodotorula glutinis CY12，并利用该菌具有生产高活力、高对映选择性的羰基还原酶的特性，还原底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺制备光学纯(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺，该(S)型产物是合成抗抑郁药度洛西汀的关键手性中间体。

本发明粘红酵母(Rhodotorula glutinis CY12，CCTCC M2010180)的筛选方法：利用休止细胞全细胞生物转化的方法，从中科院成都生物研究所保藏的38株微生物中筛选能够将底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺转化为(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的菌株，并将转化率最高且对映体过量值大于99%的菌株进行进一步的鉴定。经筛选得到本发明涉及的粘红酵母CY12。具体方案见实施例1和2。

采用上述粘红酵母作为生物催化剂，转化N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。具体方法如下：

1.菌株培养：

斜面保存培养基组分为：胰蛋白胨1%；酵母提取物0.5%；NaCl1%；琼脂粉2%；

酵母培养基组成为：胰蛋白胨0.5%；酵母提取物0.15%；牛肉膏0.15%；NaCl0.5%；葡萄糖1%；

以上含量均为质量/体积百分比，溶于去离子水，用NaOH调pH值为7.0，105kPAa，121°C，灭菌20分钟。

斜面培养：将筛选得到的红酵母接种于斜面保存培养基上，30°C培养48~60小时；

种子培养：将斜面培养的菌株，无菌条件下用接种环接种于约10ml液体酵母发酵培养基中，30°C培养24~36小时，制得种子液；

摇瓶培养：以0.4%~1%接种量将种子液接入新鲜的酵母液体培养基中，30°C，230转/分钟，培养8~48小时。

2.收集菌体：取步骤(1)摇瓶培养的菌液在4°C、8000转/分钟条件下离心5分钟，收集菌体，并用磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(0.1M,pH6.0~8.0)充分洗涤2次，得到湿菌体作为生物催化剂。

3.生物转化实验：将步骤(2)中的生物催化剂湿菌体以上述缓冲液配成粘红酵母细胞浓度为50~300g/l的菌悬液，加入底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺(底物制备详见实施例1，底物溶于二甲亚砜)，终浓度为1~30g/l，添加1%的葡萄糖作为辅酶再生底物。转化条件为：20~40°C，转速为200~280转/分，转化时间为4~44小时。

4.分离样品：用一倍体积的乙酸乙酯萃取两次，用无水硫酸钠干燥后，在旋转蒸发仪上减压蒸馏去除溶剂乙酸乙酯，最后用2~10ml异丙醇（HPLC级）充分溶解即为备用检测样品。

5.HPLC检测：取步骤(4)中1~3μl样品进样，用普通色谱柱测定N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺及N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的含量，利用手性色谱柱测定(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺及(R)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的含量，最后计算出转化率和ee值。

在上述方法中，检测转化率时色谱柱为Inertsil SIL-100A250×4.6mm，流动相：正己烷：异丙醇=70:30，流速1ml/min，N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺和N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的滞留时间分别为8.921和13.022min；检测ee值时手性色谱柱为Daicel Chiralcel OJ-H250×4.6mm，流动相：正己烷：异丙醇=90:10，流速0.5ml/min,(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺和(R)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的滞留时间分别为22.808和24.176min。

本发明的催化剂粘红酵母菌体易于制备，反应条件温和，产物收率在90%以上，ee值99%以上，产物浓度高达27g/l，具有较好的工业应用前景。

附图说明：

图1是N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺标样手性HPLC图谱。1号峰为(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺，2号峰为(R)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。

图2是实施例25利用粘红酵母菌体转化底物N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺时，体系扩大到50ml，转化后的普通HPLC图谱。1号峰为N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺，2号峰为N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。

图3是实施例25利用粘红酵母菌体转化底物N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺时，体系扩大到50ml时，转化后的手性HPLC图谱。

1号峰为(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺，2号峰为(R)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。

具体实施方式

实施例1底物合成

3-氧-3-(2-噻吩基)丙酸甲酯制备：

在室温下，配有冷凝管，恒压滴液漏斗，机械搅拌的干燥三口烧瓶中，室温下加入干燥甲苯500ml，0.2Mol NaH，0.11Mol碳酸二甲酯，将反应装置至于油浴中加热至回流，慢慢滴入0.1Mol噻吩乙酮，此时有大量气泡产生，滴加完毕，继续加热回流，TCL检测原料反应完全，停止加热，将反应混合溶液冷却至室温，冰浴下慢慢滴入20ml甲醇萃灭反应，混合溶液中加入稀盐酸（1M）调pH为中性，萃取，取有机层，水相继续用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除溶剂，所得液体进行柱层析得到淡黄色液体，经¹HNMR鉴定为3-氧-3-(2-噻吩基)丙酸甲酯，产率80％。

N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺

将所得3-氧-3-(2-噻吩基)丙酸甲酯10g溶于100ml甲醇，室温下滴入15ml甲胺水溶液，反应24h后，加入盐酸（6M）调pH至酸性，继续搅拌4h后，减压蒸馏除溶剂，剩余物溶于乙酸乙酯，加入等体积水进行萃取，取有机层，水相继续用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除溶剂，所得固体进行柱层析得到白色固体，经¹HNMR鉴定为N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺，产率95％。

实施例2菌种筛选

将保存的待筛选菌株无菌条件下接于液体酵母培养基中（培养基组分见说明书），30°C条件下，230转/分钟，振荡培养24小时，制得种子，1%接种量转接至新鲜的液体酵母培养基中，30°C条件下，230转/分钟，振荡培养40小时。将培养的菌液在4°C下，8000转/分钟条件下离心5分钟，收集沉淀菌体，并用磷酸钾缓冲液(0.1M,pH7.0)充分洗涤，得到湿菌体作为生物催化剂。

将湿菌体以上述缓冲液配成浓度为80g/l的菌悬液，加入1g/l N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺，并加入1%的葡萄糖和5%的异丙醇作为辅酶再生底物，生物转化体系均为10ml。在30°C条件下，230转/分钟，转化24小时。转化完毕，反应液用一倍体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯，所得物充分溶于2ml异丙醇，薄层层析检测，取薄层层析检测有产品生成N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的样品1μl进行HPLC检测，计算出转化率和ee值。经过筛选得到一株能够高效将底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺转化为(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的菌株，其转化率和ee值分别达到达到95%和99%以上。

实施例3筛选菌株的鉴定

为确定该菌株分类地位并详细了解其性能，对该菌株进行了初步鉴定。该菌株具有以下特征：

形态特征：球形或椭球形，菌落后期呈红色，湿润，圆形，边缘整齐，不透明。

生理生化特征：

(1)产酸试验：阳性；

(2)产酯试验：阳性；

(3)产生类淀粉试验：阴性；

(4)重氮基蓝B（DBB）试验：阳性；

(5)脲酶试验；阳性；

(6)分解杨梅苷试验：阳性；

(7)同化乙醇试验：阳性；

(8)同化氮源(KNO3)试验：阳性；

(9)石蕊牛奶反应试验：变红；

(10)碳源同化试验：阳性：Glucose、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、α-甲基-葡萄糖苷、

D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖和甘露糖；阴性：半乳糖、乳糖、肌醇、蜜二糖、纤维二糖、菊糖、可溶性淀粉和甘露醇；

18S rRNA鉴定：基因组DNA为模板，以细菌通用引物NS1和NS8扩增18S rRNA序列。其序列如下(1776bp)：

GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTTTAAGCAATAAACAGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTCATAGTTTATTTGATGGTACCTTACTACATGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAAATCCCGACTTCTGGAAGGGATGTATTTATTAGATCCAAAACCAATGGCCTTCGGGTCCCTATGGTGAATCATGATAACTGCTCGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGCTTCATTCAAATATCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTGATGACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGAGGGCCTGAGAAACGGCCCTCAGGTCTAAGGACACGCAGCAGGCGCGCAAATTATCCCCTGGCAACACTTTGCCGAGATAGTGACAATAAATAACAATGCAGGGCTCTTACGGGTCTTGCAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAATTGTTGCCGTTAAAAAGCTCGTAGTCGAACTTCGGGCTCTGTCAGCCGGTCCGCCTTCTTGGTGTGTACTTGTTTGATGGAGCCTTACCTCCTGGTGAACGGCGATGTCCTTTACTGGGTGTCGTCGCAAACCAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCCCGAATACATTAGCATGGAATAATAAAATAGGACGCGCGTTCCCATTTTGTTGGTTTCTGAGATCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGCATTTGTATTCCGTCGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTGCCGGAAGACAAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCAAGAACGAAGGAAGGGGGATCGAAAACGATTAGATACCGTTGTAGTCTCTTCTGTAAACTATGCCAATTGGGGATCGGTACAGGATTTTTAATGACTGTATCGGCACCCGAAGAGAAATCTTTAAATGAGGTTCGGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGTGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATCTTGTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGACCAGCCGGCTTTGGCTAGCTGCTGTCTTCTTAGAGGGACTATCAGCGTTTAGCTGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAGAGCCAGCGAGTCTACCACCTTTGCCGGAAGGCATGGGTAATCTTGTGAAACTCTGTCGTGATGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATACCTAGTAAGCGTGATTCATCAGATCGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGCTATTGGGAGCTCGCGAGAGCACCCGACTGCCGAGAAGTTGTACGAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGA

根据以上生理生化试验结果，对照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，该菌可初步定为粘红酵母(Rhodotorula glutinis)。同时，根据18S rRNA鉴定结果，经NCBI比对，该酵母和已报道的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的同源性为99%。因此，本实验室将该菌命名为粘红酵母Rhodotorula glutinis CY12，于2010年7月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC M2010180。

实施例4-25利用粘红酵母(Rhodotorula glutinis CY12，CCTCC M2010180)休止细胞转化底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成产物(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。

实施例4

培养基配方和种子液制备方法如前所述。300μl种子液转接至70ml新鲜的酵母培养基中(250ml容量的摇瓶)，在30°C下，230转/分钟震荡培养24小时，4°C下，8000转/分钟条件下离心5分钟，收集沉淀菌体，并用磷酸盐缓冲液(0.1M,pH7.0)充分洗涤，得到湿菌体作为生物催化剂。将所得湿菌体用缓冲液配成细胞浓度为100g/l菌悬液。5ml反应体系，底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺浓度为10g/l，加入1%的葡萄糖和5%的异丙醇作为辅酶再生底物，30°C，230转/分钟，转化24小时，反应混合液用一倍体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏将除去乙酸乙酯，所得残余物用2ml异丙醇(HPLC级)充分溶解，取2μl样品进行HPLC检测(方法和柱子类型详见说明书)，计算转化率为19%，ee值>99%。

底物和产物数据如下：

N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺数据如下：

白色粉末

¹H NMR[(600MHz,CDCl₃)δppm2.86(d,3H,-NMe),3.8952(s,2H,-CH₂),7.12(m,2H,aromatic and NH),7.74(d,1H,aromatic),7.836(d,1H,aromatic)]。

(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺数据如下：

白色粉末，[α]_D=-32.5(c=0.90;CHCl₃)

¹H NMR[(600MHz,CDCl₃):δ=2.67(d,2H,-CH₂),2.83(d,3H,-NCH₃),5.36(t,1H,-CH),5.75(br,1H,-NH),6.96(m,2H,aromatic),7.24(m,1H,aromatic)]。

实施例5~25底物和产物数据与实施例4相同。

实施例5

用于生物转化的菌体培养32小时。其余实验条件同实施例4。HPLC检测，转化率为53%，ee值>99%。

实施例6

用于生物转化的菌体培养40小时。其余实验条件同实施例4。HPLC检测，转化率为78%，ee值>99%。

实施例7

用于生物转化的菌体培养48小时。其余实验条件同实施例4。HPLC检测，转化率为81%，ee值>99%。

实施例8

实施例1中菌株筛选和实施例4-7中菌株初步转化实验时，采用葡萄糖和异丙醇组合的添加方式作为辅酶再生底物。为了进一步筛选较优的辅酶再生底物，设计四组实验，分别为：未加辅酶再生底物作为空白对照；加1%葡萄糖；加5%异丙醇；加1%葡萄糖+5%异丙醇。用于生物转化的菌体培养48小时，其余条件同实施例4。实验结果表明，反应体系中添加1%的葡萄糖作为辅酶再生底物转化率最高为91%，ee值>99%。因此，以下实施例中辅酶再生底物均为1%葡萄糖。

实施例9

培养基配方和种子液制备方法见说明书。用于生物转化的菌体培养48小时，离心收集菌体洗涤后作为生物催化剂。5ml反应体系，添加1%的葡萄糖作为辅酶再生底物，粘红酵母细胞浓度和底物浓度分别为50g/l和4g/l，30°C条件下，230转/分钟，转化4小时，反应液用一倍体积乙酸乙酯萃取两次，收集有机层无水硫酸钠干燥以后，减压蒸馏除去乙酸乙酯，残余物用2ml异丙醇（HPLC级）充分溶解，取2μl样品进行HPLC检测(方法和柱子类型详见说明书)，并计算出转化率为33%，ee值>99%。

实施例10

反应体系中的粘红酵母细胞浓度为100g/l，其余实验条件同实施例9。用HPLC检测，并计算出转化率为54%，ee值>99%。

实施例11

反应体系中的粘红酵母细胞浓度为150g/l，其余实验条件同实施例9。用HPLC检测，并计算出转化率为62%，ee值>99%。

实施例12

反应体系中的粘红酵母细胞浓度为200g/l，其余实验条件同实施例9。用HPLC检测，并计算出转化率为74%，ee值>99%。

实施例13

反应体系中的粘红酵母细胞浓度为250g/l，其余实验条件同实施例9。用HPLC检测，并计算出转化率为85%，ee值>99%。

实施例14

反应体系中的粘红酵母细胞浓度为300g/l，其余实验条件同实施例9。用HPLC检测，并计算出转化率为88%，ee值>99%。

实施例15

培养基配方和种子液制备方法见说明书。用于生物转化的菌体培养48小时，离心收集菌体洗涤后作为生物催化剂。5ml反应体系，添加1%的葡萄糖作为辅酶再生底物，粘红酵母细胞浓度和底物浓度分别为300g/l和10g/l，30°C条件下，230转/分钟，转化12小时，用一倍体积乙酸乙酯萃取两次，收集有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯，残余物用5ml异丙醇(HPLC级)充分溶解，取2μl样品进行HPLC检测，并计算出转化率为99%，ee值>99%。

实施例16

反应体系中的底物浓度为14g/l，其余实验条件同实施例15。用HPLC检测，并计算出转化率为99%，ee值>99%。

实施例17

反应体系中的底物浓度为18g/l，其余实验条件同实施例15。用HPLC检测，并计算出转化率为90%，ee值>99%。

实施例18

反应体系中的底物浓度为24g/l，其余实验条件同实施例15。用HPLC检测，并计算出转化率为70%，ee值>99%。

实施例19

反应体系中的底物浓度为30g/l，其余实验条件同实施例15。用HPLC检测，并计算出转化率为52%，ee值>99%。

实施例20

培养基配方和种子液制备方法见说明书。用于生物转化的菌体培养48小时，离心收集菌体洗涤后作为生物催化剂，操作同实施例4，5ml反应体系，添加1%的葡萄糖作为辅酶再生底物，粘红酵母细胞浓度和底物浓度分别为300g/l和30g/l，转化20小时，用一倍体积乙酸乙酯萃取两次，收集有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯，残余物用5mlHPLC异丙醇充分溶解，取2μl样品进样，用HPLC检测，并计算出转化率为76%，ee值>99%。

实施例21

生物转时间为24小时，其余实验条件同实施例20。用HPLC检测，并计算出转化率为78%，ee值>99%。

实施例22

生物转时间为28小时，其余实验条件同实施例20。用HPLC检测，并计算出转化率为81%，ee值>99%。

实施例23

生物转时间为32小时，其余实验条件同实施例20。用HPLC检测，并计算出转化率为89%，ee值>99%。

实施例24

生物转时间为44小时，其余实验条件同实施例20。用HPLC检测，并计算出转化率为96%，ee值>99%。

实施例25

反应体系扩大到50ml，生物转化44小时。其余实验条件同实施例20。用HPLC检测，并计算出转化率为95%，ee值>99%(HPLC图谱见说明书附图2和3)。

实施例26(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的衍生制备(S)-度洛西汀前体

在无水无氧的三口烧瓶中，加入10ml无水四氢呋喃和(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺(0.09g，0.0005mol，1eq)，充分溶解后，将装置放于冰水浴中，慢慢滴加硼化氢四氢呋喃溶液(0.0006mol,1.2eq)，滴加完毕，混合加热回流1.5h，停止反应，将反应冷却至室温，冰浴下向反应混合溶液中加入10ml水萃灭反应，然后冰浴下加入冰醋酸将pH调至5，室温搅拌20min，加入氢氧化钠水溶液调pH至9，加入乙酸乙酯萃取，取有机相，水相继续用乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除溶剂，所得固体进行柱层析得到白色固体，经¹HNMR鉴定为3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇，产率55％。

¹H-NMR(CDCl₃,600MHz)δ1.96(m,2H),2.45(s,3H),2.92(m,2H),3.88(brs,3H),5.20(m,1H),6.91(m,2H),7.20(d,1H,J＝6.2Hz)

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，根据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均属于本发明保护的范围。

Claims

1.一种粘红酵母（Rhodotorula glutinis）CY12，保藏号为：CCTCC No:M2010180。

2.权利要求1所述粘红酵母制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法，其特征在于：30°C培养粘红酵母（Rhodotorula glutinis）CY12CCTCC No:M2010180，至8～48h，离心收集菌体，经磷酸盐缓冲液洗涤2次后，获得湿菌体作为生物催化剂，重悬于磷酸盐缓冲液制成菌悬液，转化体系中加入底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺，并加入1%的葡萄糖作为辅酶再生底物，经生物转化获得产物(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。

3.根据权利要求2所述的制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法，其特征是：所述磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，浓度为0.1M，pH为7.0。

4.根据权利要求2所述的制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法，其特征是：生物转化的温度为20～40°C，转速为200～280转/分，转化时间为4～44小时。

5.根据权利要求2所述的制备(S)-N-甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法，其特征是：转化体系中粘红酵母细胞浓度以湿重计为50～300g/l，底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺浓度为1～30g/l。