CN109628505A

CN109628505A - 一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法

Info

Publication number: CN109628505A
Application number: CN201910023941.XA
Authority: CN
Inventors: 吕妍婷; 许娜; 潘曼曼; 贠军贤
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2019-04-16

Abstract

本发明公开一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法。所述方法是以离子交换晶胶作为载体，利用晶胶对副干酪乳杆菌细胞的吸附作用，在发酵过程中形成高浓度全细胞催化剂，通过其减轻底物抑制，提高发酵过程的生物量，进而提高了苯乳酸的产量。本发明提供的方法比常规游离细胞发酵所得苯乳酸的产量高，发酵液中的苯乳酸容易分离，其发酵过程简单，操作方便，安全性好，放大容易，在生物化工合成领域有广阔的应用前景。

Description

一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法。

背景技术

苯乳酸是一种新型广谱抗菌剂，也是合成聚苯乳酸新材料的重要单体，同时还可以作为合成药物的中间体，在化学工业、新材料、食品工业和制药等许多领域具有广阔的应用前景。

苯乳酸可以通过苯丙酮酸催化氢化法、不对称环氧化合成、锌汞齐还原法等化学方法进行合成，但常需要使用贵金属催化剂、高度溶剂、危险气体和高温高压等苛刻的反应条件，反应步骤多，过程耗能，副产物和三废量大，目前尚不能大规模生产。

微生物发酵、酶催化转化及全细胞微生物转化等生物方法，成为当前全球关注的重点方向。然而，微生物发酵过程中受限于底物抑制、菌体浓度小、菌株转化效率低、底物昂贵、苯乳酸的产量低、浓度小、分离难度大等局限性，急需研究解决。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明目的在于提供一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法。

一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于MRS液体培养基、副干酪乳杆菌细胞和离子交换晶胶分别作为发酵原料液、全细胞催化剂和载体，利用发酵过程中副干酪乳杆菌细胞吸附在晶胶上形成高浓度全细胞催化剂以减轻底物抑制，催化发酵合成苯乳酸。

所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于具体步骤如下：

1）将副干酪乳杆菌株在MRS液体培养基中活化，制备得到种子液；

2）步骤1）所得种子液接种到MRS液体培养基中，静置培养，得到培养液；

3）将离子交换晶胶投入到步骤2）所得培养液中静置培养，培养结束后，捞出晶胶并沥干晶胶表面水分，得到种子晶胶载体；

4）将步骤3）所得种子晶胶载体投入到新配的MRS液体培养基中进行催化发酵，发酵结束后，发酵液进行后续分离，得到苯乳酸产品。

所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于所述的离子交换晶胶为聚甲基丙烯酸羟乙酯基阴离子交换整体晶胶，其直径4~6mm，厚度3~5mm，孔径范围在10~200 µm，孔隙率72%~83%，在水中具有良好的弹性。

所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤2）种子液接种到MRS液体培养基中，所述种子液的体积为所述MRS液体培养基体积的4~8%，优选为6%；步骤2）中，进行静置培养的温度为33~37℃，优选为35℃，进行静置培养的时间为7~9h，优选为8h。

所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤3）离子交换晶胶投入到培养液中，所述离子交换晶胶的体积为所述培养液体积的4~6%，优选为5%；步骤3）中，进行静置培养的温度为33~37℃，优选为35℃，进行静置培养的时间为5~7h，优选为6h。

所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤4）种子晶胶载体投入到MRS液体培养基中，所述种子晶胶载体的体积为所述MRS液体培养基体积的4~6%，优选为5%；步骤4）中，进行催化发酵的温度为33~37℃，优选为35℃，进行催化发酵的时间为12~72h。

所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1）中，副干酪乳杆菌株在MRS液体培养基中活化的时间为22~26h，优选为24h。

通过采用上述技术，本发明具有如下有益效果：

1）本发明提供的方法，以离子交换晶胶作为载体，利用晶胶对副干酪乳杆菌细胞的吸附作用，在发酵过程中形成高浓度全细胞催化剂，通过其减轻底物抑制，提高发酵过程的生物量。通过本发明的方法合成苯乳酸的产量比常规游离细胞发酵合成的苯乳酸产量高，由于细胞吸附于晶胶载体，其发酵液中细胞浓度很低，粘度小，苯乳酸的分离容易，发酵完成后，发酵液的后续分离可以采用常规分离方法，如吸附、结晶、晶胶层析、钙盐沉淀等。

2）本发明提供的方法，晶胶载体孔隙率高，孔径大，底物和产物的传质和扩散迅速，晶胶作为菌体细胞的载体，可以提高细胞表面酶系的稳定性，减小了底物抑制。

3）本发明提供的方法，发酵过程简单，操作方便，安全性好，放大容易，在生物化工合成领域有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

以下实施例中，MRS液体培养基组成为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，柠檬酸氢二胺2 g/L，无水乙酸钠5 g/L，硫酸锰0.25 g/L，硫酸镁0.58 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10 g/L，吐温80 1 mL/L。

以下实施例中，高效液相色谱检测分析的条件为：Agilent 1260 infinity高效液相色谱系统，二极管阵列检测器G1315D，色谱柱Agilent Zorbax SB-C18（4.6×150 mm 5-Micron）；流动相为水+0.05%三氟乙酸（A）和甲醇+0.05%三氟乙酸（B），梯度洗脱；检测波长210 nm，流动相流速为1 mL/min，柱温30℃，进样量20 µL。

以下实施例中，晶胶为聚甲基丙烯酸羟乙酯基阴离子交换整体晶胶，其直径4~6mm，厚度3~5mm，孔径范围在10~200 µm，孔隙率72%~83%，在水中具有良好的弹性。

实施例1

将副干酪乳杆菌株在30 mL MRS液体培养基中活化24h得到种子液；取30 mL种子液，接种到500 mL MRS液体培养基中，静置培养8h，得到培养液；将1.7 g晶胶投入培养液中，静置培养16h后，捞出晶胶并沥干晶胶表面水分，得到种子晶胶载体。取1.5 mL种子晶胶载体投入到30 mL MRS液体培养基中继续发酵，晶胶载体中的副干酪乳杆菌株细胞干重达到3.43mg/mL，发酵12h后，对发酵液进行高效液相色谱检测分析，苯乳酸浓度达到73 mg/L。

实施例2

将副干酪乳杆菌株在30 mL MRS液体培养基中活化24h得到种子液；取30 mL种子液，接种到500 mL MRS液体培养基中，静置培养8h，得到培养液；将1.7 g晶胶投入培养液中，静置培养16h后，捞出晶胶并沥干晶胶表面水分，得到种子晶胶载体。取1.5 mL种子晶胶载体投入到30 mL MRS液体培养基中继续发酵，晶胶载体中的副干酪乳杆菌株细胞干重达到6.43mg/mL，发酵36h后，对发酵液进行高效液相色谱检测分析，苯乳酸浓度达到90 mg/L。

实施例3

将副干酪乳杆菌株在30 mL MRS液体培养基中活化24h得到种子液；取30 mL种子液，接种到500 mL MRS液体培养基中，静置培养8h，得到培养液；将1.7 g晶胶投入培养液中，静置培养16h后，捞出晶胶并沥干晶胶表面水分，得到种子晶胶载体。取1.5 mL种子晶胶载体投入到30 mL MRS液体培养基中继续发酵，晶胶载体中的副干酪乳杆菌株细胞干重达到6.67mg/mL，发酵60h后，对发酵液进行高效液相色谱检测分析，苯乳酸浓度达到95 mg/L。

实施例4

将副干酪乳杆菌株在30 mL MRS液体培养基中活化24h得到种子液；取30 mL种子液，接种到500 mL MRS液体培养基中，静置培养8h，得到培养液；将1.7 g晶胶投入培养液中，静置培养16h后，捞出晶胶并沥干晶胶表面水分，得到种子晶胶载体。取1.5 mL种子晶胶载体投入到30 mL MRS液体培养基中继续发酵，晶胶载体中的副干酪乳杆菌株细胞干重达到7.10mg/mL，发酵72h后，对发酵液进行高效液相色谱检测分析，苯乳酸浓度达到87 mg/L。

本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。

Claims

1.一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于MRS液体培养基、副干酪乳杆菌细胞和离子交换晶胶分别作为发酵原料液、全细胞催化剂和载体，利用发酵过程中副干酪乳杆菌细胞吸附在晶胶上形成高浓度全细胞催化剂以减轻底物抑制，催化发酵合成苯乳酸。

2.根据权利要求1所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于具体步骤如下：

3. 根据权利要求1所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于所述的离子交换晶胶为聚甲基丙烯酸羟乙酯基阴离子交换整体晶胶，其直径4~6mm，厚度3~5mm，孔径范围在10~200 µm，孔隙率72%~83%，在水中具有良好的弹性。

4.根据权利要求2所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤2）种子液接种到MRS液体培养基中，所述种子液的体积为所述MRS液体培养基体积的4~8%，优选为6%；步骤2）中，进行静置培养的温度为33~37℃，优选为35℃，进行静置培养的时间为7~9h，优选为8h。

5.根据权利要求2所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤3）离子交换晶胶投入到培养液中，所述离子交换晶胶的体积为所述培养液体积的4~6%，优选为5%；步骤3）中，进行静置培养的温度为33~37℃，优选为35℃，进行静置培养的时间为5~7h，优选为6h。

6.根据权利要求2所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤4）种子晶胶载体投入到MRS液体培养基中，所述种子晶胶载体的体积为所述MRS液体培养基体积的4~6%，优选为5%；步骤4）中，进行催化发酵的温度为33~37℃，优选为35℃，进行催化发酵的时间为12~72h。

7.根据权利要求2所述的一种基于晶胶的微生物发酵合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1）中，副干酪乳杆菌株在MRS液体培养基中活化的时间为22~26h，优选为24h。