CN114369626A - 一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述的方法是以副干酪乳杆菌的破胞液为原料进行上样，以阴离子交换半疏水晶胶的堆积床层作为分离吸附介质，通过晶胶层析上样吸附，使所述破胞液原料中的活性酶充分吸附在阴离子交换半疏水晶胶上；然后将固载了活性酶的阴离子交换半疏水晶胶做为生物催化剂，加入至含有苯丙酮酸和NADH辅酶的反应液中进行生物转化反应，生成苯乳酸。本发明提供的方法，具有操作简单，高效、规模化制备容易等优点，生物催化剂可以重复利用，在苯乳酸制备方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法。
背景技术
苯乳酸做为一种具有广谱抑菌性的高值有机酸，可替代化学合成的防腐剂，同时还可做为药物关键中间体以及工程材料聚苯乳酸的前体，在医药、生物和食品工业等领域有广阔的应用前景。
苯乳酸的化学合成法由于技术路线复杂、能耗高、副产物较多，环境污染问题较为突出，规模化应用限制较多。生物转化合成苯乳酸因其条件温和，对环境安全无害，近年来引起了研究者的广泛关注。其中，利用苯乳酸生物合成中的关键酶系进行固定化，形成新型的生物催化剂，直接进行催化转化合成苯乳酸，因其具有转化率高、重复利用率高、环境友好等优点，备受国内外研究人员的重视。目前鲜有基于半疏水晶胶固定化酶做为生物催化剂催化转化合成苯乳酸的研究报道。因此，需要发展利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的相关制备技术。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明目的是提供一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，本发明的方法中将副干酪乳杆菌破胞液中的酶固定在半疏水晶胶上制备成生物催化剂，然后进一步催化转化合成苯乳酸。
本发明提供的技术方案是：
所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述的方法是以副干酪乳杆菌的破胞液为原料进行上样，以阴离子交换半疏水晶胶的堆积床层作为分离吸附介质，通过晶胶层析上样吸附，使所述破胞液原料中的活性酶充分吸附在阴离子交换半疏水晶胶上；然后将固载了活性酶的阴离子交换半疏水晶胶做为生物催化剂，加入至含有苯丙酮酸和NADH辅酶的反应液中进行生物转化反应，生成苯乳酸。
所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
1）将副干酪乳杆菌菌株的菌体按照1 : 15~30的固液比重悬于15~30 mM的PBS 缓冲液内得到细胞悬浮液，固液比的单位为g/mL，然后将所述细胞悬浮液超声破壁，高速离心后，取上清液即为副干酪乳杆菌的破胞液，该上清液作为上样液；
2）将阴离子交换半疏水晶胶填充在层析柱内，先以5～10倍层析柱柱体积的15~30mM的PBS 缓冲液冲洗层析柱，然后取5～10倍层析柱柱体积的步骤1）所得上样液过层析柱，使破胞液内的酶充分吸附在层析柱上；
3）将苯丙酮酸和NADH辅酶配制在80~120 mM的PBS缓冲液中得到转化液，转化液中苯丙酮酸浓度控制在50 μg/ml～100 μg/ml，优选为50 μg/ml～80μg/ml，NADH浓度控制在0.15μmol/ml～0.3μmol/ml，优选为0.25~0.3μmol/ml；
4）取步骤2）层析柱内的湿颗粒加入至步骤3）配制的转化液中，湿颗粒与转化液的固液比为1 g：（10～20）mL，优选为1 g：15mL，然后在转速50～200 rpm、温度30～50 ℃下进行生物转化反应，生成苯乳酸。
所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1）中，超声破壁的处理时间为30-60 min，高速离心的转速为6000-10000 rpm、时间为5-20 min。
所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1）~2）中的15~30 mM的PBS 缓冲液，以及步骤3）中80~120 mM的PBS 缓冲液的pH均为6.8~7.2。
所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤3）中过层析柱的流速为0.5～5 cm/min，优选为1~2 cm/min。
所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1）中，副干酪乳杆菌菌株的菌体制备方法为：将副干酪乳杆菌菌株在MRS培养基中经过两次活化得到种子液，将种子液按照2~6%的接种量接至MRS培养基中，在30~40 ℃条件下进行静置培养，培养40~60 h后将培养基离心得到菌体粘稠体，该菌体粘稠体即为所述副干酪乳杆菌菌株的菌体。
所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述的阴离子交换半疏水晶胶的制备方法包括以下步骤：
S1：将甲基丙烯酸羟乙酯HEMA、甲基丙烯酸丁酯BMA两种单体和交联剂聚乙二醇双丙烯酸酯PEGDA溶于超纯水中形成溶液，存于 4℃冰箱待用；
S2：向步骤S1所得溶液中加入引发剂过硫酸铵APS和加速剂四甲基乙二胺TEMED，得到水相；配制含体积分数0.5~2.0%表面活性剂Span 80的白油溶液，得到油相；
S3：利用多微管反应器制备晶胶微球，将步骤S2所得水相和油相分别注入多微管反应器中，-20~-34.5 ℃结晶致孔和聚合形成晶胶微球；
S4：最后在晶胶微球上接枝甲基丙烯酸二甲氨基乙酯DMAEMA，即得到所述的阴离子交换半疏水晶胶。
所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤S1中，溶液中HEMA、BMA和PEGDA的质量浓度分别为6~7%、3~4%和2~3%，优选为6.4~6.6%、3.2~3.5%和2.3~2.6%。
所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤S2中，APS和TEMED的添加质量分别占溶液中HEMA、BMA和PEGDA三者总质量的1.0~1.5%和1.5~1.8%，优选为1.2%和1.6%。
所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤S4中在晶胶微球上接枝甲基丙烯酸二甲氨基乙酯DMAEMA的操作过程为：
a）晶胶微球装在烧杯内，置于45~50 ℃的恒温槽水浴锅内预热；
b）按照体积比1.5~3:1将0.05~0.1M的Cu（Ⅲ）溶液与0.5~2 M的NaCl溶液混合配制成催化剂溶液，提前预热至45~50 ℃；将0.5~2 M的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯DMAEMA单体溶液提前预热至45~50 ℃；
将配制的催化剂溶液倒入步骤a）装有晶胶微球的烧杯内，45~50 ℃密封反应30~60 min后，倒出催化剂溶液，倒入DMAEMA单体溶液后继续密封反应1~3 h，反应结束之后先用HCl溶液冲去未聚合或发生自聚的单体，最后用超纯水冲洗，即制备完成。其中，上述催化剂溶液以及DMAEMA单体溶液的加入量，均为晶胶微球湿体积的1.5~3倍。
通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明提供的利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，利用半疏水晶胶固载生物催化剂，由于生物催化剂能很好地吸附在半疏水晶胶上，转化液中细胞含量少，相比发酵液，转化液内所含杂质少，降低了苯乳酸的分离纯化难度；同时有利于重复使用，重复转化的次数可达5次以上。
（2）本发明提供的利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，采用菌株为副干酪乳杆菌，具有优良的生物安全性。反应条件温和，对环境友好，制备简单，操作方便，具备规模化应用的前景。
（3）现有技术中“聚甲基丙烯酸羟乙酯基阴离子交换整体晶胶”接枝改性的放大操作较为困难，与其相比本发明通过微通道制备得到的半疏水晶胶微球接枝简单方便，易于规模化操作。本发明提供的利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，苯乳酸摩尔转化率（苯乳酸产物与苯丙酮酸底物摩尔比率）可达53%，本发明得到的高效转化合成苯乳酸的新型生物催化剂，具有优异的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明实施例中，PBS缓冲液的pH均为6.8~7.2。
实施例1：
阴离子交换半疏水晶胶的制备包括以下步骤：
1）将HEMA、BMA和PEGDA溶于超纯水中形成总质量分数为12.2%的溶液，存于4 ℃冰箱待用，其中HEMA、BMA和PEGDA分别占溶液总质量的6.5%、3.3%和2.4%。
2）向步骤1）所得溶液中加入引发剂过硫酸铵APS和加速剂四甲基乙二胺TEMED，APS和TEMED的添加质量分别占溶液中HEMA、BMA和PEGDA三者总质量的1.2%和1.6%，得到水相；配制含体积分数1.0%表面活性剂Span 80的白油溶液，得到油相；
3）利用多微管反应器制备晶胶微球（多微管反应器的具体结构参见文献：葡聚糖甲基丙烯酸甲酯水溶液的相变特性及其晶胶微球的制备，作者高亚伟等，浙江工业大学），利用精密注射泵以恒速将水相经多微管反应器的主支微通道注入，同时，油相由精密注射泵以恒速经多微管反应器的旁支微通道注入，经微流控成形，于-30 ℃结晶致孔和聚合形成晶胶微球；
4）最后在晶胶微球上接枝甲基丙烯酸二甲氨基乙酯DMAEMA，具体制备步骤为：
a）晶胶微球装在烧杯内，置于48 ℃的恒温槽水浴锅内预热；
b）制备浓度为0.056 M的Cu（III）催化剂溶液，具体步骤如下：量取400 mL的超纯水于锥形瓶中，依次加入CuSO4·5H2O 7.08 g、KIO4 14.64 g、K2S2O8 4.40 g、KOH 18.0 g。将上述物料充分搅拌溶解，在140℃油浴锅中煮沸40 min，自然冷却至室温。待冷却后，将溶液抽滤，除去其中沉淀，滤液用超纯水定容至500 mL，将定容完毕的溶液储存于棕色瓶中待用。
c）按照体积比2:1将0.056 M的Cu（Ⅲ）溶液与1 M的NaCl溶液混合配制成催化剂溶液，提前预热至48 ℃；配置1 M的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯DMAEMA单体溶液，并提前预热至48 ℃；
将配制的催化剂溶液倒入步骤a）装有晶胶微球的烧杯内，48 ℃密封反应40 min后，倒出催化剂溶液，倒入DMAEMA单体溶液后继续密封反应2 h，反应结束之后先用HCl溶液冲去未聚合或发生自聚的单体，最后用超纯水冲洗，即制备完成；其中，上述催化剂溶液以及DMAEMA单体溶液的加入量，均是晶胶微球湿体积的2倍。
副干酪乳杆菌菌株的菌体制备方法为：1）配置MRS培养基，经过121 ℃灭菌20min。将保藏的副干酪乳杆菌菌株接种至10 mL的MRS液体培养基中，35 ℃静置培养12 h，再以2%的接种量接种于液体MRS培养基中，35 ℃静置培养12 h，二次活化得到种子液体。2）将种子液按照2%的接种量接至MRS培养基中，在35 ℃条件下进行静置培养，培养48 h后将培养基离心得到菌体粘稠体，该菌体粘稠体即为所述副干酪乳杆菌菌株的菌体。
实施例1利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，包括以下步骤：
S1：取1 g上述制备的副干酪乳杆菌菌株的菌体，重悬于20 mM的20 ml PBS缓冲液内得到细胞悬浮液；然后将20 ml细胞悬浮液超声破壁40 min，超声破壁的功率为400 W，在4 ℃、8000 rpm转速下离心8 min，取上清液作为上样液，备用。
S2：将上述制备的阴离子交换半疏水晶胶填充在内径0.5 cm、高度为8 cm的层析柱内，先取5倍层析柱柱体积的20 mM的PBS缓冲液冲洗层析柱，然后取5倍层析柱柱体积的步骤S1所得上样液过层析柱，过层析柱的流速为1 cm/min，使破胞液内的酶充分吸附在层析柱上，得到生物催化剂。
S3：将0.5 mg的苯丙酮酸、1.5 μmol的NADH辅酶，溶解在100 mM的10ml PBS缓冲液，配置成苯丙酮酸浓度50μg/ml、NADH辅酶浓度0.15μmol/ml的转化液。取1 g步骤S2所得层析柱内的生物催化剂于锥形瓶内，加入10ml的转化液，在转速75 rpm、温度40 ℃的条件下进行转化。转化2 h后，取样经高效液相色谱检测，苯乳酸转化率达28.9%。
对照例1：
对照例1中生物催化剂以及副干酪乳杆菌菌株的菌体的制备方法重复实施例1中。
对照例1利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法重复实施例1中，不同之处仅在于：改变步骤S3转化反应的实验条件，具体为控制转化液中NADH辅酶浓度为0.1μmol/ml，其余条件同实施例1中。对照例1转化反应2h后，取样经高效液相色谱检测，苯乳酸转化率达18.50%。
对照例2：
对照例2中生物催化剂以及副干酪乳杆菌菌株的菌体的制备方法重复实施例1中。
对照例2利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法重复实施例1中，不同之处仅在于：改变步骤S3转化反应的实验条件，具体为控制转化液中苯丙酮酸浓度80μg/ml、NADH辅酶浓度0.1μmol/ml，并改变加入的转化液体积为15mL，其余条件同实施例1中。对照例1转化反应2h后，取样经高效液相色谱检测，苯乳酸转化率达22.10%。
实施例2：
实施例2中生物催化剂以及副干酪乳杆菌菌株的菌体的制备方法重复实施例1中。
实施例2利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，包括以下步骤：
S1：取1 g副干酪乳杆菌菌株的菌体，重悬于20 mM的20 ml PBS缓冲液内得到细胞悬浮液；然后将20ml细胞悬浮液超声破壁40 min，破壁的功率为400 W，在4 ℃、8000 rpm转速下离心8 min，取上清液作为上样液，备用。
S2：将生物催化剂填充在内径0.5 cm、高度为8 cm的层析柱内，先取5倍层析柱柱体积的20 mM的PBS 缓冲液冲洗层析柱，然后取10倍层析柱柱体积的步骤S1所得上样液过层析柱，过层析柱的流速为1 cm/min，使破胞液内的酶充分吸附在层析柱上。
S3：将0.5 mg的苯丙酮酸、2.0 μmol的NADH辅酶，溶解在100 mM的10ml PBS缓冲液，配置成苯丙酮酸浓度50μg/ml、NADH辅酶浓度0.2μmol/ml的转化液。取1 g层析柱内的湿颗粒于锥形瓶内，加入10 ml的转化液，在转速75 rmp，温度40 ℃的条件下进行转化。转化2h后，取样经高效液相色谱检测，苯乳酸转化率达40.7%。
实施例3：
实施例3中生物催化剂以及副干酪乳杆菌菌株的菌体的制备方法重复实施例1中。
利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，包括以下步骤：
S1：取1 g副干酪乳杆菌菌株的菌体，重悬于20 mM的20 ml PBS缓冲液内得到细胞悬浮液；然后将20 ml细胞悬浮液超声破壁40 min，破壁的功率为400 W，在4 ℃、8000 rpm转速下离心8 min，取上清液作为上样液，备用。
S2：将生物催化剂填充在内径0.5 cm、高度为8 cm的层析柱内，先取5倍层析柱柱体积的20 mM的PBS 缓冲液冲洗层析柱，然后取10倍层析柱柱体积的步骤S1所得上样液过层析柱，过层析柱的流速为1 cm/min，使破胞液内的酶充分吸附在层析柱上。
S3：将0.75 mg的苯丙酮酸、4.5 μmol的NADH辅酶，溶解在100 mM的15ml PBS缓冲液，配置成苯丙酮酸浓度50μg/ml、NADH辅酶浓度0.3μmol/ml的转化液。取1 g层析柱内的湿颗粒于锥形瓶内，加入15 ml的转化液，在转速75 rmp，温度40 ℃的条件下进行转化。转化2h后，取样经高效液相色谱检测，苯乳酸转化率达58.2%。
实施例4：
实施例4中生物催化剂以及副干酪乳杆菌菌株的菌体的制备方法重复实施例1中。
利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，包括以下步骤：
S1：取1 g副干酪乳杆菌菌株的菌体，重悬于20 mM的20 ml PBS缓冲液内得到细胞悬浮液；然后将20ml细胞悬浮液超声破壁40 min，破壁的功率为400 W，在4 ℃、8000 rpm转速下离心8 min，取上清液作为上样液，备用。
S2：将生物催化剂填充在内径0.5 cm、高度为8 cm的层析柱内，先取5倍层析柱柱体积的20 mM的PBS 缓冲液冲洗层析柱，然后取10倍层析柱柱体积的步骤S1所得上样液过层析柱，过层析柱的流速为1 cm/min，使破胞液内的酶充分吸附在层析柱上。
S3：将0.5 mg的苯丙酮酸、3 μmol的NADH辅酶，溶解在100 mM的10 ml PBS缓冲液，配置成苯丙酮酸浓度50μg/ml、NADH辅酶浓度0.3μmol/ml的转化液。取1 g层析柱内的湿颗粒于锥形瓶内，加入10 ml的转化液，在转速75 rmp，温度40 ℃的条件下进行转化。转化2 h后，取样经高效液相色谱检测，苯乳酸转化率达54.1%。
实施例5：
实施例5中生物催化剂以及副干酪乳杆菌菌株的菌体的制备方法重复实施例1中。
利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，包括以下步骤：
S1：取1 g副干酪乳杆菌菌株的菌体，重悬于20 mM的20 ml PBS缓冲液内得到细胞悬浮液；然后将20 ml细胞悬浮液超声破壁40 min，破壁的功率为400 W，在4 ℃、8000 rpm转速下离心8 min，取上清液作为上样液，备用。
S2：将生物催化剂填充在内径0.5 cm、高度为8 cm的层析柱内，先取5倍层析柱柱体积的20 mM的PBS 缓冲液冲洗层析柱，然后取10倍层析柱柱体积的步骤S1所得上样液过层析柱，过层析柱的流速为1 cm/min，使破胞液内的酶充分吸附在层析柱上。
S3：将1 mg的苯丙酮酸、3 μmol的NADH辅酶，溶解在100 mM的10 ml PBS缓冲液，配置成苯丙酮酸浓度100μg/ml、NADH辅酶浓度0.3μmol/ml的转化液。取1 g层析柱内的湿颗粒于锥形瓶内，加入10 ml的转化液，在转速75 rmp，温度40 ℃的条件下进行转化。转化2 h后，取样经高效液相色谱检测，苯乳酸转化率达32.3%。
实施例6：
实施例6中生物催化剂以及副干酪乳杆菌菌株的菌体的制备方法重复实施例1中。
实施例6利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，包括以下步骤：
S1：取1 g副干酪乳杆菌菌株的菌体，重悬于20 mM的20 ml PBS缓冲液内得到细胞悬浮液；然后将20 ml细胞悬浮液超声破壁40 min，破壁的功率为400 W，在4 ℃、8000 rpm转速下离心8 min，取上清液作为上样液，备用。
S2：将生物催化剂填充在内径0.5 cm、高度为8 cm的层析柱内，先取10倍层析柱柱体积的20 mM的PBS缓冲液冲洗层析柱，然后取10倍层析柱柱体积的步骤S1所得上样液过层析柱，过层析柱的流速为1 cm/min，使破胞液内的酶充分吸附在层析柱上。
S3：将0.5 mg的苯丙酮酸、2.5 μmol的NADH辅酶，溶解在100 mM的10 ml PBS缓冲液，配置成苯丙酮酸浓度50μg/ml、NADH辅酶浓度0.25μmol/ml的转化液。取1 g层析柱内的湿颗粒于锥形瓶内，加入10 ml的转化液，在转速75 rmp，温度40 ℃的条件下进行转化。转化2 h后，取样经高效液相色谱检测，苯乳酸转化率达53.1%。
将上述实施例1-6以及对照例1-2中，步骤S3的实验条件以及相应的反应结果汇总于表1中。
从表1中可以看出以下结论：
1、从实施例3与实施例4的对照实验能够看出：湿颗粒与转化液的固液比为1 g：15mL时具有更好的转化效果，这可能是因为产物抑制的影响导致的，即产物达到一定浓度，就不再继续转化反应。所以上述实验中，转化液的加入量15mL时反而要比10mL效果更好。
2、从实施例2、4和6的实验可以看出：转化液中NADH含量对转化反应也有很大的影响，NADH含量达到0.25μmol/mL时具有很好的转化效果，但是NADH含量进一步达到0.3μmol/mL时对转化反应效果的提升不大。
3、从实施例4和5的实验效果可以看出，转化液中苯丙酮酸的含量不宜过高。
实施例7：
按照实施例6的操作，步骤S3中每2 h更换转化液（即是将转化2 h的转化液过滤出去，并加入10 ml的新鲜转化液重新转化反应），五批次后，取样经高效液相色谱检测，苯乳酸转化率达30.0%。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。
Claims (10)
1.一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述的方法是以副干酪乳杆菌的破胞液为原料进行上样，以阴离子交换半疏水晶胶的堆积床层作为分离吸附介质，通过晶胶层析上样吸附，使所述破胞液原料中的活性酶充分吸附在阴离子交换半疏水晶胶上；然后将固载了活性酶的阴离子交换半疏水晶胶做为生物催化剂，加入至含有苯丙酮酸和NADH辅酶的反应液中进行生物转化反应，生成苯乳酸。
2.如权利要求1所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
1）将副干酪乳杆菌菌株的菌体按照1 : 15~30的固液比重悬于15~30 mM的PBS缓冲液内得到细胞悬浮液，固液比的单位为g/mL，然后将所述细胞悬浮液超声破壁，高速离心，取上清液即为副干酪乳杆菌的破胞液，该上清液作为上样液；
2）将阴离子交换半疏水晶胶填充在层析柱内，先以5～10倍层析柱柱体积的15~30 mM的PBS缓冲液冲洗层析柱，然后取5～10倍层析柱柱体积的步骤1）所得上样液过层析柱，使破胞液内的酶充分吸附在层析柱上；
3）将苯丙酮酸和NADH辅酶配制在80~120 mM的PBS缓冲液中得到转化液，转化液中苯丙酮酸浓度控制在50 μg/ml～100 μg/ml，优选为50 μg/ml～80μg/ml，NADH浓度控制在0.15μmol/ml～0.3μmol/ml，优选为0.25~0.3μmol/ml；
4）取步骤2）层析柱内的湿颗粒加入至步骤3）配制的转化液中，湿颗粒与转化液的固液比为1 g：（10～20）mL，优选为1 g：15mL，然后在转速50～200 rpm、温度30～50 ℃下进行生物转化反应，生成苯乳酸。
3.如权利要求2所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1）中，超声破壁的处理时间为30～60 min，超声功率为300~500W，优选为400W；高速离心的转速为6000～10000 rpm、时间为5～20 min。
4.如权利要求2所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1）~2）中的15~30 mM的PBS 缓冲液，以及步骤3）中80~120 mM的PBS缓冲液的pH均为6.8~7.2。
5.如权利要求2所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤3）中过层析柱的流速为0.5～5 cm/min，优选为1~2 cm/min。
6.如权利要求2所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤1）中，副干酪乳杆菌菌株的菌体制备方法为：将副干酪乳杆菌菌株在MRS培养基中经过两次活化得到种子液，将种子液按照2~6%的接种量接至MRS培养基中，在30~40 ℃条件下进行静置培养，培养40~60 h后将培养基离心得到菌体粘稠体，该菌体粘稠体即为所述副干酪乳杆菌菌株的菌体。
7.如权利要求1所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述的阴离子交换半疏水晶胶的制备方法包括以下步骤：
S1：将甲基丙烯酸羟乙酯HEMA、甲基丙烯酸丁酯BMA两种单体和交联剂聚乙二醇双丙烯酸酯PEGDA溶于超纯水中形成溶液，存于4 ℃冰箱待用；
S2：向步骤S1所得溶液中加入引发剂过硫酸铵APS和加速剂四甲基乙二胺TEMED，得到水相；配制含体积分数0.5~2.0%表面活性剂Span 80的白油溶液，得到油相；
S3：利用多微管反应器制备晶胶微球，将步骤S2所得水相和油相分别注入多微管反应器中，-20~-34.5 ℃结晶致孔和聚合形成晶胶微球；
S4：最后在晶胶微球上接枝甲基丙烯酸二甲氨基乙酯DMAEMA，即得到所述的阴离子交换半疏水晶胶。
8.如权利要求7所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤S1溶液中HEMA、BMA和PEGDA的质量浓度分别为6~7%、3~4%和2~3%，优选为6.4~6.6%、3.2~3.5%和2.3~2.6%。
9.如权利要求7所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤S2中，APS和TEMED的添加质量分别占溶液中HEMA、BMA和PEGDA三者总质量的1.0~1.5%和1.5~1.8%，优选为1.2%和1.6%。
10.如权利要求7所述的一种利用生物催化剂催化转化合成苯乳酸的方法，其特征在于步骤S4中在晶胶微球上接枝甲基丙烯酸二甲氨基乙酯DMAEMA的操作过程为：
a）晶胶微球装在烧杯内，置于45~50 ℃的恒温槽水浴锅内预热；
b）按照体积比1.5~3:1将0.05~0.1M的Cu（Ⅲ）溶液与0.5~2 M的NaCl溶液混合配制成催化剂溶液，提前预热至45~50 ℃；将0.5~2 M的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯DMAEMA单体溶液提前预热至45~50 ℃；
将配制的催化剂溶液倒入步骤a）装有晶胶微球的烧杯内，45~50 ℃密封反应30~60min后，倒出催化剂溶液，倒入DMAEMA单体溶液后继续密封反应1~3 h，反应结束之后先用HCl溶液冲去未聚合或发生自聚的单体，最后用超纯水冲洗，即制备完成；其中，上述催化剂溶液以及DMAEMA单体溶液的加入量，均是晶胶微球湿体积的1~3倍。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant |