CN113234609A - 合成低聚果糖的专用菌株及其用于合成低聚果糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株合成低聚果糖的专用菌株及其用于合成低聚果糖的方法。所述专用菌株为解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368。将该菌株培养于含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基中，进行培养，培养结束后菌液分离得到解脂亚罗酵母细胞，再加入蔗糖水溶液进行转化合成低聚果糖；转化结束后进行纯化精制，得到液体或粉状低聚果糖。本发明的有益效果为：第一，由于该酵母能合成果糖基转移酶且能循环使用，因此无需购买果糖基转移酶，降低了生产成本。第二，由于该酵母同时还能合成赤藓糖醇，因此可以利用合成赤藓糖醇后得到的废酵母细胞转化蔗糖合成低聚果糖，节省了培养细胞的成本。
Description
本案是分案申请；原申请的申请日：2015年9月18日，申请号：2015105999543，发明名称：合成低聚果糖的专用菌株及其用于合成低聚果糖的方法。
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一株用于合成低聚果糖的解脂亚罗威酵母菌株(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368及其用于合成低聚果糖的方法。
背景技术
低聚果糖(Fructo-oligosaccharides,FOS)作为一种食品添加剂，不但能作为营养为机体提供能量，还能显著改善机体消化道的微生态，提高有益菌群的种类与数量。低聚果糖不同于蔗糖，它属于非消化性低聚糖(non-digestible oligosaccharides)，大部分只能被“定居”消化道下段的大肠中的有益菌群(如乳酸菌、双歧杆菌等)分解吸收，对维持消化道的健康水平具有显著的促进作用(Delzenne NM,Oligosaccharides:state ofart.Proceedings of the nutrition society,2003,Vol62(1):177-182.)。因此，低聚果糖也成为益生元家族中的一员。另外，低聚果糖口感好，甜度适中(约为蔗糖的50％)，还具有促进钙的吸收，调节血脂，免疫调节，抗龋齿，防止大肠肿瘤，防止骨质疏松等生理功能(Kaur N,Gupta AK,Application of inulin and oligofructose in health andnutrition.Journal of Bioscience,2002,Vol27:703-714)，在很多食品尤其是乳制品中得到广泛的应用。因此，研究开发高效的低聚果糖的合成方法就具有重要的应用价值。
在公开的文献中，制备低聚果糖的原料分别为菊粉(Inulin)或者蔗糖(Sucrose)。以菊粉酶(Inulase)水解菊粉得到的低聚果糖属于果-果系列低聚糖(所有的糖单元均为果糖，每个果糖基均以β-2→1糖苷键连接)。以果糖基转移酶(Fructosyltransferase)催化蔗糖合成的低聚果糖属于蔗果系列的低聚果糖，该酶催化蔗糖水解，并将果糖基进行分子内转移到受体蔗糖的果糖上，形成β-2→1糖苷键，其非还原端为葡萄糖基。果糖基转移酶除了能催化形成直链的低聚果糖外(以β-2→1糖苷键连接)，还能催化形成支链的低聚果糖(将果糖基转移到受体分子果糖基上的第3位羟基，形成β-3→1糖苷键)(Lim et al,Studieson production and physical properities of neo-FOS produced by co-immobilizedPenicillium citrinum and neofructosyltransferase.European Food Reasearch andTechnology,2007,Vol225:457-462.)。不论是直链还是支链的低聚果糖，其聚合度(degreeof polymerization,DP)一般是1-5个果糖基进行聚合，形成GF2，GF3，GF4，GF5与GF6。由于菊粉来源很有限，需要大量种植菊苣植物(俗称洋姜)，并从其根茎中提取菊粉，然后再采用菊粉酶进行水解，过程比较复杂。中国发明专利CN201210144883描述了一种从菊苣菊粉中提取低聚果糖的方法，该方法采用菊粉酶与微波提取技术相结合的方法，经过多步得到低聚果糖，虽然该方法具有一定的先进性，但由于菊粉来源有限，售价较高，难以与蔗糖相比。因此市售低聚果糖的原料绝大部分采用蔗糖(白砂糖)或者含有高浓度蔗糖的糖蜜，以游离的或者固定化的果糖基转移酶进行催化得到低聚果糖。
中国发明专利CN201310026429.3描述了一种以甘蔗汁为底物，采用固定化的果糖基转移酶柱进行酶转化，再经脱色浓缩得到FOS含量55％以上的低聚果糖糖浆。中国发明专利CN201310030780描述了一种以废糖蜜为原料，同样采用固定化果糖基转移酶进行酶转化得到富含低聚果糖的糖浆。中国发明专利CN200810030332则描述了一种以蔗糖为原料，采用固定化的果糖基转移酶、固定化的葡萄糖氧化酶以及固定化的过氧化氢酶来转化制备低聚果糖。中国发明专利CN201210547846公开了一种采用聚氨酯光交联树脂固定果糖基转移酶以及葡萄糖异构酶，以蔗糖为原料进行转化得到低聚果糖。与采用游离的果糖基转移酶相比，虽然采用固定化果糖基转移酶能使酶得到多次利用，然后固定化的步骤较多，还需要使用戊二醛等有机溶剂，在反复使用固定化的过程中容易污染，而且固定化的过程中存在固定化效率的问题，使得很多酶没有被固定上未得到利用。固定化柱的制备本身就增加了成本。
除了采用游离的或者固定化果糖基转移酶催化蔗糖合成低聚果糖外，还有利用完整微生物细胞或菌丝体作为含酶催化剂转化蔗糖生成低聚果糖的报道。中国发明专利201210531671描述了一种采用黑曲霉及其全细胞催化蔗糖合成低聚果糖的方法。该方法先在诱导培养基中诱导黑曲霉产酶，然后分离得到菌丝体，并用于转化蔗糖合成低聚果糖。该方法虽然不用制备纯酶，但需要先用诱导培养基培养细胞，然后去除培养液保留菌丝体细胞，并用于转化。由于来自曲霉的果糖基转移酶含有一段信号肽序列，在诱导培养细胞的过程中，会有较多的果糖基转移酶分泌到培养液中。而该方法仅用菌丝体转化，没有利用培养液中的酶，使得酶的利用效率较为低下。中国发明专利200910018453描述了一种利用黑曲霉在厌氧条件下转化蔗糖生产低聚果糖的方法。先在好氧的条件下扩大培养黑曲霉，在对数生长期将细胞转入厌氧发酵罐进行转化。但由于黑曲霉属于丝状真菌，在扩大培养的过程中菌丝体容易结成球状结构，难以达到高密度培养。而且需要逐级扩大培养，提高了发酵成本。
因此，研究开发一种即能够自我合成果糖基转移酶，又具有类似固定化酶能够重复利用，并且容易高密度培养的微生物对于提高低聚果糖的合成效率、降低生产成本具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有酶合成或细胞合成低聚果糖的不足之处，提供一株合成低聚果糖的专用菌株及其用于合成低聚果糖的方法。本发明提供的是一种能合成果糖基转移酶的解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368菌株，并用于发酵蔗糖或者细胞转化蔗糖合成低聚果糖。
本发明中使用的合成低聚果糖的酵母菌株是解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)，已经于2015年9月14日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11368。
本发明所使用的解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368菌株来源于出发菌株解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica BLC13)CGMCC NO.7326，该菌株在中国发明专利ZL201310282059.X中已经做了描述，该菌株不能同化蔗糖，不能在含蔗糖为唯一碳源的基本培养基上生长繁殖。而本发明所采用的酵母菌株解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCC NO.11368由于含有果糖基转移酶编码序列，能够同化蔗糖，能在含蔗糖为唯一碳源的基本培养基中生长，并由蔗糖合成低聚果糖。因此，本发明使用的解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368菌株不但能合成赤藓糖醇，还具备新的特征，能同化蔗糖并合成低聚果糖。这是第一次报道能够合成低聚果糖的解脂亚罗威酵母，具有发明创造性。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)，其保藏编号是CGMCC NO.11368。
第二方面，本发明涉及一种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11368在合成低聚果糖中的用途。
第三方面，本发明涉及一种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11368用于合成低聚果糖的方法，所述方法包括：
S1、将解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368菌株进行培养，培养结束后菌液分离得到解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368细胞；
S2、在所述细胞中加入蔗糖水溶液，进行转化合成低聚果糖。
优选的，在细胞中加入的蔗糖水溶液，其浓度为100～900克/升；优选为200～800克/升；更优选为500～700克/升。
优选的，采用的培养基为含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基，碳源用量为10～100克/升，培养条件为在pH值2.5～8.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌。进一步优选地，pH值为5.0～6.0。培养温度优选为28～32℃，更优选为30℃。
优选的，所述碳源为固体葡萄糖、葡萄糖母液中的一种或两种，碳源用量为10～100克/升；所述氮源为酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合，氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种，无机盐用量为0～2.5克/升。
更优选的，所述碳源用量为50～80克/升；所述氮源的用量为5～20克/升；所述无机盐用量为0.01～2克/升，更优选为0.005～2克/升。
优选的，所述培养可为高密度培养，所述高密度培养还包括如下步骤：经过多级(一级、二级甚至是三级)扩大培养，以得到更多的所述解脂亚罗威酵母细胞。其中，高密度是指在吸光度600纳米下细胞密度达到80及以上。
优选的，采用的培养基为含高浓度碳源、氮源、无机盐以及水的发酵培养基，高密度碳源用量折合葡萄糖含量为200～300克/升，发酵培养条件为在pH值3.0～7.0，温度20～35℃条件下振荡或者搅拌培养发酵。更优选pH值5.5～6.5，温度30～32℃。
优选的，采用高浓度碳源发酵培养时，菌液分离得到的上清液为含有赤藓糖醇的溶液，用于纯化分离赤藓糖醇；菌液分离得到的沉淀细胞用于转化蔗糖溶液合成低聚果糖，可选择加入葡萄糖氧化酶以及过氧化氢酶进行转化合成低聚果糖，以提高低聚果糖的纯度。
优选的，所述高浓度碳源为固体葡萄糖、葡萄糖浆、葡萄糖母液中的一种或多种，折合葡萄糖含量为200～300克/升；所述氮源为酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合，氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种，无机盐用量为0～2.5克/升。
优选的，所述高浓度碳源折合葡萄糖含量为100～400克/升，优选为200～300克/升。氮源的用量为5～25克/升，优选为5～20克/升。无机盐用量优选为0.01～2克/升。
优选的，所述转化合成低聚果糖是在温度30～70℃，pH4.0～8.0条件下进行的。优选转化温度为40～65℃；更优选为50～60℃。转化pH值优选为5.0～7.0；更优选为5.5～6.5。
优选的，所述步骤S2后还包括当转化液中低聚果糖的含量不再增加时停止转化，进行纯化精制，得到液体或者粉状低聚果糖的步骤。低聚果糖的含量不再增加是指在连续转化3小时期间，低聚果糖的含量没有显著的变化，这时可以停止转化。停止转化后，过滤得到的细胞还可以循环利用5次，按照步骤S2的条件进行转化蔗糖。转化得到的低聚果糖溶液经过浓缩，离子交换，脱色，色谱分离、干燥等工艺，可以得到低聚果糖糖浆或者低聚果糖粉。这些工艺都是本领域内常用的通识方法，一般技术人员既能掌握使用。
优选的，所述纯化精制包括：过滤分离细胞、浓缩、脱色、离子交换、纳滤或色谱分离、喷雾干燥等工序。这些工序方法均为行业内的通识方法。
本发明所用的菌株是通过以下方法构建的：
合成果糖基转移酶编码序列的表达盒，并将该表达盒转化出发菌株解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC 7326，在含蔗糖为唯一碳源的基本培养基中筛选，只有含有果糖基转移酶编码序列的酵母转化子才能利用蔗糖，并长出单菌落克隆，该单菌落克隆能转化蔗糖合成低聚果糖，即解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368。果糖基转移酶编码序列的表达盒包含如下脱氧核糖核酸元件：5’端同源臂脱氧核糖核酸序列、启动子脱氧核糖核酸序列、果糖基转移酶编码序列、终止子脱氧核糖核酸序列、3’端同源臂序列。这些脱氧核糖核酸元件按照如下顺序进行连接：5’端同源臂脱氧核糖核酸序列+启动子脱氧核糖核酸序列+果糖基转移酶编码序列+终止子脱氧核糖核酸序列+3’端同源臂序列。同源臂序列可以为来自Yarrowia lipolytica酵母自身的URA3编码序列，也可以为LEU2编码序列，也可以为核糖体18S核糖体脱氧核糖核酸编码序列，也可以为长末端重复脱氧核糖核酸序列(Zeta序列)等。启动子脱氧核糖核酸序列可以为来自Yarrowia lipolytica酵母自身的任意编码序列的启动子脱氧核糖核酸序列，比如TEF1编码序列(转录延长因子1编码序列)的启动子，也可以为hp4d启动子(杂合启动子)，也可以为GPD编码序列(3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列)启动子，也可以是1，6-二磷酸果糖裂解酶编码序列(FBA)的启动子，也可以是XPR2编码序列的启动子等。果糖基转移酶编码序列可以是来自曲霉菌的果糖基转移酶编码序列，如黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，日本曲霉(Aspergillus japonicus)等，也可以是来自酵母的果糖基转移酶编码序列，如来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或者普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pullulans)。终止子脱氧核糖核酸序列可以为来自Yarrowia lipolytica酵母自身的任何编码序列的终止子脱氧核糖核酸序列，如TEF1编码序列的终止子脱氧核糖核酸序列，也可以是XPR2编码序列的终止子脱氧核糖核酸序列等。上述启动子脱氧核糖核酸序列、果糖基转移酶编码序列、终止子脱氧核糖核酸序列在公共数据库中都已公开，如在GenBank数据库中都能查询并免费得到序列。构建该菌株使用的所有脱氧核糖核酸元件以及宿主解脂亚罗威酵母都是来自食品安全的微生物，没有引入任何非食品安全微生物的脱氧核糖核酸元件。因此得到的合成低聚果糖的菌株是属于食品微生物范围。
合成编码序列的表达盒的技术目前也是很成熟的技术。脱氧核糖核酸的连接、脱氧核糖核酸的转化、脱氧核糖核酸的酶切等分子生物学方面的技术都是本领域内常用的公开技术，一般本领域内技术人员通过有限的学习均能掌握。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1.相比现有的曲霉菌细胞培养(米曲霉、黑曲霉或其它曲霉)，本发明采用的解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368更容易进行液体深层培养发酵，更容易进行高密度培养以获得更多的细胞。
2.由于解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368本身能高效率合成果糖基转移酶，因此，无需购买酶，能有效降低合成低聚果糖的成本。
3.解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368可以被循环利用5次，转化蔗糖合成低聚果糖，而采用游离的果糖基转移酶只能被利用一次。
4.解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368还可以来自发酵赤藓糖醇后经过过滤得到的废酵母细胞，有效提高了资源的利用率。由于该菌株来自于解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica BLC13)CGMCC NO.7326，具备其合成赤藓糖醇的特性，同时又具备了合成低聚果糖的新性能。因此，可以先用其来合成赤藓糖醇，再用得到的废酵母细胞用来转化蔗糖合成低聚果糖。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368能分解蔗糖前后的HPLC分析图；其中，A为分解蔗糖前的HPLC分析，B为分解蔗糖后的HPLC分析；
图2为12.5克湿细胞转化50毫升200克/升的蔗糖水溶液结束时HPLC分析；
图3为在转化反应液中加入葡萄糖氧化酶以及过氧化氢酶后的HPLC图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
解脂亚罗威酵母属于公认安全的酵母菌株，在食品发酵领域具有重要的应用。有的能高效合成柠檬酸，有的能高效合成赤藓糖醇，有的能高效由果糖合成甘露醇。同时，该酵母也是常用的异源蛋白表达宿主，用于高效表达具有功能的酶(Nicaud et al,Proteinexpression and secretion in the yeast Yarrowia lipolytica.FEMS YeastResearch,2002,Vol2:371-379)。发明人经过研究，以合成赤藓糖醇的解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica BLC13)CGMCC No.7326为出发菌株,构建了一株能够合成果糖基转移酶的新菌株解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368，该菌株除了能合成赤藓糖醇外，还能够由蔗糖合成低聚果糖，并能够高密度培养。因此，在利用该新菌株解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368合成赤藓糖醇后，得到的废酵母泥可以再用来转化蔗糖合成低聚果糖，充分利用了酵母资源，省却了培养细胞的成本。具体应用见以下各实施例：
实施例1、解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368能分解蔗糖由于解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368来源于解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica BLC13)CGMCC NO.7326，CGMCC NO.7326不能分解蔗糖，不能在含蔗糖为唯一碳源的基本培养基上生长。而解脂亚罗威酵母CGMCC NO.11368由于含有果糖基转移酶编码序列，编码翻译的果糖基转移酶是一个双功能酶，在由蔗糖合成低聚果糖的同时能释放葡萄糖，而释放的葡萄糖能作为碳源支持其生长。因此，解脂亚罗威酵母CGMCCNO.11368能在含蔗糖为唯一碳源的基本培养基中生长。将解脂亚罗威酵母CGMCC NO.11368接种在含10克/升的蔗糖的基本液体培养基中(蔗糖：10克/升，酵母氮碱6.7克/升，pH5.5)，在30℃培养60小时，HPLC分析，发酵蔗糖全部分解为果糖为葡萄糖，同时测定细胞在600纳米的吸光值，由培养0时的0.05提高到13.6。分解蔗糖的HPLC分析图如图1所示：图1A中保留时间8.340min为蔗糖，图1B中9.448min为葡萄糖，10.265min为果糖。可见，解脂亚罗威酵母CGMCC11368能分解蔗糖，与出发菌株CGMCC7326相比，其获得了新的性能。
实施例2、转化200克/升蔗糖合成低聚果糖
按照如下步骤实施：
(1)在50毫升发酵培养基中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11368。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖20，酵母粉15，磷酸氢二铵5，硫酸镁2，pH5.5。
(2)接种后在30℃振荡培养直到葡萄糖消耗完全即停止培养。
(3)离心保留细胞，获得12.5克湿细胞。将细胞用无菌水洗涤1次，再用50毫升200克/升的蔗糖水溶液悬浮细胞，调节pH至5.5，在30℃振荡转化。
(4)每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖生成的量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化(12小时)。
(5)离心，菌液分离。此时HPLC检测蔗糖转化为低聚果糖的转化率为21％。在蔗糖浓度比较低的情况下，由蔗糖转化合成低聚果糖的转化率也比较低。HPLC检测图如图2所示，图2中保留时间7.540min为蔗果四糖，7.923min为蔗果三糖，8.473min为蔗糖，9.473min为葡萄糖，10.207为果糖。
实施例3、转化400克/升蔗糖合成低聚果糖
按照如下步骤实施：
(1)在50毫升发酵培养基中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11368。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖50，酵母粉20，磷酸氢二铵5，硫酸镁2，pH6.5。
(2)接种后在32℃振荡培养直到葡萄糖消耗完全即停止培养。
(3)离心保留细胞，获得14.5克湿细胞。将细胞用无菌水洗涤1次，再用50毫升400克/升的蔗糖水溶液悬浮细胞，调节pH至5.0，在65℃振荡转化。
(4)每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖生成的量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化(15小时)。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测蔗糖转化为低聚果糖的转化率为34％。
实施例4、转化800克/升蔗糖合成低聚果糖
(1)在50毫升发酵培养基中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11368。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖80，酵母浸膏10，玉米浆干粉10克，磷酸氢二铵5，氯化锰0.005，pH6.5。
(2)接种后在28℃振荡培养直到葡萄糖消耗完全即停止培养。
(3)离心保留细胞，获得17.5克湿细胞。将细胞用无菌水洗涤1次，再用50毫升800克/升的蔗糖水溶液悬浮细胞，调节pH至5.5，在50℃振荡转化。
(4)每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖生成的量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化(18小时)。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测蔗糖转化为低聚果糖的转化率为56.5％。
实施例5、在发酵罐中合成低聚果糖
(1)在3升发酵罐中先培养解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11368。培养基的成分为(克/升)：葡萄糖50，酵母粉5，玉米浆干粉10，磷酸氢二铵2.5，硫酸镁0.5，pH3.0。
(2)接种后在30℃搅拌培养，通气，葡萄糖消耗完后再进行补料葡萄糖，直到细胞密度达到80即停止培养(进行高密度培养)。
(3)离心保留细胞，获得345.5克湿细胞。将细胞用无菌水洗涤1次，再用2000毫升700克/升的蔗糖水溶液悬浮细胞，装入发酵罐，调节pH至5.5，在50℃搅拌转化。
(4)每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖生成的量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化(15小时)。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测蔗糖转化为低聚果糖的转化率为55.5％。
(6)离心后得到的细胞沉淀再加入2000毫升700克/升的蔗糖水溶液，悬浮细胞，装入发酵罐，调节pH至5.5，在50℃搅拌转化。每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖的合成量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化，检测分析，细胞第二次转化率为52.6％，保留约95％的酶活力。细胞依次重复使用3次。第三次的转化率为50.5％，第四次转化率为48.5％，第五次转化率为45.3％，与第一次相比降低了10％，因此从经济学角度考虑，细胞酶转化一般使用5次。
实施例6、先发酵合成赤藓糖醇，再以废酵母泥转化合成低聚果糖(1)
(1)在500毫升发酵培养基中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCCNO.11368。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖200，酵母粉5，硫酸镁2，氯化锰0.01，pH6.5。
(2)接种后在30℃，好氧振荡培养直到葡萄糖全部转化为赤藓糖醇后即停止发酵。
(3)离心，上清依次经过脱色、浓缩、离子交换、再浓缩、结晶的步骤提取赤藓糖醇，这些步骤均为本领域内常用的通识方法。得到细胞沉淀用于转化。获得55.4克湿细胞。将细胞用无菌水洗涤1次，再用400毫升600克/升的蔗糖水溶液悬浮细胞，调节pH至5.5，在55℃振荡转化。
(4)每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖生成的量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化(15小时)。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测蔗糖转化为低聚果糖的转化率为48.5％。
实施例7、先发酵合成赤藓糖醇，再以废酵母泥转化合成低聚果糖(2)
(1)在含2500毫升培养基的发酵罐中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCC NO.11368。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖250，酵母浸膏10，玉米浆5克，磷酸氢二铵5，硫酸镁2，氯化锰0.01，氯化铜0.005，pH6.5。
(2)接种后在32℃，好氧搅拌培养直到葡萄糖全部转化为赤藓糖醇后即停止发酵。
(3)离心，上清依次经过脱色、浓缩、离子交换、再浓缩、结晶的步骤提取赤藓糖醇，这些步骤均为本领域内常用的通识方法。得到细胞沉淀用于转化。获得308.5克湿细胞(酵母泥)。将细胞用无菌水洗涤1次，再用2000毫升750克/升的蔗糖水溶液悬浮细胞，调节pH至6.0，在40℃振荡转化。
(4)每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖生成的量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测蔗糖转化为低聚果糖的转化率为56.5％。
(6)离心后得到的细胞沉淀再加入2000毫升750克/升的蔗糖水溶液，悬浮细胞，装入发酵罐，调节pH至6.0，在50℃搅拌转化。每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖的合成量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化，检测分析，细胞第二次转化率为52.6％，保留95％的酶活力。细胞依次重复使用5次。第5次的转化率为46.5％。
实施例8、先发酵合成赤藓糖醇，再以废酵母泥转化合成低聚果糖(3)
(1)在含3500毫升培养基的发酵罐中接种解脂亚罗威酵母(Yarrowialipolytica)CGMCC NO.11368。发酵培养基的成分为(克/升)：葡萄糖300，酵母浸膏5，玉米浆干粉5克，柠檬酸铵5，硫酸镁1.5，氯化锰0.01，氯化铜0.005，pH7.5。
(2)接种后在35℃，好氧搅拌培养直到葡萄糖全部转化为赤藓糖醇后即停止发酵。
(3)离心，上清依次经过脱色、浓缩、离子交换、再浓缩、结晶的步骤提取赤藓糖醇，这些步骤均为本领域内常用的通识方法。得到细胞沉淀用于转化。获得512.5克湿细胞(酵母泥)。将细胞用无菌水洗涤1次，再用3500毫升800克/升的蔗糖水溶液悬浮细胞，调节pH至4.0，在70℃振荡转化。
(4)每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖生成的量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化。
(5)转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测蔗糖转化为低聚果糖的转化率为54.5％。
(6)离心后得到的细胞沉淀再加入3500毫升800克/升的蔗糖水溶液，悬浮细胞，装入发酵罐，调节pH至6.0，在60℃搅拌转化。每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖的合成量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化，检测分析，细胞第二次转化率为53.6％，保留95％以上的酶活力。细胞依次重复使用5次。第5次的转化率为46.5％。
实施例9、低葡萄糖含量低聚果糖的制备
在上述酶转化合成低聚果糖的同时，会产生大约20～25％含量的葡萄糖。为了制备较高纯度的低聚果糖，同时降低葡萄糖对果糖基转移酶的反馈抑制，需要将这些葡萄糖去除。我们在转化液里加入葡萄糖氧化酶以及过氧化氢酶，将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，减低对果糖基转移酶的反馈抑制。然后通过离子交换去除葡萄糖酸。
按照上述实施例7培养酵母细胞的方法得到酵母泥，用无菌水洗涤1次，再用2000毫升500克/升的蔗糖水溶液悬浮细胞，调节pH至6.0，加入2克葡萄糖氧化酶(10000单位/克)与1克过氧化氢酶(20000单位/克)，在45℃振荡转化。每隔3小时取样HPLC检测低聚果糖生成的量，在连续3小时期间若低聚果糖的量没有增加(或者略微减少)即停止转化。转化结束后离心，菌液分离。此时HPLC检测蔗糖转化为低聚果糖的转化率为40.5％，葡萄糖含量低于2％，与不用葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶相比，降低了90％。采用葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶处理后，HPLC分析如图3所示，图3中保留时间7.632min为蔗果四糖，7.998为蔗果三糖，8.532min为蔗糖，9.448min为葡萄糖，10.298min为果糖。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)，其保藏编号是CGMCC NO.11368。
2.一种如权利要求1所述的解脂亚罗威酵母菌株在合成低聚果糖中的用途，其特征在于，所述解脂亚罗威酵母菌株直接合成低聚果糖，或是先合成赤藓糖醇再用得到的废酵母细胞用来转化蔗糖合成低聚果糖。
3.一种如权利要求1所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚果糖的方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、将解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368菌株进行培养，培养结束后菌液分离得到解脂亚罗威酵母(Yarrowia lipolytica)CGMCC NO.11368细胞；
S2、在所述细胞中加入蔗糖水溶液，进行转化合成低聚果糖。
4.如权利要求3所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚果糖的方法，其特征在于，采用的培养基为含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基，培养条件为在pH值2.5～8.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌。
5.如权利要求4所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚果糖的方法，其特征在于，所述碳源为固体葡萄糖、葡萄糖母液中的一种或两种，碳源用量为10～100克/升；所述氮源为酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵中的一种或几种的混合，氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种，无机盐用量为0～2.5克/升。
6.如权利要求3所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚果糖的方法，其特征在于，采用的培养基为含高浓度碳源、氮源、无机盐以及水的发酵培养基，发酵培养条件为在pH值2.5～8.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌培养发酵。
7.如权利要求6所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚果糖的方法，其特征在于，所述高浓度碳源为固体葡萄糖、葡萄糖浆、葡萄糖母液中的一种或多种，折合葡萄糖含量为200～300克/升；所述氮源为酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合，氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种，无机盐用量为0～2.5克/升。
8.如权利要求3所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚果糖的方法，其特征在于，所述转化合成低聚果糖是在温度30～70℃，pH3.0～8.0条件下进行的。
9.如权利要求3所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚果糖的方法，其特征在于，所述步骤S2还包括当转化液中低聚果糖的含量不再增加时停止转化，进行纯化精制，得到液体或者粉状低聚果糖的步骤。
10.如权利要求3所述的解脂亚罗威酵母菌株用于合成低聚果糖的方法，其特征在于，所述培养采用高浓度碳源发酵培养时，菌液分离得到的上清液为含有赤藓糖醇的溶液，用于纯化分离赤藓糖醇；菌液分离得到的沉淀细胞用于转化蔗糖溶液合成低聚果糖，可选择加入葡萄糖氧化酶以及过氧化氢酶进行转化合成低聚果糖。
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