KR101214572B1 - 환상 아밀로오스의 제조방법 - Google Patents

환상 아밀로오스의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조하는 방법에 있어서, 반응 과정에서 생성되는 글루코오스를 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase) 또는 효모로 효과적으로 제거함으로써, 매우 높은 수율로 환상 아밀로오스를 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

환상 아밀로오스의 제조방법{Method for preparing cycloamylose}
본 발명은 환상 아밀로오스의 제조방법에 관한 것으로, 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조하는 방법에 있어서, 환상 아밀로오스를 고 수율로 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.
환상 아밀로오스(cycloamylose)는 천연성분 및 향기성분의 포집, 단백질의 재접힘 효과 등 식품 및 의약분야에 널리 사용되고 있는 기능성 당류이다. 환상 아밀로오스는 글루코오스 분자수 6개 내지 50개 이상이 중합된 환상 당류 등을 포함한다.
상기 환상 아밀로오스를 제조하는 종래 방법은 미생물에서 유래한 알파 글루카노트랜스퍼라제를 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 처리하여 제조하는 것이었다. 그러나 상기 방법으로 제조하는 경우 수율이 현저히 저조한 문제점이 있었다. 구체적으로 그 원인을 분석해 보면, 글루카노트랜스퍼라제를 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 처리하는 경우, 반응 과정에서 글루코오스가 생성된다. 상기 생성된 글루코오스가 당전이 및 분배반응에서 수용체로 작용하여 짧은 사슬이 생성되는데, 상기와 같이 짧은 길이의 선형 아밀로오스로는 환상 아밀로오스를 제조할 수 없기 때문이다.
따라서, 상기 당전이 및 분배반응에서 생성된 글루코오스를 효과적으로 제거하여 고 수율로 환상 아밀로오스를 제조하는 방법이 절실히 요구된다.
이에 본 발명자들은 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조하는 방법에 있어서, 반응과정에서 생성된 글루코오스를 효과적으로 제거하여 고 수율로 환상 아밀로오스를 제조하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조하는 방법에 있어서, 상기 반응 시 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase) 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 첨가하여 반응 과정에서 생성된 글루코오스를 제거하는 단계를 포함하는 환상 아밀로오스의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조하는 방법에 있어서, 상기 반응 시 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase) 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 첨가하여 반응 과정에서 생성된 글루코오스를 제거하는 단계를 포함하는 환상 아밀로오스의 제조 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 환상 아밀로오스 제조 방법은 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조하는 방법에 있어서, 상기 반응시 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase) 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 첨가하여 반응 과정에서 생성된 글루코오스를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 환상 아밀로오스를 제조하는데 사용될 수 있는 기질은 선형 아밀로오스가 함유된 것이라면 제한 없이 선택하여 사용될 수 있으며, 상기 선형 아밀로오스는 이에 한정되지 않지만 전분에 탈분지 효소(debranching enzyme)를 첨가하여 제조될 수 있다.
따라서 본 발명에서 전분 자체를 기질로 사용하는 경우 탈분지 효소를 먼저 처리하여 선형 아밀로오스가 함유된 기질을 제조하고 이로부터 환상 아밀로오스를 제조할 수 있다.
상기 전분은 당업계에서 환상 아밀로오스를 제조하기 위해 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 예를 들어, 녹두 전분, 도토리 전분, 동부 전분, 메일 전분, 옥수수 전분 및 고구마 전분으로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 변성 전분, 예를 들어, 호화 전분을 사용할 수도 있다.
상기 전분을 기질로 이용하는 경우, 선형 아밀로오스를 제조하기 위하여 사용될 수 있는 탈분지 효소는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 슈도모나스 아밀로데라모사(Pseudomonas amyloderamosa)에서 유래된 이소아밀라아제(isoamylase,)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 이소아밀라아제는 효소 번호(EC number) EC 3.2.1.68 일 수 있다. 상기 탈분지 효소의 적정 pH, 첨가량, 반응 온도 및 반응 시간은 당업자가 효소의 특성을 고려하여 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기 슈도모나스 아밀로데라모사에서 유래된 이소아밀라아제를 사용하는 경우, pH 4.0 내지 5.0 에서, 기질 대비 100 U/g 내지 500 U/g로 첨가하여 50 내지 60℃에서 30 내지 60시간 동안 전분에 반응시켜 선형 아밀로오스를 제조할 수 있다.
상기 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조할 수 있다. 상기 글루카노트랜스퍼라제는, 당업계에서 환상 아밀로오스를 제조하는데 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 당업계에서 환상 아밀로오스를 제조하는데 상용되는 써무스 스코토덕투스(Thermus scotoductus)에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제를 사용할 수 있으며, E. coli에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제를 직접 제조하여 사용할 수도 있다. 상기 알파-글루카노트랜스퍼라제는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 효소 번호 EC 2.4.1.25일 수 있다.
상기 글루카노트렌스퍼라제의 적정 pH, 첨가량, 반응 온도 및 반응 시간은 당업자가 효소의 특성을 고려하여 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 써무스 스코토덕투스(Thermus scotoductus)에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제를 사용하는 경우 pH 6.5 내지 8.5에서 기질 대비 10 U/g 내지 30 U/g로 첨가하여 50 내지 60℃에서 8 시간 내지 24 시간 동안 상기 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조할 수 있으며,
E. coli에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제(MalQ)를 사용하는 경우 pH 6.5 내지 8.5 에서 기질 대비 10 U/g 내지 30 U/g로 첨가하여 30 내지 50℃에서 6 시간 내지 18 시간 동안 상기 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조할 수 있다.
상기 글루카노트랜스퍼라제는 보다 바람직하게는 반응과정에서 생성되는 글루코오스를 제거하기 위해 사용되는 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase) 및 효모의 특성(적정 pH, 온도)을 고려하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) 에서 유래된 글루코오스 옥시다아제, 바람직하게는 효소번호 EC 1.1.3.4인 글루코오스 옥시다아제를 사용하는 경우, 상기 글루카노트랜스퍼라제로 써무스 스코토덕투스(Thermus scotoductus)에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제를 사용하는 것이 바람직하며, 사카로미세스 세레비시아 변종 엘립소이더스(Saccharomyces cerevisiae var . ellipsoideus) 효모를 사용하는 경우, E. coli에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제(MalQ 효소)를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 E. coli에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제(MalQ 효소)는 당업계에 공지된 PCR 및 형질전환 방법을 이용하여 제조될 수 있다.(<실시예 2-2> 참조)
본 발명에서 상기와 같이 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조함에 있어서, 반응과정에서 생성된 글루코오스를 효과적으로 제거하기 위해, 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase) 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 사용한 것을 중요한 특징으로 한다.
상기 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase) 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 첨가하는 방법은, 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 가하는 것과 동시에 첨가하는 방법, 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 가한 후 첨가하는 방법일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 글루코오스 옥시다아제는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 아스퍼질러스 나이거에서 유래된 글루코오스 옥시다아제, 보다 바람직하게는 효소번호 EC 1.1.3.4인 글루코오스 옥시다아제를 사용할 수 있으며, 상기 글루코오스 옥시다아제를 첨가하여 글루코오스를 제거하는 것은, 글루코오스 옥시다아제의 유래를 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있으나 바람직하게는 글루코오스 옥시다아제를 pH 6.5 내지 8.5 에서 기질 대비 100 U/g 내지 150 U/g로 첨가하여 50 내지 60℃에서 8 시간 내지 24 시간 동안 반응시켜 수행될 수 있다.
또한 상기 효모는 글루코오스를 분해할 수 있는 활성이 있는 것이라면 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 보다 바람직하게는 사카로미세스 세레비시아 변종 엘립소이더스(Saccharomyces cerevisiae var . ellipsoideus)일 수 있다.
상기 효모를 첨가하여 글루코오스를 제거하는 것은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 효모를 pH 6.5 내지 8.5 에서 전체 용액 부피 대비 0.1 g/ml 내지 2.5 g/ml로 첨가하여 25 내지 50 ℃에서 6 시간 내지 18 시간 동안 반응시켜 수행될 수 있다.
상기 효모는 사용된 후 효과적으로 제거하기 위하여 바람직하게는 효모를 고정화시켜 사용할 수 있다. 상기 효모의 고정화는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 알긴산 염 (sodium alginate)을 사용할 수 있다.
상기 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase) 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 사용하여 글루코오스를 효과적으로 제거한 후, 생성된 환상 아밀로오스를 분리하고 정제하기 위해, 베타-아밀라아제(β-amylase)를 처리하여 반응하지 않은 선형 아밀로오스를 제거하는 단계 및 크로마토그래피를 이용하여 생성된 환상 아밀로오스를 분리 및 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 베타-아밀라아제는 선형 아밀로오스가 함유된 기질과 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)의 반응에 참여하지 않고 잔존하는 선형 아밀로오스를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
상기 베타-아밀라아제는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 보리 유래의 베타-아밀라아제, 바람직하게는 효소번호가 EC 3.2.1.2인 베타-아밀라아제를 사용할 수 있으며 pH 7.0 내지 8.0 에서 기질 대비 10 U/g 내지 100 U/g로 첨가하여 30 내지 40℃에서 1 내지 6시간 동안 사용될 수 있다.
또한 본 발명에서 생성된 환상 아밀로오스를 분리 및 정제를 위해 이에 한정되지 않지만 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
상기 크로마토그래피는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 소수성 컬럼크로마토그래피 또는 음이온 교환크로마토그래피를 선택하거나 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 환상 아밀로오스 제조 방법은 초기 전분 사용중량 기준으로 종래 방법에 의한 환상 아밀로오스의 수율(10 중량% 이하)을 획기적으로 개선하여 17 내지 30 중량%의 수율로 환상 아밀로오스를 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 제조 방법에 의해 생성된 환상 아밀로오스의 중합도 (degree of polymerization) 는 6 내지 50, 바람직하게는 24 내지 50, 보다 바람직하게는 23 내지 36일 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 글루카노트랜스퍼라제를 처리하는 경우 생성되는 글루코오스를 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase) 또는 효모로 효과적으로 제거함으로써, 매우 높은 수율로 환상 아밀로오스를 제조할 수 있다.
도 1은 글루코오스 옥시다아제를 사용하여 환상 아밀로오스를 제조한 다음, 생성된 환상 아밀로오스를 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이다.
도 2는 글루코오스 옥시다아제를 사용하지 않고 환상 아밀로오스를 제조한 다음, 생성된 환상 아밀로오스를 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이다.
도 3은 E. coli K12에서 유래된 MalQ 효소의 전기영동 사진이다.
도 4는 효모를 사용하여 환상 아밀로오스를 제조한 다음, 생성된 환상 아밀로오스를 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이다.
도 5는 효모를 사용하여 환상 아밀로오스를 제조한 다음, 생성된 환상 아밀로오스를 MALDI-TOF/MS를 이용하여 분석한 결과이다.
도 6은 효모를 사용하지 않고 환상 아밀로오스를 제조한 다음, 생성된 환상 아밀로오스를 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명에 의한 환상 아밀로오스 제조 원리를 종래 방법과 비교한 개략도이다.
도 8은 pET29b 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
글루코오스 옥시다아제에 의한 환상 아밀로오스의 제조
<1-1> 효소 반응
1%(w/v) 찰옥수수 전분용액 1000 ul에 탈분지 효소인 슈도모나스 아밀로데라모사(Pseudomonas amyloderamosa)에서 분리된 이소아밀라아제(isoamylase, EC 3.21.68)를 기질 대비 360 U/g으로 넣고 이를 50mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 혼합한 후 55℃에서 48시간 반응시켰다.
상기 반응 후 트리스-염산 완충용액(Tris-HCl)을 가하여 pH 7.5로 조절한 다음, 써무스 스코토덕투스(Thermus scotoductus)에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제(α-Glucanotransferase, 20 U/g, EC 2.4.1.25) 및 글루코오스 옥시다아제(Glucose oxidase, 125 U/g, EC 1.1.3.4)을 가하고 55℃에서 16시간 반응시켰다.
상기 반응 후, 베타-아밀라아제(β-amylase, 30 U/g, EC 3.2.1.2)를 가하고 pH 7.5, 30℃에서 3시간 반응시켜 환상 아밀로오스가 함유된 용액을 제조하였다.
<1-2> 분리 및 정제
상기 <실시예 1-1>의 효소 반응 후, 소수성 칼럼크로마토그래피를 이용하여 환상 아밀로오스가 함유된 용액으로부터 환상 아밀로오스를 분리 및 정제하였다. 구체적으로 먼저 C18 카트리지(Waters, 미국)를 100% 메탄올로 2배의 칼럼 부피 이상으로 씻어준 후, 증류수를 2배의 칼럼 부피 이상으로 흘려주어 안정화시켰다. 레진 1 ml 당 5 mg 이하의 고형분이 흡착될 수 있도록 상기 제조된 환상 아밀로오스가 함유된 용액을 흘려 주었다. 이 후 2배의 칼럼 부피 증류수로 칼럼을 씻어 주어 친수성 선형 말토올리고당을 제거하였다. 30 % 메탄올을 2배 칼럼 부피로 흘려주어 C18 카트리지로부터 환상 아밀로오스를 용리시켜 수집하였다. 상기 수집된 환상 아밀로오스(액상)는 감압회전농축기(BUCHI, Rotavapor 011)를 이용하여 메탄올을 제거하고 동결 건조하였다.
상기 동결 건조 후, 환상 아밀로오스의 중량을 측정하여 수율을 계산한 결과, 찰옥수수 전분 중량 기준으로 28 중량%로 파악되었다.
<1-3> 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 분석
상기 <실시예 1-2>에서 수집된 환상 아밀로오스(액상)를 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.
상기 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 분석은 Dionex사(미국)의 GP 40 그래디언트 펌프, ED 40 전기화학적 검출기 및 카보팩-칼럼(Carbo Pac PA1)을 이용하여 수행하였으며, 상기 <실시예 1-2>에서 수집된 환상 아밀로오스(액상)를 초순수로 100배 희석하여 0.45 um박막 여과지로 여과하여 20 ul를 주입하고 유속을 1 ml/분으로 설정하였다.
또한 A 용매로는 150 mM의 가성 소다액을 사용하였으며, A 용매에 600 mM 소듐아세테이트를 녹인 것을 B 용매로 하여, 40분 후에 B 용매가 40분 동안에 0에서 40%가 되도록 직선적으로 농도 구배를 걸어주었으며 이에 따른 결과를 도 1에 기재하였다.
< 비교예 1>
글루코오스 옥시다아제를 무첨가한 경우의 환상 아밀로오스 제조
<1-1> 효소 반응
상기 <실시예 1>의 비교예로 글루코오스 옥시다아제를 무첨가하여 환상 아밀로오스를 제조하였다. 구체적으로 상기 <실시예 1>에서 글루코오스 옥시다아제를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 동일한 조건에서 실험하여 환상 아밀로오스가 함유된 용액을 제조하였다.
<1-2> 분리 및 정제 후 수율 비교
상기 <비교예 1-1>에서 효소 반응이 완료된 환상 아밀로오스가 함유된 용액을 상기 <실시예 1-2>와 동일한 방법으로 분리 및 정제하여 환상 아밀로오스의 수율을 측정하였다.
상기 수율 측정결과, 찰옥수수 전분 중량 기준으로 9.8 중량%로 파악되었다.
따라서, 상기 <실시예 1>과 같이 글루코오스 옥시다아제를 첨가함으로써 환상 아밀로오스의 수율을 획기적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
<1-3> 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 분석에 따른 성분 비교
상기 <비교예 1-2>에서 수집된 환상 아밀로오스를 상기 <실시예 1-3>과 동일한 방법으로 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 2에 기재하였다.
상기 도 1 및 도 2를 비교하면, 상기 <실시예 1>과 같이 글루코오스 옥시다아제를 첨가함으로써 환상 아밀로오스가 다량 생산되었음을 알 수 있다.
< 실시예 2>
효모를 이용한 환상 아밀로오스의 제조
<2-1> 고정화 효모의 제조
본 실시예에서는 고정화 효모를 이용하여 환상 아밀로오스를 제조하였다. 상기 고정화 효모를 제조하기 위하여 균주로 Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus(제조사: science stuff, 카테고리 번호: BLF 1008)를 이용하였다.
구체적으로 상기 균주를 YPD 배지(1L; yeast extract 1%, polypeptone 2%, dextrose 2%)에 18시간 배양한 후 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 이를 0.85% 멸균 생리식염수로 3번 이상 씻어 준 후 4℃에 보관하였다. 3% 알긴산소다(Na-alginate, 100 ml)에 상기 보관된 균을 균일하게 풀어준 후, 주사바늘 등을 이용하여 0.5M 염화칼슘(calcium chloride, 1L) 용액에 지름 3 mm 이하의 균일한 크기로 떨어뜨려 주었다. 상기와 같이 제조된 고정화 효모는 생리적 식염수를 이용하여 3번 이상 씻어준 후 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.
<2-2> E. coli 에서 유래된 알파- 글루카노트랜스퍼라제의 제조
E. coli K12 genomic DNA를 분리한 후 이를 기질로 사용하고 서열번호1의 forward (5’-AAC CGC ACT CTC GAG CTT CTT CGC TGC AGC-3’, XhoI site 밑줄),　서열번호 2의 reverse (5’-AAA CGC TAA GGA AGC CAT ATG GAA AGC-3’, NdeI site 밑줄) 프라이머를 이용하여 PCR 반응(95℃, 5분, 1회 수행 후, 55℃, 30초 75℃, 2분, 95℃ 30초를 30회 반복)을 수행함으로써 malQ 유전자 (accession no: ECK3403)를 증폭하였다.
상기 PCR 산물을 PCR 정제키트(Intron 제품, 한국)를 이용하여 정제하고 두 종류의 제한효소(XhoI과 NdeI)를 처리하고 이를 동일한 제한효소가 처리된 도 8로 표시되는 개열지도를 가진 pET29b 벡터(Novagen사, 미국)에 삽입하였다.
상기 벡터로 E. coli MC4100에 형질전환하고 항생제(kanamycin 20 ug/ml)를 함유한 고체배지에 도말하여 15시간 배양 후 생성된 콜로니를 5 ml LB 배지 (kanamycin 20 ug/ml 함유)에 접종하여 배양한 균체에서 플라스미드를 분리하였다. 상기 분리한 재조합 플라스미드 내 malQ 유전자는 시퀀싱을 수행하여 DNA서열에 문제가 없음을 최종 확인하였고 이를 pET29b-malQ[His]로 명명하였다.
E. coli에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제(MalQ 효소)의 발현을 위하여 상기 재조합 플라스미드 pET29b-malQ[His]를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 시킨 후 항생제(kanamycin 20 ug/ml)를 함유한 5ml LB 배지에 접종하고 15 시간 배양 후 200 ml LB 배지에 1% (v/v) 접종하여 본 배양을 수행하였다. 상기 배양 개시 후 2시간 이후부터 배양액의 탁도를 600 nm에서 측정하고 탁도가 0.6 값이 되었을 때 0.2 mM IPTG(IsopropyI β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 발현을 유도하였다. 이 후 6 시간을 더 배양한 후 원심 분리하여 균체를 회수한 후 세포를 파쇄하고 상등액을 분리하였다. 이후 친화도 크로마토그래피(Ni-NTA affinity chromatography)를 수행하여 MalQ 효소를 정제하였고 그 정제도는 SDS-PAGE를 수행하여 확인하고 그 결과를 도 3에 기재하였다.
<2-3> 효소 및 고정화 효모 반응
50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 1% (w/v) 찰옥수수 전분용액 1000 ul에 탈분지 효소인 이소아밀라아제(EC 3.2.1.68)를 기질 대비 360 U/g을 넣고 55℃에서 48시간 반응시켰다.
상기 반응 후 트리스-염산 완충용액을 가하여 pH 7.5로 조절한 다음, 상기 <실시예 2-2>에서 제조된 E. coli에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제(MalQ, EC 2.4.1.25)를 20 U/g으로 가하고 상기 <실시예 2-1>에서 제조된 고정화 효모를 전체 용액 대비 0.5 g/ml로 가하여 교반한 다음, 37℃에서 12 시간 반응시켰다.
상기 반응 후, 베타-아밀라아제(β-amylase, EC 3.2.1.2, 40 U/g)를 가하고 pH 7.5, 30℃에서 3시간 반응시켜 환상 아밀로오스가 함유된 용액을 제조하였다.
<2-4> 분리 및 정제
상기 <실시예 2-3>의 효소 반응 후, 상기 <실시예 1-2>와 동일한 방법으로소수성 칼럼크로마토그래피를 이용하여 환상 아밀로오스가 함유된 용액으로부터 환상 아밀로오스를 분리 및 정제하였다.
상기 분리 정제 후, 환상 아밀로오스의 중량을 측정하여 수율을 계산한 결과, 찰옥수수 전분 중량 기준으로 28 중량%로 파악되었다.
<2-5> 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 분석
상기 <실시예 2-4>에서 수집된 환상 아밀로오스를 상기 <실시예 1-3>과 동일한 방법으로 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 4에 기재하였다.
<2-6> MALDI - TOF / MS 분석
상기 <실시예 2-4>에서 수집된 환상 아밀로오스를 MALDI-TOF/MS를 이용하여 분석하였다. 구체적으로 시스템은 Voyager TM-DE Perceptive Biosystem(미국)를 사용하였고, DHB/methanol을 사용하였으며 그 결과를 도 5에 기재하였다.
상기 도 5에 기재된 바와 같이, 본 발명에서와 같이 고정화 효모를 이용함으로써 중합도가 6 내지 50, 바람직하게는 24 내지 50, 보다 바람직하게는 23 내지 36의 환상 아밀로오스가 생성됨을 알 수 있다.
< 비교예 2>
효모 무첨가한 경우의 환상 아밀로오스 제조
<2-1> 효소 반응
상기 <실시예 2>의 비교예로 고정화 효모를 무첨가하여 환상 아밀로오스를 제조하였다. 구체적으로 상기 <실시예 2>에서 고정화 효모를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 동일한 조건에서 실험하여 환상 아밀로오스가 함유된 용액을 제조하였다.
<2-2> 분리 및 정제 후 수율 비교
상기 <비교예 2-1>에서 효소 반응이 완료된 환상 아밀로오스가 함유된 용액을 상기 <실시예 1-2>와 동일한 방법으로 분리 및 정제하여 환상 아밀로오스의 수율을 측정하였다.
상기 수율 측정결과, 찰옥수수 전분 중량 기준으로 9.8 중량%로 파악되었다.
따라서, 상기 <실시예 2>과 같이 고정화 효모를 첨가함으로써 환상 아밀로오스의 수율을 획기적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
<2-3> 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 성분 비교
상기 <비교예 2-2>에서 수집된 환상 아밀로오스를 상기 <실시예 1-3>과 동일한 방법으로 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 6에 기재하였다.
상기 도 4 및 도 6을 비교하면, 상기 <실시예 2>와 같이 고정화 효모를 첨가함으로써 환상 아밀로오스가 다량 생산될 수 있음을 알 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

  1. 선형 아밀로오스가 함유된 기질에 효소 번호 EC 2.4.1.25로 분류되는 글루카노트랜스퍼라제(glucanotransferase)를 반응시켜 환상 아밀로오스를 제조하는 방법에 있어서,
    상기 반응 시 (i) 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase)를 첨가하거나, 또는 (ii) 글루코오스 옥시다아제 및 효모를 첨가하여 반응 과정에서 생성된 글루코오스를 제거하는 단계를 포함하는 환상 아밀로오스의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기질은 전분에 탈분지 효소를 첨가하여 제조된 것인 환상 아밀로오스의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 탈분지 효소는 슈도모나스 아밀로데라모사(Pseudomonas amyloderamosa)에서 유래된 이소아밀라아제(isoamylase)인 환상 아밀로오스의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글루카노트랜스퍼라제는 써무스 스코토덕투스(Thermus scotoductus)에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제 및 E. coli에서 유래된 알파-글루카노트랜스퍼라제로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상인 것인 환상 아밀로오스의 제조 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 글루코오스 옥시다아제는 아스퍼질러스 나이거에서 유래된 것인 환상 아밀로오스의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 글루코오스 옥시다아제는 효소 번호 EC 1.1.3.4로 분류되는 것인 환상 아밀로오스의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 글루코오스 옥시다아제를 첨가하여 글루코오스를 제거하는 것은 글루코오스 옥시다아제를 pH 6.5 내지 8.5 에서 기질 대비 100 U/g 내지 150 U/g로 첨가하여 50 내지 60℃에서 8 내지 24시간 동안 반응시켜 수행되는 것인 환상 아밀로오스의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 효모는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)인 환상 아밀로오스의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 글루코오스 옥시다아제 및 효모를 첨가하여 글루코오스를 제거하는 것은, 효모를 pH 6.5 내지 8.5에서 전체 용액 대비 0.1 g/ml 내지 2.5 g/ml로 첨가하여 25 내지 50℃에서 6 내지 18시간 동안 반응시켜 수행되는 것인 환상 아밀로오스의 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코오스를 제거한 후,
    베타-아밀라아제(β-amylase)를 처리하여 반응하지 않은 선형 아밀로오스를 제거하는 단계 및
    크로마토그래피를 이용하여 생성된 환상 아밀로오스를 분리 및 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 환상 아밀로오스의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 환상 아밀로오스는 중합도 6 내지 50인 환상 아밀로오스의 제조 방법.
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