CN102590324A - 检测维生素c工业混菌传代不同代数蛋白质变化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测维生素C工业混菌传代不同代数蛋白质变化的方法，包括如下步骤：(1)混菌传代培养；(2)细胞内蛋白质的测定；(3)聚类分析；(4)过程分析，利用本发明的方法可以从揭示混菌传代培养对巨大芽孢杆菌以及氧化葡糖杆菌细胞内蛋白变化产生的影响，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解混菌发酵过程的内在机理提供依据，从而进一步优化发酵过程，提高维生素C产量。

Description

检测维生素C工业混菌传代不同代数蛋白质变化的方法

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种检测维生素C工业混菌传代培养不同代数的细胞内蛋白质变化的方法。

背景技术

目前，我国生产维生素C的方法为“二步发酵法”，第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌混合发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸。通过混菌传代培养，混菌发酵生产2-酮-L-古龙酸的能力有提高，其作用机理尚不明确，对氧化葡糖杆菌进行分子改造尚不能提供有利信息。

蛋白质是构成细胞的重要组成部分，对细胞内蛋白质结构和功能的研究将直接阐明细胞在不同生长条件下的变化机制。一方面可以对其上游的基因组学信息进行验证，提供后续基因改造的依据，另一方面又可以对其下游的代谢物研究提供指导。蛋白组学的发展，主要依托高效的蛋白分离和鉴定技术，主要有二维凝胶电泳和液相色谱分离两种分离方法，其中，液相色谱分离然后经质谱鉴定蛋白质，具有高度自动化，高分辨率的优势，是目前蛋白组学发展的主流。基于液相色谱分离，Q-TOF鉴定蛋白技术的使用，可以从整体水平上检测细胞在发酵过程中各种结构蛋白以及功能蛋白的变化水平。

发明内容

本发明的目的是通过高通量的蛋白组学的手段来了解混菌传代培养不同时期，巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌各自细胞内蛋白质变化规律，进一步揭示传代培养对巨大芽孢杆菌以及氧化葡糖杆菌产生的影响，为揭示传代培养促进氧化葡糖杆菌生长及2-酮-L-古龙酸生产的作用机制提供有利信息，从而提高其生长及生产能力，提供一种检测维生素C工业混菌传代不同代数蛋白质变化的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种检测维生素C工业混菌传代不同代数蛋白质变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的10-200μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-200μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48小时；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养24h-48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，以24h-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天，选定3-4个取样时间取3-4个样；

③分纯：

将步骤(1)②获得的3-4个样的混菌细胞划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24h-48h；再分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中；

④不同进化时期巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌培养：

将步骤(1)③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养10-15h；

(2)细胞内蛋白质的测定：

①细胞收集及淬灭：

分别将步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养物和氧化葡糖杆菌培养物，在4℃下，以4000～6000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞；

②提取细胞内蛋白：

取所述破碎细胞，每份80～100mg分别置于离心管中，每管加入0.5～1mL细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20～50s；加入5～15μL质量比为2～4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10～30min；加入5～15μL 80～120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1～3h；15000rpm离心25～40min；取上清，得到蛋白溶液；

所述细胞裂解液为：8mol·L^-1尿素，质量浓度为4％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤(2)②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取含50～100μg蛋白的步骤(2)②获得的各个蛋白溶液，每份加入4～6倍体积的-20℃～-40℃的丙酮，在-20℃～-40℃的条件下放置12～20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃～-40℃的体积浓度为70％-85％的丙酮水溶液洗涤；干燥得到蛋白干粉；

⑤蛋白还原以及酶解

分别向各个蛋白干粉中，添加20～40μL 40～60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；再加入1～4μL三(2-羧乙基)膦，在50～60℃还原反应1-1.5h，再加入1～2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10～15min，终止还原反应；再加入20～30μL浓度为0.2～0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液，37℃蛋白酶解12～18小时，得酶解液；

⑥蛋白标记

向步骤(2)⑤获得的各个酶解液中分别加入一管用60～80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1-1.5h；

⑦溶液混合

将步骤(2)⑥标记后的各个来自巨大芽孢杆菌的蛋白溶液混合；将步骤(2)⑥标记后的各个来自氧化葡糖杆菌的蛋白溶液混合；于-40℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将(2)⑦中得到的两组混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(3)聚类分析：

采用Expander4.0对步骤(2)⑧中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(4)过程分析

将步骤(3)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现混菌进化培养在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。

利用本发明的方法可以从揭示混菌传代培养对巨大芽孢杆菌以及氧化葡糖杆菌细胞内蛋白变化产生的影响，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解混菌发酵过程的内在机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量提供理论基础。同时也为工业混菌发酵过程的研究提供新的思路和方法。

附图说明

图1为传代培养0、50、100、150代的氧化葡糖杆菌蛋白聚类分析；

图2为传代培养0、50、100、150代的氧化葡糖杆菌细胞内山梨糖/山梨酮脱氢酶相对表达量；

图3为传代培养0、50、100、150代的巨大芽孢杆菌蛋白聚类分析；

图4为传代培养0、50、100、150代的巨大芽孢杆菌聚类分析中类别2。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

一种检测维生素C工业混菌传代不同代数蛋白质变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的20μL保藏于体积浓度为15％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和20μL保藏于体积浓度为15％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28℃，培养24小时；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28℃，200r/min摇床振荡培养24h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，在28℃，200r/min摇床振荡培养，以24h为传代周期，以体积比为1％为传代比接入新的种子培养基中，传代150天，选定4个取样时间取4个样，分别为0天、50天、100天、150天；

③分纯：

将步骤(1)②获得的4个样的混菌细胞划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28℃培养24h；再分别转入种子培养基，在28℃，200rpm摇床振荡培养24h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15％的甘油水溶液中；

④不同进化时期巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌培养：

将步骤(1)③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，在28℃，200r/min摇床振荡培养10h；

(2)细胞内蛋白质的测定：

①细胞收集及淬灭：

分别将步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养物和氧化葡糖杆菌培养物，在4℃下，以4000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞；

②提取细胞内蛋白：

取所述破碎细胞，每份80mg分别置于离心管中，每管加入0.5mL细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20s；加入5μL质量比为2∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10min；加入5μL 80mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1h；15000rpm离心25min；取上清，得到蛋白溶液；

所述细胞裂解液为：8mol·L^-1尿素，质量浓度为4％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤(2)②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取含50μg蛋白的步骤(2)②获得的各个蛋白溶液，每份加入4倍体积的-20℃的丙酮，在-20℃的条件下放置12h；离心，弃上清，沉淀用-20℃的体积浓度为70％的丙酮水溶液洗涤；干燥得到蛋白干粉；

⑤蛋白还原以及酶解

分别向各个蛋白干粉中，添加20μL 40mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；再加入1μL三(2-羧乙基)膦，在50℃还原反应1h，再加入1μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10min，终止还原反应；再加入20μL浓度为0.2μg/μL的胰蛋白酶水溶液，37℃蛋白酶解12小时，得酶解液；

⑥蛋白标记

向步骤(2)⑤获得的各个酶解液中分别加入一管用60μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；

⑦溶液混合

将步骤(2)⑥标记后的各个来自巨大芽孢杆菌的蛋白溶液混合；将步骤(2)⑥标记后的各个来自氧化葡糖杆菌的蛋白溶液混合；于-40℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将(2)⑦中得到的两组混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(3)聚类分析：

采用Expander4.0对步骤(2)⑧中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(4)过程分析

将步骤(3)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现混菌进化培养在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。

在混菌传代培养过程，氧化葡糖杆菌产生了多种进化方向，表现为细胞内蛋白在不同代数呈现不同表达规律，见图1。通过聚类分析，发现它们的表达量变化可以分为6类，其中，类别1、类别3以及类别5表现为各代蛋白表达变化不大；类别2与类别4表现为进化后蛋白表达有不同程度提高，其中包括负责转化山梨糖为2-酮-L-古龙酸的山梨糖/山梨酮脱氢酶。此酶在各代的表达情况如图2所示，在50代有轻微的表达下调，在100代和150代有逐渐提高的表达量。此现象的原因，可能为50代时，混菌之间发生剧烈的相互作用，进行适应性选择，随着相互配合作用的增强，氧化葡糖杆菌越来越适应混菌环境，具有了更强的生产能力。

同时，对不同传代时期的巨大芽孢杆菌进行聚类分析，结果如图3所示。类别1中131种蛋白表达量无明显变化；类别2中9种蛋白表达量随着传代数增加呈现上调趋势；类别3中88种蛋白表达量随着传代数增加有微弱上调趋势；类别4中25种蛋白在50代有轻度下调，而后在100代、150代轻度上调。此四类中，变化最明显的为类别2，具体蛋白表达情况，如图4所示。在类别2的9个蛋白中，4个与immune inhibitor A(immune inhibitor A；immune inhibitor Ametalloprotease；immune inhibitor A precursor；peptide M6 immune inhibitor A)有关，一个与寡肽转运有关(oligopeptide bingding protein oppA)，此外还有抵抗活性氧的过氧化物歧化酶(superoxide dismutase，Mn)。Immune inhibitor A为芽孢杆菌中降解抗菌肽的蛋白，对芽孢杆菌抵抗外部免疫系统有重要作用，此外，它还是芽孢杆菌孢外壁的重要组成部分。其表达量随传代培养代数增加，呈现上调，表明巨大芽孢杆菌芽孢的抗逆性有了提高。同时，转运寡肽能力也有所提高，利于自身的生长需要。

综上所述，混菌传代培养对氧化葡糖杆菌以及巨大芽孢杆菌均产生了利于双方生长的影响，表现为氧化葡糖杆菌生产能力的提高，以及巨大芽孢杆菌抗逆性的提高。这一发现，为后续对氧化葡糖杆菌进行基因改造提供了依据，也为工业混菌过程研究及控制提供了基础。

实施例2

一种检测维生素C工业混菌传代不同代数蛋白质变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的10μL保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10μL保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，30℃，培养36小时；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在30℃，250r/min摇床振荡培养36h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁹CFU/mL，在30℃，250r/min摇床振荡培养，以36h为传代周期，以体积比为5％为传代比接入新的种子培养基中，传代100天，选定3个取样时间取3个样，分别为0天、50天、100天；

③分纯：

将步骤(1)②获得的3个样的混菌细胞划线分纯，再分别接种于固体培养基上，30℃培养36h；再分别转入种子培养基，在30℃，250rpm摇床振荡培养36h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中；

④不同进化时期巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌培养：

将步骤(1)③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁸CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁹CFU/mL，在30℃，250r/min摇床振荡培养12h；

(2)细胞内蛋白质的测定：

①细胞收集及淬灭：

分别将步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养物和氧化葡糖杆菌培养物，在4℃下，以5000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.3的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞；

②提取细胞内蛋白：

取所述破碎细胞，每份90mg分别置于离心管中，每管加入0.8mL细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎40s；加入10μL质量比为3∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应20min；加入10μL 100mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置2h；15000rpm离心30min；取上清，得到蛋白溶液；

所述细胞裂解液为：8mol·L^-1尿素，质量浓度为4％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤(2)②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取含80μg蛋白的步骤(2)②获得的各个蛋白溶液，每份加入5倍体积的-40℃的丙酮，在-40℃的条件下放置15h；离心，弃上清，沉淀用-40℃的体积浓度为80％的丙酮水溶液洗涤；干燥得到蛋白干粉；

⑤蛋白还原以及酶解

分别向各个蛋白干粉中，添加20μL 50mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；再加入2μL三(2-羧乙基)膦，在55℃还原反应1.2h，再加入1μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10min，终止还原反应；再加入25μL浓度为0.25μg/μL的胰蛋白酶水溶液，37℃蛋白酶解16小时，得酶解液；

⑥蛋白标记

向步骤(2)⑤获得的各个酶解液中分别加入一管用70μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1.2h；

⑦溶液混合

将步骤(2)⑥标记后的各个来自巨大芽孢杆菌的蛋白溶液混合；将步骤(2)⑥标记后的各个来自氧化葡糖杆菌的蛋白溶液混合；于-40℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将(2)⑦中得到的两组混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(3)聚类分析：

采用Expander4.0对步骤(2)⑧中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(4)过程分析

将步骤(3)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现混菌进化培养在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。

实施例3

一种检测维生素C工业混菌传代不同代数蛋白质变化的方法，包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的200μL保藏于体积浓度为30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和200μL保藏于体积浓度为30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，35℃，培养48小时；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在35℃，280r/min摇床振荡培养48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10¹¹CFU/mL，在35℃，280r/min摇床振荡培养，以48h为传代周期，以体积比为10％为传代比接入新的种子培养基中，传代150天，选定4个取样时间取4个样，分别为0天、50天、100天、150天；

③分纯：

将步骤(1)②获得的4个样的混菌细胞划线分纯，再分别接种于固体培养基上，35℃培养48h；再分别转入种子培养基，在35℃，280rpm摇床振荡培养48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为30％的甘油水溶液中；

④不同进化时期巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌培养：

将步骤(1)③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10¹⁰CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10¹¹CFU/mL，在35℃，280r/min摇床振荡培养15h；

(2)细胞内蛋白质的测定：

①细胞收集及淬灭：

分别将步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养物和氧化葡糖杆菌培养物，在4℃下，以6000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞；

②提取细胞内蛋白：

取所述破碎细胞，每份100mg分别置于离心管中，每管加入1mL细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎50s；加入15μL质量比为4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应30min；加入15μL 120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置3h；15000rpm离心40min；取上清，得到蛋白溶液；

所述细胞裂解液为：8mol·L^-1尿素，质量浓度为4％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤(2)②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取含100μg蛋白的步骤(2)②获得的各个蛋白溶液，每份加入6倍体积的-40℃的丙酮，在-40℃的条件下放置20h；离心，弃上清，沉淀用-40℃的体积浓度为85％的丙酮水溶液洗涤；干燥得到蛋白干粉；

⑤蛋白还原以及酶解

分别向各个蛋白干粉中，添加40μL 60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；再加入4μL三(2-羧乙基)膦，在60℃还原反应1.5h，再加入2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应15min，终止还原反应；再加入30μL浓度为0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液，37℃蛋白酶解18小时，得酶解液；

⑥蛋白标记

向步骤(2)⑤获得的各个酶解液中分别加入一管用80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1.5h；

⑦溶液混合

将步骤(2)⑥标记后的各个来自巨大芽孢杆菌的蛋白溶液混合；将步骤(2)⑥标记后的各个来自氧化葡糖杆菌的蛋白溶液混合；于-40℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将(2)⑦中得到的两组混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(3)聚类分析：

采用Expander4.0对步骤(2)⑧中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(4)过程分析

将步骤(3)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现混菌进化培养在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。

实验证明，实施例2和实施例3与实施例1的结果类似。

本发明所采用的固体培养基、种子培养基的组成选自中国专利申请号为201110314740.9公开的培养基，例如：

固体培养基：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，琼脂20g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.2g，CaCO₃ 1g，加水至1L，调pH＝6.8，121℃灭菌20min，制成固体培养基。

种子培养基：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.2g，CaCO₃ 1g，加水至1L，调pH＝6.8，121℃灭菌20min，制成种子培养基。

本发明所采用的菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC No 1.1483和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1.110只用于说明本发明，但并不用于限定本发明，实验证明，巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌的其它菌株也可以用于本发明。

Claims (1)

1.一种检测维生素C工业混菌传代不同代数蛋白质变化的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)混菌传代培养：

①固体培养：

取存于液氮的10-200μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-200μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48小时；

②种子培养：

将经步骤(1)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养24h-48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，以24h-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天，选定3-4个取样时间取3-4个样；

③分纯：

将步骤(1)②获得的3-4个样的混菌细胞划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24h-48h；再分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280rpm摇床振荡培养24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中；

④不同进化时期巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌培养：

将步骤(1)③获得的进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌分别接种到种子培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养10-15h；

(2)细胞内蛋白质的测定：

①细胞收集及淬灭：

分别将步骤(1)④获得的巨大芽孢杆菌培养物和氧化葡糖杆菌培养物，在4℃下，以4000～6000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞；

②提取细胞内蛋白：

取所述破碎细胞，每份80～100mg分别置于离心管中，每管加入0.5～1mL细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20～50s；加入5～15μL质量比为2～4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10～30min；加入5～15μL 80～120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1～3h；15000rpm离心25～40min；取上清，得到蛋白溶液；

所述细胞裂解液为：8mol·L^-1尿素，质量浓度为4％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤(2)②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取含50～100μg蛋白的步骤(2)②获得的各个蛋白溶液，每份加入4～6倍体积的-20℃～-40℃的丙酮，在-20℃～-40℃的条件下放置12～20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃～-40℃的体积浓度为70％-85％的丙酮水溶液洗涤；干燥得到蛋白干粉；

⑤蛋白还原以及酶解

分别向各个蛋白干粉中，添加20～40μL 40～60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；再加入1～4μL三(2-羧乙基)膦，在50～60℃还原反应1-1.5h，再加入1～2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10～15min，终止还原反应；再加入20～30μL浓度为0.2～0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液，37℃蛋白酶解12～18小时，得酶解液；

⑥蛋白标记

向步骤(2)⑤获得的各个酶解液中分别加入一管用60～80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1-1.5h；

⑦溶液混合

将步骤(2)⑥标记后的各个来自巨大芽孢杆菌的蛋白溶液混合；将步骤(2)⑥标记后的各个来自氧化葡糖杆菌的蛋白溶液混合；于-40℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将(2)⑦中得到的两组混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(3)聚类分析：

采用Expander4.0对步骤(2)⑧中得到的数据进行标准化后，进行K-means聚类，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(4)过程分析

将步骤(3)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现混菌进化培养在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。

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